高蛋白飲食及大量蛋白尿?qū)β阅I功能衰竭大鼠的加重?fù)p害作用

1、    高蛋白飲食及大量蛋白尿?qū)β阅I功能衰竭大鼠的加重?fù)p害作用            作者：何立群，李均，李屹時(shí)間：2007-11-23 9:18:00                     【摘要】  觀察高蛋白飲食及大量蛋

2、白尿?qū)β阅I功能衰竭（chronic renal failure， CRF）大鼠的加重?fù)p害作用。方法:通過(guò)先用5/6腎切除大鼠法制作CRF動(dòng)物模型，成功后再分別給予5/6腎切除大鼠不同蛋白飲食喂養(yǎng)2個(gè)月，制作有大量蛋白尿的CRF動(dòng)物模型。生化檢測(cè)不同蛋白飲食喂養(yǎng)的5/6腎切除大鼠血尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）、血清肌酐（serum creatinine， Scr）和24 h尿蛋白定量;放免檢測(cè)血內(nèi)皮素-1（endothelin-1， ET-1）、血栓素B2（thromboxane B2， TXB2）、6-酮-前列腺素Fl（6 ketone prostaglandi

3、n Fl， 6-Keto-PGFl）;分光光度計(jì)比色法檢測(cè)血和腎組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）水平。結(jié)果:高蛋白飲食及大量蛋白尿可通過(guò)加重CRF大鼠的血液動(dòng)力學(xué)異常，升高TXB2和ET-1，降低血 6-keto -PGFl;減弱大鼠血SOD和GSH-Px的活性，加速腎損害。結(jié)論:高蛋白飲食可通過(guò)導(dǎo)致5/6腎切除大鼠大量蛋白尿，影響腎臟血管活性物質(zhì)表達(dá)，降低5/6腎切除大鼠抗氧化能力而加速CRF的進(jìn)展。 【關(guān)鍵詞】

4、60; 腎功能衰竭， 慢性蛋白尿既是各種慢性腎臟病的主要臨床癥狀，又是慢性腎臟病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。已有研究表明，沒(méi)有蛋白尿的腎小球腎炎，腎功能極少發(fā)生進(jìn)行性衰退，大量蛋白尿?qū)δI臟具有直接損傷作用，可以使原有的腎小球損害逐漸加重，促使腎小球硬化的發(fā)生1。因此，研究高蛋白飲食及大量蛋白尿加重慢性腎功能衰竭（chronic renal failure， CRF）進(jìn)展的作用，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。本研究通過(guò)給予5/6腎切除大鼠高蛋白飲食，觀察高蛋白飲食及大量蛋白尿?qū)RF大鼠的加重?fù)p害作用。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模 成年雄性SD大鼠40只， 68 周齡，體質(zhì)量160190 g，由上

5、海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。大鼠在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心分籠飼養(yǎng)，于12 h光照、45%左右相對(duì)濕度的普通設(shè)施中自由飲食。大鼠適應(yīng)1周后，隨機(jī)抽取 7只 作為正常對(duì)照組，其余33只為造模組，正常對(duì)照組給予自由進(jìn)食及飲水。CRF模型制作參照文獻(xiàn)2進(jìn)行，造模組先以苯巴比妥（100 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，然后以乙醚誘導(dǎo)麻醉，使大鼠仰臥，后肢交叉固定于手術(shù)臺(tái)上以暴露背部左腎區(qū)，從距左脊肋骨1.5 cm處作斜向外方切口。經(jīng)后腹膜取腎臟，暴露皮質(zhì)部分并以剪刀切除，用明膠海綿壓迫止血片刻，再滴加數(shù)滴纖維蛋白原溶液或凝血酶溶液，稍等片刻，當(dāng)切面上不再有活動(dòng)性出血后復(fù)位剩余左腎，縫合，1周后切除整個(gè)

6、右腎，2次手術(shù)共切除腎臟約80%左右。2周后在大鼠尾靜脈采血測(cè)定血肌酐（serum creatinine Scr），造模組大鼠血肌酐明顯高于正常對(duì)照組為造模成功，共有27只造模成功。再根據(jù)造模組大鼠的血肌酐值將其分為模型組、中蛋白組和高蛋白組，每組9只，各組間血肌酐差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05）。模型組給予普通飼料喂養(yǎng);中蛋白組給予普通飼料+20%的蛋白喂養(yǎng);高蛋白組給予普通飼料+40%的蛋白喂養(yǎng)，各組均自由進(jìn)食及飲水，共喂養(yǎng)2月。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，模型組死亡1只，中蛋白組和高蛋白組均死亡2只。1.2 觀察指標(biāo) 提前1周開(kāi)始收集各組大鼠的蛋白尿檢測(cè)24 h尿蛋白定量，常規(guī)檢測(cè)血尿素氮（bl

7、ood urea nitrogen， BUN）和Scr。采用放射免疫法于曙光醫(yī)院同位素室檢測(cè)血內(nèi)皮素-1（endothe-lin-1， ET-1）、血栓素B2（thromboxan B2， TXB2）和6-酮-前列腺素Fl（6 ketone prostaglandin Fl， 6-Keto-PGFl）。采用分光光度計(jì)比色法檢測(cè)血和腎組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）和谷胱甘 肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）含量（每克腎組織加入2 ml蒸餾水中）。1.3 腎組織勻

8、漿制備 取下大鼠殘腎組織即刻制成10%的組織勻漿，標(biāo)本測(cè)定過(guò)程均嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用 x ± s 表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用ANOVA過(guò)程進(jìn)行多樣本兩兩比較的 q 檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 腎功能及蛋白尿變化 不同蛋白飼料喂養(yǎng) 2個(gè) 月后，各造模組BUN均明顯高于正常對(duì)照組（ P <0.05），各造模組之間隨著蛋白飲食的增加，BUN雖然有上升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各造模組血肌酐和蛋白尿值均明顯高于正常對(duì)照組 （ P < 0.01），高蛋白組的血肌酐及24 h蛋白定量均明顯高于模型組和中蛋白組（ P <0.05或 P &

9、lt; 0.01 ），模型組及中蛋白組24 h蛋白定量約為正常大鼠的10倍，而高蛋白組24 h蛋白定量約為正常大鼠的20倍，說(shuō)明給予5/6腎切除大鼠高蛋白飲食，會(huì)使其24 h蛋白定量及血肌酐明顯升高，從而建立有大量蛋白尿的CRF動(dòng)物模型。見(jiàn)表1。2.2 血管活性物質(zhì)變化 模型組、中蛋白組及高蛋白組的血ET-1和TXB2均明顯高于正常對(duì)照組（ P < 0.01），6-Keto-PGF l明顯低于正常對(duì)照組（ P < 0.01）;各造模組間血ET-1有上升趨勢(shì)，而 6-Keto -PGF l有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而高蛋白組的血TXB2則明顯高于模型組及中蛋白組（ P <

10、0.05），提示CRF大鼠存在血管活性物質(zhì)異常，且以TXB2異常更為明顯，大量蛋白尿可通過(guò)升高CRF大鼠的血TXB2從而加重腎功能衰竭。見(jiàn)表2。2.3 血氧化指標(biāo)變化 各造模組血SOD和GSH-Px值明顯低于正常對(duì)照組（ P <0.05， P <0.01）;隨著蛋白飲食的增加，SOD和GSH-Px值下降，以高蛋白組最明顯，高蛋白組SOD和GSH-Px值明顯低于模型組（ P <0.05）。各造模組血MDA明顯高于正常對(duì)照組（ P <0.01），隨著蛋白飲食的增加，血MDA逐漸增加，以高蛋白組為甚，說(shuō)明不同蛋白飲食喂養(yǎng)的CRF大鼠血氧化與抗氧化指標(biāo)存在異常，以高蛋白組最嚴(yán)重

11、，推測(cè)高蛋白飲食可明顯降低CRF大鼠的SOD和GSH-Px，增加血MDA，加重CRF。見(jiàn)表3。2.4 組織氧化指標(biāo)變化 正常對(duì)照組大鼠腎組織的SOD和GSH-Px均明顯高于各造模組（ P < 0.05， P <0.01），隨著蛋白飲食的增加腎組織MDA有上升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中蛋白組腎組織SOD明顯低于模型組（ P <0.05）。 GSH-Px隨蛋白飲食的增加無(wú)明顯變化。見(jiàn)表4。表1 不同蛋白飲食對(duì)CRF大鼠腎功能及蛋白尿的影響（略）Table 1 Effects of protein diet on renal function and proteinuria in

12、 CRF rats*P <0.05，*P <0.01， vs high-protein diet group;P <0.01， vs normal control group.表2 不同蛋白飲食對(duì)CRF大鼠血管活性物質(zhì)的影響（略）Table 2 Effects of protein diet on vasoactive substances in CRF rats*P <0.05， vs high-protein diet group;P <0.05，P <0.01， vs normal control group.表3 不同蛋白飲食對(duì)CRF大鼠血氧化指標(biāo)的

13、影響（略）Table 3 Effects of protein diet on oxidation indexes of blood in CRF rats*P <0.05， vs high-protein diet group;P <0.05，P <0.01， vs normal control group.表4 不同蛋白飲食對(duì)CRF大鼠腎組織氧化指標(biāo)的影響（略）Table 4 Effects of protein diet on oxidation indexes of renal tissue in CRF rats*P <0.05， vs untreated g

14、roup;P <0.05，P <0.01， vs normal control group.3 討論 蛋白尿?qū)δI小球的直接損害，是由于通過(guò)腎小球毛細(xì)血管的蛋白導(dǎo)致腎小球系膜擴(kuò)張，而引起腎 小球?yàn)V過(guò)面積和濾過(guò)率下降。大量蛋白尿?qū)δI小球上皮細(xì)胞及系膜細(xì)胞的內(nèi)在毒性作用表現(xiàn)在腎小球超濾液中大量蛋白尿可引起上皮細(xì)胞的形態(tài)改變，如足突融合和消失，繼而出現(xiàn)持續(xù)    性結(jié)構(gòu)和功能改變，包括腎小球的變性、壞死和上皮細(xì)胞從基底膜分離，腎小球硬化，且蛋白尿的大量漏出，使近端小管細(xì)胞蛋白負(fù)荷過(guò)重，小管細(xì)胞膨脹、破裂而釋放出溶酶體酶導(dǎo)致小管間質(zhì)損害及纖維化，導(dǎo)致C

15、RF3。進(jìn)一步研究顯示，過(guò)量的蛋白在腎小管上皮細(xì)胞的沉積可刺激某些生長(zhǎng)因子如血小板源生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor， PDGF）以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子可引起腎小管上皮細(xì)胞的活化、大量膠原的產(chǎn)生和間質(zhì)細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致間質(zhì)纖維化和CRF的出現(xiàn)4。可見(jiàn)，高蛋白飲食及大量蛋白尿可直接損害腎小球和腎小管而加重腎損害。已知ET是一種具有很強(qiáng)的含21個(gè)氨基酸、分子量為2 492 D的血管收縮小分子活性肽。在CRF大鼠及患者血、尿及腎組織局部ET-1含量增高，可加重腎臟損害:（1）ET對(duì)血管有強(qiáng)大的收縮作用，而腎血管對(duì)ET的反應(yīng)尤為敏感。ET對(duì)腎小球

16、出球動(dòng)脈的收縮作用強(qiáng)于入球動(dòng)脈，從而使腎小球毛細(xì)血管內(nèi)壓升高，還可收縮腎小球系膜細(xì)胞使腎小球?yàn)V過(guò)面積和超濾系數(shù)減少，并可劑量依賴性地減少腎血流量，降低腎小球?yàn)V過(guò)率5;（2）ET-1促進(jìn)血管平滑肌及腎髓質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞增殖及間質(zhì)纖維化，直接或間接刺激醛固酮分泌，影響腎素活性及促炎癥作用6。血栓素A2（thromboxane A2， TXA2）和前列環(huán)素I2（prostacyclin I2， PGI2）均系花生四烯酸的代謝產(chǎn)物。正常時(shí)保持動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)維持血小板功能、保護(hù)血管和防止血栓形成具有重要意義，因而PGI2與TXA2是調(diào)節(jié)血小板及血管壁機(jī)能狀態(tài)的兩個(gè)生物學(xué)對(duì)立面。PGI2可拮抗內(nèi)皮素所引起的腎血管

17、收縮，有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。血管損傷可引起TXA2等致炎因子釋放，這些炎癥介質(zhì)大多能刺激ET的合成和分泌，而ET又可促進(jìn)TXA2、白細(xì)胞介素6 （interleukin -6， IL-6）等炎癥介質(zhì)的生成7，8。TXB2和6-Keto-PGF1為T(mén)XA2和PGI2的終末代謝產(chǎn)物，可反映TXA2和PGI2兩者水平。若TXA2增多和（或）PGI2減少，TXA2/PGI2比值升高，可導(dǎo)致血小板活化增強(qiáng)和血管收縮，促進(jìn)血栓形成和血管損傷9，10。本研究中各造模組大鼠的血ET-1以及模型組、高蛋白組的TXB2明顯高于正常對(duì)照組，而造模組的6-Keto-PGF1明顯低于正常對(duì)照組，且隨著蛋白飲食的增加模型大鼠

18、血ET-1有上升趨勢(shì)，而6-Keto-PGF1則有下降趨勢(shì)，TXB2在高蛋白組上升更明顯，明顯高于模型組及中蛋白組，表明CRF各造模組大鼠均存在血管活性物質(zhì)的異常，而高蛋白飲食使腎 臟血管活性物質(zhì)異常表達(dá)更明顯?？梢?jiàn)高蛋白飲食可通過(guò)加重CRF大鼠血管活性物質(zhì)異常表達(dá)，而加速腎臟的病理進(jìn)程。在正常情況下腎組織內(nèi)大約1%2%的氧發(fā)生單電子轉(zhuǎn)移形成自由基，因腎組織內(nèi)含有豐富的SOD、過(guò)氧化氫酶、GSH-Px及其他抗氧化物質(zhì)，產(chǎn)生的自由基很快被清除。因此腎組織內(nèi)抗氧化能力與不斷產(chǎn)生自由基的氧化能力之間保持著動(dòng)態(tài)平衡，不引起腎組織損傷11。本研究結(jié)果表明，各造模組血SOD、GSH-Px值明顯低于正常對(duì)照

19、組（ P <0.05， P <0.01），隨著蛋白飲食的增加，SOD和GSH-Px值下降，以高蛋白組最明顯。高蛋白組SOD和GSH-Px值明顯低于模型組（ P <0.05）。各造模組血MDA明顯高于正常對(duì)照組（ P <0.01），隨著蛋白飲食的增加，血MDA逐漸增加，以高蛋白組為重，說(shuō)明不同蛋白飲食喂養(yǎng)的CRF大鼠血存在氧化與抗氧化能力動(dòng)態(tài)平衡異常，以高蛋白組最嚴(yán)重。但組織的變化不明顯，正常對(duì)照組大鼠腎組織的SOD和GSH-Px均明顯高于各造模組（ P <0.05， P <0.01），隨著蛋白的增加腎組織MDA有上升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造成這一現(xiàn)象的原

20、因可能與各造模組大鼠組織氧化物質(zhì)變化首先表現(xiàn)于血液，隨著病程的進(jìn)展，組織病變?nèi)找鎳?yán)重，因此增加實(shí)驗(yàn)周期可能有助于檢測(cè)組織氧化物質(zhì)的變化。上述情況說(shuō)明不同蛋白飲食喂養(yǎng)的CRF大鼠存在氧化和抗氧化系統(tǒng)的異常，導(dǎo)致氧自由基的產(chǎn)生增多，已知后者可進(jìn)一步通過(guò)以下途徑損傷腎臟:（1）氧自由基可直接損傷腎小球內(nèi)皮、上皮及系膜細(xì)胞，造成內(nèi)皮細(xì)胞脫落，上皮細(xì)胞空泡變性，足突融合，基底膜（glomerular base-ment membrane， GBM）暴露，系膜基質(zhì)溶解，系膜基質(zhì)代償增多;（2）由于上述病變，改變腎小球毛細(xì)血管和GBM的通透性及腎小球內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)，造成大量持續(xù)性蛋白尿，反之這些蛋白尿加重系膜

21、細(xì)胞及腎小球的損傷;（3）轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和PDGF等多種細(xì)胞因子在CRF時(shí)產(chǎn)生增多，通過(guò)ROS進(jìn)一步損傷腎組織12，13;（4）脂質(zhì)過(guò)氧化物使纖維母細(xì)胞對(duì)膠原基因的表達(dá)增加，促進(jìn)膠原在系膜區(qū)沉積，加重腎間質(zhì)纖維化，使腎組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)改變，腎功能進(jìn)行性損害14?？梢?jiàn)，高蛋白飲食及大量蛋白尿既可直接損害腎臟，又可間接通過(guò)影響腎臟的血管活性物質(zhì)分泌、減弱機(jī)體的抗氧化能力而加速腎臟病的惡化。因此，臨床上CRF患者采取低蛋白飲食是非常必要的?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Cheng XM， Xu QH， Wang M， et al. Modern chronic renal failure acology.

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