蛋白質(zhì)藥品冷凍干燥技術(shù)研究進(jìn)展1引言由于凍干藥品呈多孔狀能長

1、蛋白質(zhì)藥品冷凍枯燥技術(shù)研究進(jìn)展 1 引言 由于凍干藥品呈多孔狀、能長時間穩(wěn)定貯存、 并易重新復(fù)水而恢復(fù)活性， 因此冷凍枯燥技術(shù)廣泛應(yīng)用于制備固體蛋白質(zhì)藥物、 口服速溶藥 物及藥物包埋劑脂質(zhì)體等藥品。 從國家藥品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)庫得知， 目前國內(nèi)已有注射用重 組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、注射用重組人干擾素a 2b凍干鼠表皮生長因子、外用凍干重組人表皮生長因子、注射用重組鏈激酶、注射用重組人白介素-2、注射用重組人生長激素、注射用A群鏈球菌、注射用重組人干擾素a 2b凍干人凝血因子 V川、凍干人纖維蛋白原、間苯三酚口服凍干片等凍干藥品獲準(zhǔn)上市。截止 2000 年 2 月，美國 FDA 已批準(zhǔn)的

2、生物技術(shù)藥共計 76 個。 冷凍枯燥技術(shù)最早于 1813 年由英國人 Wollaston 創(chuàng)造。 1909 年 Shsckell 試驗用該方法對抗毒素、菌種、狂犬病毒及其它生物制品進(jìn)行凍干保存，取得 了較好效果。 在第二次世界大戰(zhàn)中， 對血液制品的大量需求大大刺激了冷凍枯燥技術(shù)的開展， 從此該技術(shù)進(jìn)入了工業(yè)應(yīng)用階段。 此后，制冷和真空設(shè)備的飛速開展為快速開展冷凍枯燥技 術(shù)提供了強(qiáng)有力的物質(zhì)條件。 進(jìn)入上個世紀(jì)的八九十年代， 科學(xué)技術(shù)的迅猛開展和人民群眾 對健康保障的需求為藥品冷凍枯燥技術(shù)的飛速開展提供了強(qiáng)大的動力， 在藥品凍干損傷和保 護(hù)機(jī)理、 藥品凍干工藝、 藥品冷凍枯燥機(jī)等方面取得了巨大的

3、成績。但藥品冷凍枯燥技術(shù)是一門邊緣學(xué)科，需要生物學(xué)、藥學(xué)、制冷、真空和控制等知識的交叉和綜合，因此仍存在亟 待解決的問題。 2 藥品冷凍枯燥原理及特點藥品冷凍枯燥是指把藥品溶液在低溫下凍結(jié)， 然后在真空條件下升華枯燥， 除去冰晶，待升華結(jié)束后再進(jìn)行解吸枯燥，除去局部結(jié) 合水的枯燥方法。該過程主要可分為：藥品準(zhǔn)備、預(yù)凍、一次枯燥(升華枯燥)和二次枯燥 (解吸枯燥) 、密封保存等五個步驟。藥品按上述方法凍干后，可在室溫下避光長期貯存， 需要使用時， 加蒸餾水或生理鹽水制成懸浮液， 即可恢復(fù)到凍干前的狀態(tài)。 與其它枯燥方法 相比，藥品冷凍枯燥法具有非常突出的優(yōu)點和特點：a) 藥液在凍結(jié)前分裝， 劑量

4、準(zhǔn)確；b) 在低溫下枯燥，能使被枯燥藥品中的熱敏物質(zhì)保存下來；c) 在低壓下枯燥，被干燥藥品不易氧化變質(zhì)， 同時能因缺氧而滅菌或抑制某些細(xì)菌的活力；d) 凍結(jié)時被枯燥藥品可形成 "骨架 "，枯燥后能保持原形，形成多孔結(jié)構(gòu)而且顏色根本不變；e) 復(fù)水性好，凍干藥品可迅速吸水復(fù)原成凍干前的狀態(tài)；f) 脫水徹底，適合長途運(yùn)輸和長期保存。 雖然藥品冷凍枯燥具有上述優(yōu)點，但是枯燥速率低、枯燥時間長、枯燥過程能耗 高和枯燥設(shè)備投資大等仍是該技術(shù)的突出缺點。3 藥品凍干損傷和保護(hù)機(jī)理藥品冷凍枯燥是一個多步驟過程， 會產(chǎn)生多種應(yīng)力使藥品變性， 如低溫應(yīng)力、 凍結(jié)應(yīng)力和枯燥應(yīng)力。 其中凍結(jié)應(yīng)

5、力又可分為枝狀冰晶的形成，離子濃度的增加， PH 值的改變和相別離等情況。 因此， 為了保護(hù)藥品的活性， 通常在藥品配方中添加活性物質(zhì)的保護(hù)劑。 它需要具備四個特 性：玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高、吸水性差、結(jié)晶率低和不含復(fù)原基。常用的保護(hù)劑有如下幾類物質(zhì)： a) 糖類/多元醇： 蔗糖、 海藻糖、 甘露醇、 乳糖、 葡萄糖、 麥芽糖等； b) 聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等；C)無水溶劑：乙烯乙二醇、甘油、DMSO 、 DMF 等； d) 外表活性劑： Tween 80 等； e) 氨基酸： L- 絲氨酸、谷氨 酸鈉、 丙氨酸、 甘氨酸、 肌氨酸等；f) 鹽和胺： 磷酸鹽、 醋酸鹽、 檸

6、檬酸鹽等；由于冷凍枯燥過程存在多種應(yīng)力損傷， 因此保護(hù)劑保護(hù)藥品活性的機(jī)理也是不同的， 可以分為 低溫保護(hù)和凍干保護(hù)。 對于低溫保護(hù)，目前被廣為接受的液體狀態(tài)下蛋白質(zhì)穩(wěn)定的機(jī)理 之一是優(yōu)先作用原理。 優(yōu)先作用是指蛋白質(zhì)優(yōu)先與水或水溶液中的保護(hù)劑作用。 在有起穩(wěn)定 作用的保護(hù)劑存在的條件下，蛋白質(zhì)優(yōu)先與水作用(優(yōu)先水合) ，而保護(hù)劑優(yōu)先被排斥在蛋白質(zhì)區(qū)域外(優(yōu)先排斥) 。在這種情況下，蛋白質(zhì)外表就比其內(nèi)部有較多的水分子和較少的保護(hù)劑分子。優(yōu)先作用原理同樣適用于冷凍 質(zhì)外表排斥， 在凍結(jié)過程中能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)。 白質(zhì)自身在高濃度時保護(hù)蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。 優(yōu)先作用機(jī)理不再適用。 對于凍干保護(hù)機(jī)理，-融解過

7、程。蛋白質(zhì)保護(hù)劑，在溶液中被從蛋白 但是優(yōu)先作用機(jī)理不能完全解釋用聚合物或蛋 在凍干過程中， 由于蛋白質(zhì)的水合層被除去， 仍在研究探討之中， 目前主要有兩種： a)水替代假說。 許多研究者認(rèn)為由于蛋白質(zhì)分子中存在大量氫鍵， 結(jié)合水通過氫鍵與蛋白質(zhì)分 子聯(lián)結(jié)。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在冷凍枯燥過程中失去水分后， 保護(hù)劑的羥基能替代蛋白質(zhì)外表的水的羥 基，使蛋白質(zhì)外表形成一層假定的水化膜， 這樣可保護(hù)氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周圍環(huán) 境中， 穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)， 防止蛋白質(zhì)因凍干而變性， 使其即使在低溫冷凍和枯燥失水 的情況下， 仍保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性。 b 玻璃態(tài)假說。研究者認(rèn)為在含保護(hù) 劑溶液的枯

8、燥過程中，當(dāng)濃度足夠大且保護(hù)劑的結(jié)晶不會發(fā)生時，保護(hù)劑- 水混合物就會玻璃化。研究發(fā)現(xiàn)在玻璃態(tài)下，物質(zhì)兼有固體和流體的行為，粘度極高，不容易形成結(jié)晶，且 分子擴(kuò)散系數(shù)很低， 因而具有粘性的保護(hù)劑包圍在蛋白質(zhì)分子的周圍， 形成一種在結(jié)構(gòu)上與 玻璃狀的冰相似的碳水化合物玻璃體， 使大分子物質(zhì)的鏈鍛運(yùn)動受阻， 阻止蛋白質(zhì)的伸展和 沉淀，維持蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而起到保護(hù)作用。 目前大局部學(xué)者贊同 " 水替代假說 "，因為可以通過實驗檢測到蛋白質(zhì)和保護(hù)劑之間的氫鍵，為理論提供證據(jù)。事 實上，無論是 "水替代假說 "還是 "玻璃態(tài)假說 "

9、;，它們的根底都是基于藥液實現(xiàn)了局部或全部 玻璃化凍結(jié)。 4 凍干工藝及優(yōu)化 由于藥品冷凍枯燥過程會產(chǎn)生多種應(yīng)力，對凍干藥 品的藥性有很大的影響， 因此對藥品冷凍枯燥過程進(jìn)行合理設(shè)計， 對于減少凍干損傷和提高 凍干藥品的質(zhì)量有重大的意義。 4.1 凍結(jié)研究 冷凍枯燥過程中的凍結(jié)過程非常重要， 因為在凍結(jié)中形成的冰晶形態(tài)和大小以及玻璃化程度不僅影響后繼的枯燥速率， 而且影響凍 干藥品的質(zhì)量。 因此在凍結(jié)過程中必須考慮配方、 凍結(jié)速率、 凍結(jié)方式、以及是否退火等問 題。 4.1.1 配方的影響 配方中的固體含量會影響凍結(jié)和枯燥過程。如果固體含量少于 2%，那么凍干藥品結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能就會不穩(wěn)定。尤其

10、在枯燥過程中，藥品微粒不能粘在基 質(zhì)上，逸出的水蒸氣會把這些微粒帶到小瓶的塞子上， 有時甚至?xí)У秸婵帐耶?dāng)中。 此 外，為了獲得均勻一致、外表光滑、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥品，配方中必須含有填充劑、賦形劑、 穩(wěn)定劑等保護(hù)劑， 這些保護(hù)劑對實現(xiàn)藥品的玻璃化凍結(jié)有重大的影響。 很多糖類或多元醇經(jīng) 常被用于溶液凍融和凍干過程中非特定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑， 它們既是有效的低溫保護(hù)劑又是很 好的凍干保護(hù)劑，它們對凍結(jié)的影響取決于種類和濃度。文獻(xiàn)1623對不同的保護(hù)劑進(jìn)行了詳盡的研究，探討了它們的凍結(jié)特性。文獻(xiàn)4還研究了其它保護(hù)劑的凍結(jié)特性。但是蛋白質(zhì)種類很多， 而且物理化學(xué)性質(zhì)各異， 因此不同的蛋白質(zhì)需要不同的保護(hù)劑配

11、方， 因此它 們的凍結(jié)特性就不同，一般需要實驗。 4.1.2 凍結(jié)方式 凍結(jié)方式不同，產(chǎn)生的冰晶的 形態(tài)和大小就不同， 而且會影響后繼的枯燥速率和凍干藥品質(zhì)量。 根據(jù)凍結(jié)機(jī)理， 可以把凍 結(jié)分為全域過冷結(jié)晶和定向結(jié)晶兩類。全域過冷結(jié)晶是指全部藥液處于相同或相近的過冷度下進(jìn)行凍結(jié)的方式。在全域過冷結(jié)晶中，凍結(jié)速率和冰晶成核溫度是重要的參數(shù)。 全域過冷結(jié)晶按凍結(jié)速率的快慢可分為慢速凍結(jié)和快速凍結(jié)。快速凍結(jié)的冰晶細(xì)小， 而且沒有凍結(jié)濃縮現(xiàn)象，但是存在不完全凍結(jié)現(xiàn)象。 相反，慢速冷卻產(chǎn)生較大的冰晶，并且存在凍 結(jié)濃縮的現(xiàn)象。 Thomas W Patapoff 等人發(fā)現(xiàn)如果把藥品直接浸入液氮或干冰-乙

12、醇溶液槽中快速凍結(jié) ，那么晶核首先在瓶壁產(chǎn)生，然后冰晶向中心擴(kuò)散，再垂直向上擴(kuò)散。由于 長成的冰晶細(xì)小，而且有水平方向的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致枯燥階段的傳質(zhì)阻力很大，升華速率降低。 實驗證明， 快速凍結(jié)導(dǎo)致升華速率低， 解吸速率快， 慢速凍結(jié)導(dǎo)致升華速率快， 解吸速率慢。 James A Searles 等人認(rèn)為冰晶成核溫度是全域過冷結(jié)晶的重要因素，因為它是升華速率的主要決定因素。 他們在研究中發(fā)現(xiàn)， 冰晶成核溫度從本質(zhì)上來說是隨機(jī)的、 不穩(wěn)定的， 不容 易控制， 但是受溶液中的微粒含量和是否存在冰晶成核體等影響因素。正是冰晶成核溫度的隨機(jī)性導(dǎo)致升華枯燥速率的不均勻性以及與形態(tài)相關(guān)的參數(shù)，如凍干藥品外表積

13、和解吸枯燥速率。定向結(jié)晶是指一小局部藥液處于過冷狀態(tài)下進(jìn)行凍結(jié)的方式。Thomas WPatapoff 介紹了一種垂直凍結(jié)方式。溶液用濕冰冷卻，在瓶子底部用干冰冷卻，形成晶核， 然后放到-50 C的擱板上凍結(jié)。用這種方式凍結(jié)的樣品的冰晶在垂直方向呈現(xiàn)煙囪狀，在藥 品外表沒有凍結(jié)濃縮層，而且整個藥品的結(jié)構(gòu)均一性很好，因此在枯燥時的傳質(zhì)阻力很小，加快了凍干速率。 Martin Kramer 等人采用了另外一種方式實現(xiàn)了定向凍結(jié)。他們在真空室 壓力為O.lkPa，擱板溫度為+10 C的條件下，讓溶液開始外表凍結(jié)，形成13mm左右的冰晶薄層。 然后解除真空， 降低擱板溫度到結(jié)晶溫度以下進(jìn)行凍結(jié)。 在這

14、種條件下長成的冰 晶粗大，也呈煙囪狀。同時在枯燥階段發(fā)現(xiàn)，升華枯燥時間比采用一般凍結(jié)的時間節(jié)省了 20% 。分析凍干藥品時還發(fā)現(xiàn)， 對甘露醇， 采用這種方式凍結(jié)的凍干品的剩余含水量比采用 一般凍結(jié)的要多；但對蔗糖和甘氨酸，兩者差異不大。 H Schoof 等人在凍干膠原質(zhì)時也采 用了定向結(jié)晶的方式。凍結(jié)方式不同，產(chǎn)生的冰晶形態(tài)和大小就不同，后繼的枯燥速率也不同。 實驗證明， 采用定向結(jié)晶方式的凍結(jié)藥品的枯燥速率比全域過冷結(jié)晶的快。 但是 無論采用哪種凍結(jié)方式， 藥品溶液必須局部或全部實現(xiàn)玻璃化凍結(jié)，以保護(hù)藥品藥性。 退火 退火是指把凍結(jié)藥品溫度升到共熔溫度以下，保溫一段時間，然后再降低溫度到

15、凍結(jié)溫度的過程。在升華枯燥之前增加退火步驟，至少有三個原因：a 強(qiáng)化結(jié)晶。在凍結(jié)過程特別是快速凍結(jié)過程中， 配方中結(jié)晶成分往往來不及完全結(jié)晶。 但是如果該成分能 為凍干藥品結(jié)構(gòu)提供必要的支撐或者蛋白質(zhì)在該成分完全結(jié)晶后會更穩(wěn)定，那么就有必要完全結(jié)晶。此外， 凍結(jié)濃縮液中也會有一局部水來不及析出，使其達(dá)不到最大濃縮狀態(tài)。實驗證明，當(dāng)退火的溫度高于配方的最大濃縮液玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg'時，會促進(jìn)再結(jié)晶的形成使結(jié)晶成分和未凍結(jié)水結(jié)晶完全。b提高非晶相的最大濃縮液玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg'。從非晶相中除去Tg'較低的結(jié)晶成分，能夠提高非晶相的 Tg'。Barry J Aldou

16、s在研究非晶態(tài)碳 水化合物的水合物結(jié)晶規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過退火之后的海藻糖枯燥溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度由 31 C上升到79C,大大提高了穩(wěn)定作用。c改變冰晶形態(tài)和大小分布，提高枯燥效率。 James A Searles 等人研究認(rèn)為不同的成核溫度產(chǎn)生不同的冰晶形態(tài)和粒徑大小，繼而 導(dǎo)致升華枯燥的速率的不均勻。 但是一個過程中的枯燥速率是由最慢的枯燥藥品確定的，因此不均勻的枯燥速率會影響藥品的質(zhì)量和生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。 研究證實退火過程中的相行為和重 結(jié)晶可以減小由于成核溫度差異造成的冰晶尺寸差異及枯燥速率的不均勻性，提高枯燥效率和藥品均勻性。為了到達(dá)退火目的，在退火操作中，必須考慮加熱速率、退火溫度、退火

17、時間等參數(shù)。 但是目前由于實驗手段不夠先進(jìn)和理論知識比擬缺乏， 退火機(jī)理尚有疑問， 退火參數(shù)的選取仍然沒有依據(jù)。 4.2 枯燥 藥品冷凍枯燥的枯燥過程可以分為兩個階 段，一次枯燥和二次枯燥。在一次枯燥階段除去自由水，在二次枯燥階段除去局部結(jié)合水。 枯燥過程占據(jù)了藥品冷凍枯燥過程的大局部能耗， 因此采取有效措施提高枯燥速率顯得非常 有意義。 目前， 大都采取控制擱板和藥品溫度、 冷阱溫度和真空度的做法來實現(xiàn)枯燥速率的 提高。藥品溫度的控制。包括凍結(jié)層和已干層的溫度控制?？刂苾鼋Y(jié)層溫度的原那么是在保證凍結(jié)層不發(fā)生熔化 在低共熔點以下 的前提下， 溫度越高越好。控制已干層溫度的 原那么是在不使物料變

18、性或已干層結(jié)構(gòu)崩塌的前提下、 盡量采用較高的枯燥溫度。 而擱板溫度 的控制是以滿足藥品溫度控制為標(biāo)準(zhǔn)。冷阱溫度。凍干過程中水升華的驅(qū)動力是藥品和冷阱間的溫差。 由于藥品溫度受加熱方式的限制， 同時不能高于共熔溫度， 因此冷阱溫度越 低越好。為了提高經(jīng)濟(jì)性，在升華枯燥過程中應(yīng)至少低于藥品溫度20 C；在解吸枯燥過程中，對于那些要求很低剩余水分的配方，冷阱溫度要求更低。真空度。一般認(rèn)為，壓力對凍干過程有正反兩方面的影響：a 在藥品共熔點溫度和崩塌溫度以下， 升華界面溫度越高，升華水汽越多，所需熱量越大。壓力越高，相應(yīng)提高了已干層導(dǎo)熱系數(shù)，外表對 流作用也越大， 因此升華水汽也越快，即凍干速率越大。

19、b 升華界面通過已干層到外部的水汽逸出速度與界面和外表之間的壓力差， 即界面溫度所對應(yīng)的飽和壓力與枯燥室的真 空度之差相關(guān)。 這個壓差大， 有助于水汽逸出。 這個壓差越小， 逸出越慢， 枯燥速率也越小。 如果冷凍枯燥是傳熱控制過程， 那么枯燥速率隨著枯燥室壓力升高而提高； 如果冷凍枯燥是傳 質(zhì)控制過程，枯燥速率隨著枯燥室壓力升高而降低。經(jīng)驗證明升華階段的真空度在1030Pa 時，既有利于熱量的傳遞，又利于升華的進(jìn)行。假設(shè)壓強(qiáng)過低，那么對傳熱不利，藥品不易獲得熱量，升華速率反而降低，而且對設(shè)備的要求也更高， 增加了本錢。而當(dāng)壓強(qiáng)過 高時， 藥品內(nèi)冰的升華速度減慢，藥品吸收熱量將減少，于是藥品自身

20、的溫度上升，當(dāng)高于共熔點溫度時，藥品將發(fā)生熔化導(dǎo)致凍干失敗。根據(jù)真空度對凍干速率的影響，文獻(xiàn) 40 采 用了循環(huán)壓力法，得到了不錯的效果。 藥品冷凍枯燥過程是一個連續(xù)的操作，不同的 藥品配方， 有不同的凍結(jié)特性， 而且凍干曲線也不同， 因此應(yīng)在根底研究的根底上廣泛開展 個體研究，優(yōu)化凍干曲線，提高枯燥速率，降低能耗。 5 藥品冷凍枯燥機(jī) 藥品冷凍 枯燥機(jī)的分類方法很多， 按其擱板面積可分為大、 中、小三種類型， 通常凍干面積小于 1.5m2 為小型，介于 1.5m2 至 50m2 之間為中型，大于 50m2 為大型；按其目的和用途可分為實 驗型凍干機(jī)、中試型凍干機(jī)和工業(yè)生產(chǎn)型凍干機(jī)。 藥品冷凍

21、枯燥機(jī)主要由枯燥箱、真 空系統(tǒng)、 制冷系統(tǒng)、 冷阱系統(tǒng)、 加熱系統(tǒng)、 加蓋系統(tǒng)、 自動控制系統(tǒng)等幾大局部組成。 此外， 大中型冷凍枯燥機(jī)還常有蒸氣滅菌系統(tǒng) SIP 、在位清洗系統(tǒng) CIP 。 制冷系統(tǒng)分別 為冷凍枯燥箱和冷阱系統(tǒng)提供冷源。目前采用的單級制冷壓縮循環(huán)的板層制冷溫度約在-35 C-40 C之間，冷阱溫度在 -50 C左右；雙級制冷壓縮循環(huán)的板層制冷溫度在-45 C-50 C之間，冷阱溫度在-65 C左右；復(fù)疊式制冷循環(huán)的板層制冷溫度在-55 C-60 C之間，冷阱溫度在-75 C左右。冷凍枯燥機(jī)的控制主要是對制冷機(jī)、真空機(jī)組、加熱功率的起停及溫度的控制，對真空度、溫度的測定、監(jiān)控、以及自動保護(hù)、報警裝置等。采用全自動 控制或微