hIL-24基因通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β Smad通路影響瘢痕疙瘩的生物學特性

1、www.CRTER.org吳志遠，等. hIL-24基因通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子/Smad通路影響瘢痕疙瘩的生物學特性hIL-24基因通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子/Smad通路影響瘢痕疙瘩的生物學特性吳志遠1，史玉倉2，蔣軍健3，吳志賢2，張慧君2，劉艷芳2，劉宏偉1(1暨南大學第一臨床學院，廣東省廣州市 510632；2廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院整形外科，廣東省湛江市 524001；3復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院手外科，上海市 200040)引用本文：吳志遠，史玉倉，蔣軍健，吳志賢，張慧君，劉艷芳，劉宏偉. hIL-24基因通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子/Smad通路影響瘢痕疙瘩的生物學特性J.中國組織工程研究，2016，20(

2、33):4926-4932.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.33.009 ORCID: 0000-0001-6087-1308(吳志遠)文章快速閱讀：hIL-24基因可通過轉(zhuǎn)化生長因子/Smad通路影響瘢痕疙瘩吳志遠，男，1970年生，廣東省湛江市人，漢族，2001年廣東醫(yī)科大學畢業(yè)，碩士，教授，主要從事瘢痕基礎(chǔ)研究。通訊作者：劉宏偉，博士，教授，暨南大學第一臨床學院，廣東省廣州市 510632 中圖分類號:R318文獻標識碼:A文章編號:2095-4344(2016)33-04926-07稿件接受：2016-05-24http:/WWW.crter.or

3、g瘢痕疙瘩瘢痕疙瘩細胞成纖維細胞 文題釋義：瘢痕疙瘩：是繼發(fā)于皮膚損傷如創(chuàng)傷、燒傷或手術(shù)后，以膠原過度沉積于真皮和皮下組織為特征的皮膚膠原性疾病。與增生性瘢痕不同，瘢痕疙瘩超過皮損邊緣呈浸潤性生長， 侵犯臨近組織，無自限性， 易造成功能障礙，有好發(fā)部位，多見于有色人種，不發(fā)生退行性變化，單純手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)，必須輔以電子線照射等綜合治療，有良性真皮腫瘤之稱。hIL-24基因：是研究較明確的抑癌基因，屬于是單拷貝基因，定位于的1q32-41，由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，含有49個氨基酸的信號肽?？杉せ蠲庖邞?yīng)答效應(yīng)，又可發(fā)揮特異性地抑制癌細胞生長作用，抑制癌周新生血管增生。由于其受體在不同組織、

4、細胞中的表達存在差異，從而hIL-24發(fā)揮不同功能。摘要背景：hIL-24基因是研究較明確的腫瘤抑制基因，既可以表達免疫系統(tǒng)刺激蛋白，刺激免疫應(yīng)答效應(yīng)，又能特異性地抑制腫瘤細胞生長，抑制腫瘤血管形成，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。目的：分析hIL-24對瘢痕疙瘩成纖維細胞的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用及機制。方法：經(jīng)臨床及病理確診為瘢痕疙瘩13例，取瘢痕疙瘩組織進行成纖維細胞培養(yǎng)和鑒定。實驗分為對照組(瘢痕疙瘩組織成纖維細胞)和轉(zhuǎn)染hIL-24的瘢痕疙瘩成纖維細胞組。構(gòu)建慢病毒載體(LVTHM)將hIL-24基因轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩組織成纖維細胞，觀察轉(zhuǎn)化生長因子、Smad3、增殖細胞核抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金

5、屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1基因表達情況。結(jié)果與結(jié)論：細胞免疫熒光染色及細胞流式顯示培養(yǎng)的成纖維細胞內(nèi)胞漿波形蛋白抗體呈陽性，純度大于97.8%；定量PCR檢測成纖維細胞hIL-24的過表達效率為81.7%； Western blot檢測轉(zhuǎn)梁的成纖維細胞表達hIL-24明顯增加；定量PCR檢測，對照組轉(zhuǎn)化生長因子、Smad3、增殖細胞核抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9表達明顯高于轉(zhuǎn)染hIL-24的瘢痕疙瘩成纖維細胞組(P < 0.05)，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1表達明顯低于轉(zhuǎn)染hIL-24的瘢痕疙瘩成纖維細胞組；結(jié)果提示，hIL-24抑制成纖維細胞增殖細胞核抗原、基質(zhì)金屬蛋白

6、酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9表達，其作用機制可能是通過轉(zhuǎn)化生長因子/Smad3轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083關(guān)鍵詞：組織構(gòu)建；組織工程；瘢痕疙瘩；hIL-24；TGF-/Smad主題詞：瘢痕疙瘩；基質(zhì)金屬蛋白酶；信號傳導(dǎo)基金資助：湛江市科技攻關(guān)計劃項目(2014B01024)hIL-24 gene influences the biological characteristics of the keloid by regulating transforming growth factor-beta/Smad pathwayWu Zhi-y

7、uan1, Shi Yu-cang2, Jiang Jun-jian3, Wu Zhi-xian2, Zhang Hui-jun2, Liu Yan-fang2, Liu Hong-wei1 (1the First Clinical College of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 2Department of Plastic Surgery, the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001, Gu

8、angdong Province, China; 3Department of Hand Surgery, Huashan Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 200040, China)AbstractBACKGROUND: hIL-24, a tumor suppressor gene, can stimulate immune responses, inhibit the growth of tumor cells, and the formation of tumor vessels, and induce cell ap

9、optosis.OBJECTIVE: To explore the effects of hIL-24 gene on the proliferation and apoptosis of fibroblasts in the keloid and the underlying mechanisms.METHODS: All the keloid specimens collected from 13 patients were used for fibroblast culture and indentification. Fibroblast of the keloid was trans

10、fected with or without hlL-24 lentivirus. Subsequently, mRNA expressions of transforming growth factor-, Smad3, proliferating cell nuclear antigen, matrix metalloproteinase-2, -9, and metallopeptidase inhibitor 1 were determined.RESULTS AND CONCLUSION: Immunofluorescent staining and flow cytometry s

11、howed that vimentin antibody was expressed positively in cytoplasma of fibroblast cultures, and the purity was more than 97.8%. Western blot assay showed that hIL-24 expression was significantly increased in the transfected fibroblasts. Quantitative PCR showed that the overexpression rate of hIL-24

12、in fibroblasts was 81.7% and mRNA expressions of transforming growth factor-, Smad3, proliferating cell nuclear antigen, matrix metalloproteinase-2, and -9 were significantly decreased, while metallopeptidase inhibitor 1 mRNA expression was significantly increased in hIL-24 transfection group compar

13、ed with control group (P < 0.05). These findings suggest that hIL-24 gene inhibits the expressions of proliferating cell nuclear antigen, matrix metalloproteinase-2, and -9 in fibroblasts, and the underlying mechanism may involves TGF-/Smad3 pathway.Subject headings: Keloid; Matrix Metalloprotein

14、ases; Signal TransductionFunding: the Science and Technology Research Fund of Zhanjiang, No. 2014B01024Cite this article: Wu ZY, Shi YC, Jiang JJ, Wu ZX, Zhang HJ, Liu YF, Liu HW. hIL-24 gene influences the biological characteristics of the keloid by regulating transforming growth factor-beta/Smad p

15、athway. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(33):4926-4932.Wu Zhi-yuan, Master, Professor, the First Clinical College of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Liu Hong-wei, M.D., Professor, the First Clinical College of Jinan University, Guangzhou 510

16、632, Guangdong Province, China4929ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction瘢痕疙瘩是繼發(fā)于皮膚損傷如創(chuàng)傷、燒傷或手術(shù)后，以膠原過度沉積于真皮和皮下組織為特征的皮膚膠原性疾病。與增生性瘢痕(HS)不同，瘢痕疙瘩超過皮損邊緣呈浸潤性生長，侵犯臨近組織，無自限性，易造成功能障礙，有好發(fā)部位，多見于有色人種，不發(fā)生退行性變化，單純手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)，必須輔以電子線照射等綜合治療，有良性真皮腫瘤之稱。盡管國內(nèi)外學者從組織、細胞和分子水平上，對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和分化活性異常、細胞外基質(zhì)過度沉積

17、的病理機制不斷進行探討，也了解到瘢痕的過度增生涉及炎癥、免疫、生長因子和某些基因的變化，但是仍不清楚其確切機制，治療方面尚無突破性進展。近年來，許多研究顯示瘢痕疙瘩的形成可能是由于成纖維細胞膠原合成失調(diào)(主要表現(xiàn)為不成比例增加)所致，導(dǎo)致這種失控的原因是控制膠原mRNA轉(zhuǎn)錄的有關(guān)基因缺失、增加或突變，以致膠原mRNA轉(zhuǎn)錄增加1-2。許多研究也顯示，瘢痕疙瘩成纖維細胞過度增殖和膠原過度合成的原因可能與基因的結(jié)構(gòu)異常及功能異常有關(guān)3。因此尋找瘢痕疙瘩的相關(guān)調(diào)控基因已成為當前瘢痕研究的熱點。hIL-24是單拷貝基因，定位于的1q32-41，由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，含有49個氨基酸的信號肽。hI

18、L-24表達可在對正常細胞無影響的前提下，特異性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，有效抑制原位癌和轉(zhuǎn)移癌的生長。已有研究表明，hIL-24在正常黑素細胞以及早期黑色素瘤中有較高水平的表達，而當腫瘤惡性程度逐漸增加時，其表達出現(xiàn)減少趨勢，在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞中，則幾乎無hIL-24的表達4-7。近期有大量文章表明，hIL-24可通過啟動各個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)誘導(dǎo)廣泛癌細胞凋亡8-9。hIL-24因其特異性的誘導(dǎo)細胞凋亡的特性，正逐漸成為研究熱點。瘢痕疙瘩又名瘢痕瘤，本質(zhì)上為皮膚的一種纖維組織腫瘤，具有類腫瘤特性。因此，此次研究擬構(gòu)建過表達hIL-24基因的慢病毒載體，從瘢痕疙瘩中分離原代成纖維細胞后，轉(zhuǎn)染過表達h

19、IL-24慢病毒載體，探討hIL-24對瘢痕疙瘩成纖維細胞的作用，從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(TGF-/Smad3)初步探討hIL-24作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的相關(guān)機制。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計 細胞學實驗觀察。1.2 時間及地點 實驗于2014年9月至2015年8月在廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院完成。1.3 材料 實驗標本來自就診廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院整形外科患者，經(jīng)臨床及病理確診為瘢痕疙瘩，其中男性6例、女性9例；年齡10-47歲，平均年齡(27.2±5.1)歲；病變部位包括耳垂、前胸、上臂、腹部等處。實驗分為對照組(瘢痕疙瘩成纖纖細胞)和轉(zhuǎn)染h

20、IL-24的成纖維細胞組；標本取材后即置于液氮瓶中，后轉(zhuǎn)到-70 冰箱保存至使用。所有標本均經(jīng)患者知情同意后進行成纖維細胞培養(yǎng)等后續(xù)實驗。納入標準：臨床及病理確診為瘢痕疙瘩。排除標準：臨床所見為瘢痕或瘢痕增生組織，經(jīng)病理確診為非瘢痕疙瘩。1.4 實驗方法1.4.1 慢病毒載體(LVTHM)的構(gòu)建 基因片斷根據(jù)microRNA的miRNA區(qū)域設(shè)計，并通過oligoengine work station運算所得，軟件推算的感染效率為82.8%。1.4.2 成纖維細胞培養(yǎng)與鑒定 無菌條件下去除瘢痕疙瘩組織表皮及脂肪組織，PBS(含1%PS雙抗)漂洗3次，用眼科剪碎(大小約0.5 mm3)，加DMEM

21、培養(yǎng)液(含體積分數(shù)10%胎牛血清，1%PS雙抗)，反復(fù)吹打，重懸為組織微粒懸液。置入培養(yǎng)箱中留置培養(yǎng)，每天觀察細胞形態(tài)、培hIL-24轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細胞實驗用試劑與儀器：試劑與儀器來源DMEM培養(yǎng)液Gibco小牛血清華美生物0.25%胰蛋白酶SigmaDNA抽提試劑盒TiangenPfuUltra High-Fidelity DNA Polymerasestratagene CO.dNTPsangonPCR擴增儀、低溫高速離心機EppdorfUV-1601型紫外分光光度儀Shimadzy凝膠成像分析系統(tǒng)、蛋白電泳灌膠模具Bio-Rad垂直蛋白電泳系統(tǒng) SE600 Hoefer聚羥基乙酸、硝

22、酸纖維素膜Corning顯影液、定影液KodaECL發(fā)光試劑盒A、B液博士得公司養(yǎng)液顏色變化，注意有無污染，7 d左右傳代1次。將細胞消化并稀釋，制成細胞懸液，按0.8×107 L-1細胞濃度均勻接種于預(yù)先覆蓋滅菌蓋玻片的12孔板中。觀察細胞鋪滿蓋玻片面積約50%時，取出蓋玻片，PBS清洗3次，用40 g/L多聚甲醛固定30 min(室溫)。免疫熒光染色及細胞流式檢測細胞漿波形蛋白抗體陽性率。1.4.3 感染成纖維細胞 將hIL-24基因轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩組織成纖細胞。當成纖維細胞達到60%融合，PBS洗滌，Trypsin液消化；用含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)，吹吸分散細胞，離心、重懸、培養(yǎng)細胞，

23、待細胞長到50%-80%單層時，無血清培養(yǎng)基洗滌細胞，將慢病毒載體滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，孵育4-6 h；用含體積分數(shù)10%胎牛血清及1%PS雙抗的DMEM培養(yǎng)基替換感染液后繼續(xù)培養(yǎng)；加入相應(yīng)選擇性抗生素，分次篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。1.4.4 RT-PCR測定感染效率 細胞計數(shù)儀計數(shù)后，取1×106細胞量，液氮研磨，研磨過程中加入Trizol，移入勻漿器，反復(fù)抽打勻漿；轉(zhuǎn)移進新離心管，離心，加氯仿，震蕩、離心，加異丙醇，震蕩、離心；加入75%乙醇，震蕩、離心，加入DEPC溶解RNA；分光光度計檢測260/280吸光度比值，計算RNA濃度。以各組cDNA作為模板，按照RT-PCR標準流程進行半

24、定量PCR，根據(jù)相對定量法計算目標片段的擴增比例。選擇18S RNA作為內(nèi)參。每個樣本重復(fù)3次，每組實驗各重復(fù)3次。圖1 成纖維細胞培養(yǎng)與鑒定Figure 1 The culture and identification of fibroblasts圖注：圖A為培養(yǎng)7 d的瘢痕疙瘩成纖維細胞(×50)；B為細胞漿波形蛋白抗體陽性(×50)；C為波形蛋白純度：圖2 慢病毒感染成纖維細胞及感染效率測定結(jié)果Figure 2 Efficiency of lentiviral transduction of fibroblasts圖注：圖A為慢病毒感染效率測定；B為定量PCR檢測hI

25、L-24的過表達效率。引物序列：hIL-24Forward，5- GCC TTT GTT TCC CAT CAG AC -3，Reverse，5- CCC GAC TTC CCT TTG TGT AA -3。1.4.5 Western-blot測定感染的后成纖維細胞表達hIL-24情況 取2×106細胞加入RIPA液120 L，充分裂解、離心，取25 L裂解后的蛋白，使用蛋白凝膠電泳90 V，棄去電泳液，用TBST洗膜，15 min×3次。加入TH抗體(1150稀釋)，于搖床4 孵育過夜，棄一抗，TBST洗膜10 min×3次，加入HRP標記的二抗(11 000稀

26、釋)，搖床80 r/h 1 h后，用TBST洗膜10 min×3次，盡量吸干膜表面TBST，將熒光底物A、B液等量混合后，反應(yīng)1 min左右，曝光后顯影，并拍照。1.4.6 定量PCR檢測各組成纖維細胞中轉(zhuǎn)化生長因子、Smad3、增殖細胞核抗原(PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1的表達。按照標準RNA抽提流程，抽提各組細胞的總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成相應(yīng)的cDNA。以各組cDNA作為模板，建立相應(yīng)的反應(yīng)體系，SYBR Green I熒光染料法繪制溶解曲線，生成原始數(shù)據(jù)，并進行分析。1.5 主要觀察指標 成纖維細胞培養(yǎng)與鑒定；慢病毒感

27、染成纖維細胞及感染效率測定結(jié)果；Western blot檢測hIL-24表達情況；定量PCR檢測各組成纖維細胞表達轉(zhuǎn)化生長因子、Smad3、增殖細胞核抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1結(jié)果。1.6 統(tǒng)計學分析 采用Stata 12.1軟件，使用單因素方差分析，比較各組間表達差異。P < 0.05時認為差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results 2.1 成纖維細胞培養(yǎng)與鑒定 培養(yǎng)7 d的成纖維細胞如圖所示：均勻貼壁，多種形態(tài)，如多為梭形，胞體膨大，可見長短不一胞質(zhì)突起，并有集落生長趨勢(圖1A)。細胞免疫熒光染色及細胞流式顯示：可見細胞漿波形蛋白抗體呈陽性，純

28、度大于97.8%(圖1B，C)。2.2 慢病毒感染成纖維細胞及感染效率測定結(jié)果 將成纖維細胞鋪盤于10 cm平皿，每孔為5×105細胞，每孔加入不同的慢病毒載體，48 h后用流式細胞儀檢測GFP的表達，感染效率為97.40%(圖2A)。定量PCR檢測hIL-24的過表達效率為81.7%(圖2B)。2.3 Western blot檢測hIL-24表達情況 感染后的成纖維細胞hIL-24表達上調(diào)(圖3)。對照組 感染后的成纖維細胞hIL-24GAPDH圖3 Western blot檢測hIL-24蛋白表達情況Figure 3 hIL-24 protein expression deter

29、mined by western blot assay圖注：Western blot顯示感染后的成纖維細胞hIL-24表達上調(diào)。2.4 定量PCR檢測各組成纖維細胞表達轉(zhuǎn)化生長因子、Smad3、增殖細胞核抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1結(jié)果 對照組與轉(zhuǎn)染hIL-24的成纖維細胞組相比較成纖維細胞表達轉(zhuǎn)化生長因子、Smad3、增殖細胞核抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1均有顯著性差異，對照組轉(zhuǎn)化生長因子、Smad3、增殖細胞核抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9表達要明顯高于轉(zhuǎn)染hIL-24的成纖維細胞組(P < 0.05)

30、，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1表達明顯低于轉(zhuǎn)染hIL-24的成纖維細胞組(表1)。表1 兩組細胞各目的基因相對表達分析結(jié)果 (±s，n=13)Table 1 Relative expressions of target genes in fibroblasts in both groups基因?qū)φ战M轉(zhuǎn)染hIL-24的成纖維細胞組轉(zhuǎn)化生長因子0.417±0.0210.128±0.013Smad30.874±0.0170.162±0.008增殖細胞核抗原0.928±0.0150.316±0.023基質(zhì)金屬蛋白酶25.042±

31、;0.0282.057±0.013基質(zhì)金屬蛋白酶90.068±0.00110.003±0.000基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物11.952±0.0073.635±0.001表注：對照組轉(zhuǎn)化生長因子、Smad3、增殖細胞核抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9表達要明顯高于轉(zhuǎn)染hIL-24的成纖維細胞組，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1表達明顯低于轉(zhuǎn)染hIL-24的成纖維細胞組。3 討論 Discussion瘢痕疙瘩是組織損傷后的異常修復(fù)，表現(xiàn)為以成纖維細胞為主的細胞增殖、活性增強，逃避凋亡，向周圍正常皮膚組織遷移、侵襲性生長，及以、型膠原蛋白為主的細胞外基質(zhì)沉

32、積等。目前臨床上多采用綜合治療的方法，然而療效卻不甚滿意。因此，積極探索瘢痕疙瘩中成纖維細胞和細胞外基質(zhì)的活動情況顯得尤其重要。hIL-24基因是研究較明確的抑癌基因，可激活免疫應(yīng)答效應(yīng)，又可發(fā)揮特異性地抑制癌細胞生長作用，抑制癌周新生血管增生。由于其受體在不同組織、細胞中的表達存在差異，從而hIL-24發(fā)揮不同功能。其中，皮膚是hIL-24的主要靶組織。研究數(shù)據(jù)表明，hIL-24可以通過促進真皮細胞增殖而影響表皮的功能10。更重要的是，hIL-24具有廣泛的抗腫瘤作用，當其通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或腺病毒載體將其轉(zhuǎn)染人腫瘤細胞使其異位表達，可以通過上調(diào)caspase3，上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2來誘導(dǎo)細

33、胞的凋亡。hIL-24可以下調(diào)MDR1、MRP1、和LRP等基因的表達，從而減少p-gp的表達，促進化療藥物在腫瘤細胞內(nèi)的蓄積，減少外排，增強化療藥物的作用，來逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性，但對正常細胞沒有類似影響11-12。相關(guān)研究證實，hIL-24聯(lián)合順鉑展開了對人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP的抑癌增效及其凋亡研究。CCK-8檢測結(jié)果顯示hIL-24對A549/DDP細胞具有生長抑制作用，而對正常細胞WI-38無毒性，對于長期應(yīng)用順鉑而產(chǎn)生耐藥的肺癌hIL-24表現(xiàn)出了優(yōu)勢，且聯(lián)合用藥之后抑制率與單獨用藥比較差異有統(tǒng)計學意義，表明hIL-24具有化療增敏效應(yīng)，可減少高劑量DDP所致的不良反應(yīng)

34、，從而達到低毒高效的作用13。雖然，體內(nèi)外研究闡述了hIL-24對癌變調(diào)節(jié)的多種可能機制，但該基因?qū)︸：鄹泶竦淖饔眉捌錂C制尚未報道。PCNA(增殖細胞核抗原)是一種在細胞核內(nèi)合成的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為36 000。增殖細胞核抗原表達量的變化與DNA合成稱正相關(guān)性，可通過檢測增殖細胞核抗原在細胞中的表達量，評價細胞增殖狀態(tài)14-15。此次研究發(fā)現(xiàn)，感染hIL-24的瘢痕疙瘩成纖維細胞表達增殖細胞核抗原顯著下降，表明hIL-24可以抑制增殖細胞核抗原合成，并且成纖維細胞增殖減慢?；|(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物，主要參與調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)降解，基質(zhì)金屬蛋白酶是重要的蛋白水解酶，可使膠原螺旋的穩(wěn)定

35、性降低，改變底物二級結(jié)構(gòu)，為其他蛋白酶降解創(chuàng)造條件，是ECM降解過程中起決定性作用的蛋白酶16-17。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物作為一種基質(zhì)金屬酶抑制物，可有效抑制基質(zhì)金屬蛋白酶功能，它可與基質(zhì)金屬蛋白酶非共價結(jié)合，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，亦可與酶原結(jié)合，進一步阻止其活化，達到抑制細胞外基質(zhì)降解的作用，因此，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物與基質(zhì)金屬蛋白酶的動態(tài)平衡在組織修復(fù)的進程中起著至關(guān)重要的作用18-21。在本研究中對基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1進行檢測發(fā)現(xiàn)，感染hIL-24的成纖維細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9下降，說明hIL-24具有抑制細胞外基質(zhì)分解的作用

36、。但是，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物1表達增加，推測由于局部基質(zhì)金屬蛋白酶短期內(nèi)增加過盛，機體為保持基質(zhì)金屬蛋白酶與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物之間的平衡，使其被動升高。以前的有關(guān)研究也為此提供支持22-23。轉(zhuǎn)化生長因子1是目前公認的與瘢痕疙瘩形成最為密切的細胞因子。轉(zhuǎn)化生長因子1家族成員對表皮細胞的生長、分化、凋亡及腫瘤形成具有調(diào)控作用。轉(zhuǎn)化生長因子1細胞表面受體主要分為、型。其中轉(zhuǎn)化生長因子1直接刺激血管生成，刺激FB增殖及細胞中葡萄糖與氨基酸的轉(zhuǎn)運和糖酵解的進行，同時也抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性和促進基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑纖溶酶原激活物抑制劑1基因的表達，進而抑制細胞外基質(zhì)的降解；還介導(dǎo)血小板源性生長因

37、子、結(jié)締組織生長因子的致纖維化作用；促進纖維粘連蛋白和膠原基質(zhì)的黏附，促進瘢痕的形成24-27。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子1的存在會不斷刺激KFB誘導(dǎo)基質(zhì)產(chǎn)生，導(dǎo)致細胞基質(zhì)的過度沉積。研究發(fā)現(xiàn)，丹參涂膜劑可改善增生期瘢痕微循環(huán)局部缺氧狀態(tài)，進而抑制瘢痕組織內(nèi)細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子1的表達28-29。TGF-1/Smads屬于受體偶聯(lián)絲/蘇氨酸激酶信號通路，具有多生物學效性，可調(diào)節(jié)各類細胞的增殖、分化以及凋亡。在胚胎期該信號失調(diào)節(jié)時，可引發(fā)器官發(fā)育受限，表現(xiàn)在成熟個體時TGF-1/Smads通路與自身免疫、炎性反應(yīng)、細胞外基質(zhì)沉積、局部纖維結(jié)締組織增生、腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等有密切聯(lián)系30-31。

38、近年來，已有大量研究報道轉(zhuǎn)化生長因子1及其信號分子 Smads 可有效促進各類創(chuàng)面修復(fù)進程，抑制smad3基因的表達可能減少轉(zhuǎn)化生長因子信號通路的傳導(dǎo)，從而減少病理性瘢痕的形成。此次研究中發(fā)現(xiàn)感染hIL-24的成纖維細胞表達轉(zhuǎn)化生長因子1、Smad3均下降，由此推測hIL-24可能通過TGF-1/ Smads途徑發(fā)揮作用。作者貢獻：設(shè)計、實施、評估者分別為第一作者、第二至六作者、第七作者；采用盲法評估利益沖突：所有作者共同認可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。倫理問題：實驗方案已經(jīng)患者/家屬知情同意。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家

39、雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔責任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻 References1 Wang CM,Hyakusoku H,Asano G,et al.Genetic predispositions to keloid and hypertrophic scar.Japan PRS.2001;21(2):241-244.2 Chwu M,Sayah D,Freymiller E,et al.

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