第八節(jié)-人類基因組的染色體作圖(共8頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第八節(jié) 人類基因組的染色體作圖一、人類基因定位方法人體基因組由22條常染色體、一條X染色體和一條Y染色體組成。有30億(3×109)個(gè)核苷酸對(duì)，其中70(約2×109)核苷酸對(duì)是單拷貝的DNA，包括編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，和一大批功能目前不明的DNA序列。此外是一些長度不等，拷貝數(shù)不同的重復(fù)序列，約占人類基因組30。20世紀(jì)90年代，遺傳學(xué)進(jìn)入了揭示人類自身的遺傳本質(zhì)的偉大時(shí)代。這個(gè)時(shí)代的標(biāo)志是自1991年始的為期15年、投資30億美元的全球性的跨世紀(jì)的規(guī)模宏大的“人類基因組計(jì)劃”(human genome project,HGP)。這項(xiàng)巨大的研究計(jì)

2、劃的主要內(nèi)容是測(cè)定和分析人類基因組DNA的全部核苷酸對(duì)的排列順序，認(rèn)讀全部遺傳信息。這項(xiàng)研究在短短的幾年時(shí)間里取得了驚人的進(jìn)展。至 1990年時(shí)，人體基因組中已經(jīng)確定了在染色體上位置的基因座位共6552個(gè)，已經(jīng)測(cè)定了核苷酸序列的基因 772個(gè)；發(fā)現(xiàn)了 2275個(gè)基因座有多態(tài)性。制備了各條染色體的探針共11852個(gè)，完成了500萬個(gè)核苷酸對(duì)的序列測(cè)定，約占人類基因組全序列的21000。1992年繪制了除Y染色體以外的23條染色體的遺傳連鎖圖，美、法科學(xué)家繪制出了人的Y染色體長臂和第21染色體長臂的圖譜。這兩項(xiàng)成果無疑為按期完成人類基因組計(jì)劃展示了美好前景。 1993年的資料報(bào)道，已定位4183個(gè)

3、基因。到1994年上半年為止，已定位了人的3300個(gè)遺傳標(biāo)記，已完成基因組作圖第一期工程目標(biāo)的60。將人體的基因(或遺傳標(biāo)記，marker)定位在特定染色體上，有下列方法：(一)家系分析法通過分析、統(tǒng)計(jì)家系中有關(guān)性狀的連鎖情況和重組率而進(jìn)行基因定位的方法。其中連鎖分析法是最常用的家系分析法(pedigree method)。早在20世紀(jì)30年代，通過家系分析法已將人類的綠色盲、G6PD、紅色盲、血友病A的基因定位在X染色體上。1如果某性狀只出現(xiàn)在男性，則可將決定這個(gè)性狀的基因定位在Y染色體上。2X連鎖基因的定位根據(jù)伴性遺傳原理，男性的X染色體總是來自他的母親，而這條X染色體又總是傳給他的女兒，

4、所以在正常情況下在X染色體上的基因不會(huì)出現(xiàn)直接從男性到男性的傳遞方式，而是隔代交叉遺傳，亦即外祖父出現(xiàn)的某種性狀在母親身上不出現(xiàn)(當(dāng)外祖母為純合正常時(shí))，往往出現(xiàn)在其外孫身上。如果兩個(gè)性狀都表現(xiàn)為隔代交叉遺傳，則可以判定這兩個(gè)性狀的基因都在X染色體上，或可以說這兩個(gè)基因是性連鎖的。但這種方法不能確定其排列順序和連鎖強(qiáng)度。3外祖父法在確定X染色體的連鎖關(guān)系后，進(jìn)一步確定其相對(duì)距離，但這一步必須測(cè)定重組率才可完成。根據(jù)雙親的基因型來判斷子代中哪些是重組體，哪些是親本型才可計(jì)算重組率。對(duì)于X染色體上的基因來說，只需要知道母親的基因型是否為雙重雜合體(即兩對(duì)基因都處于雜合狀態(tài))。根據(jù)雙重雜合體的母親所

5、生兒子中有關(guān)性狀的重組情況，就可以估計(jì)重組率，而母親X染色體上的基因組成，可以由外祖父的表型得知，因此，這種基因定位的方法稱為外祖父法(grandfather method)。就 Aa、Bb兩對(duì)連鎖基因而言，母親為雙重雜合體時(shí)，可能有兩種連鎖相：互引相ABab(或稱順式相cis phase)和互斥相AbaB(或稱反式相trans phase)?，F(xiàn)以人類X連鎖的色盲基因(a)和蠶豆病基因(G6PD-)(g)為例說明外祖父法：(1)若X染色體沒有重組交換，則不論母親是順式還是反式雜合體，其兒子中的X染色體只有兩種類型2)若母親的X染色體的兩個(gè)基因間發(fā)生了交換根據(jù)外祖父的表型確定作為母親的雙重雜合體

6、的連鎖相(反式或順式)，然后判斷其兒子中的各種表型中哪種屬于重組型，統(tǒng)計(jì)其重組體所占的比例，就可計(jì)算兩個(gè)基因間的重組率，繼而確定連鎖基因間的相對(duì)距離。根據(jù)這種外祖父法測(cè)得色盲基因與G6PD基因間的相對(duì)距離約為5cM(平均每20個(gè)兒子中有一個(gè)重組體)。家系分析法在原則上也可用于常染色體上的基因定位。當(dāng)已知某染色體上的某種標(biāo)記與某基因間的連鎖關(guān)系后，就可以用家系分析法將該基因定位在這條染色體上。如決定Duffy血型的基因就是這樣定位在人的1號(hào)染色體上的，這也是第一個(gè)用這種方法定位在常染色體上的基因。(二)體細(xì)胞雜交定位法運(yùn)用體細(xì)胞遺傳學(xué)原理和體細(xì)胞雜交的新技術(shù)可以在離體條件下，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)方法，研

7、究體細(xì)胞融合、突變、分離以及連鎖和交換等進(jìn)行人類基因定位，繪制細(xì)胞學(xué)圖，(其基本原理和主要方法將在第十二章作詳細(xì)論述)。1克隆分布板法為了將某一個(gè)基因定位在某一條染色體上，必須建立包括人體24條染色體在內(nèi)的一整套雜種細(xì)胞。其中每個(gè)雜種細(xì)胞都包括有一組人體染色體。這樣的一套雜種細(xì)胞稱為克隆分布板(clone panel)。利用這種克隆分布板，結(jié)合細(xì)胞遺傳學(xué)和生物化學(xué)分析不同克隆中所含的人的染色體與特定基因產(chǎn)物之間的關(guān)系，就可將某一特定基因定位于某一染色體上。例如有A、B、C三個(gè)雜種細(xì)胞克隆，每一克隆保留了4條人的染色體，分別含1號(hào)至8號(hào)染色體，各不相同。例如A克隆保留了染色體1、2、3、4，C克

8、隆保留了第1、3、5、7號(hào)染色體(表311)。如果某一表型特征(可以是酶的活性、蛋白質(zhì)產(chǎn)物等)只見于A和C克隆而不存在于B克隆(因?yàn)锽克隆不包含第3號(hào)染色體)，則可將決定這一表型特征的基因定位于人的第3號(hào)染色體上。若另一待定基因的性狀只在雜種細(xì)胞克隆A和B出現(xiàn)，而不見于C克隆，則該基因可定位在第2號(hào)染色體上。表3-11中的3個(gè)合適的克隆就可對(duì)8條(238)染色體作出判斷，如果選擇5個(gè)合適的克隆(2532)就可對(duì)人類的32條染色體進(jìn)行基因定位。為了避免各種誤差，一般主張采用8個(gè)克隆進(jìn)行基因定位測(cè)驗(yàn)。體細(xì)胞中的基因連鎖稱為同線性(synteny)，用以區(qū)別于通過家系分析檢出的連鎖。在雜種細(xì)胞中兩個(gè)

9、基因同時(shí)出現(xiàn)或同時(shí)不出現(xiàn)表明這兩個(gè)基因是同線的。2利用染色體異常將基因定位在染色體的具體位置(1)基因劑量效應(yīng)法：利用在具有某一特定染色體片段缺失或重復(fù)的病人或培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)所觀察到的基因劑量效應(yīng)進(jìn)行基因的區(qū)域定位。如果某一個(gè)基因產(chǎn)物的量與染色體上某一片段拷貝數(shù)目有明顯的比例變化關(guān)系，就可將上述基因定位在這一染色體上或某一特定片段上。例如，發(fā)現(xiàn)先天愚型患者(21三體)的超氧化物歧化酶1(SOD1)的基因的活性為正常人的1.5倍，于是將編碼SOD-1的基因定位在21號(hào)染色體上。(2)染色體缺失定位法：此法無需從病人體內(nèi)獲得有關(guān)染色體異常的細(xì)胞，而是用人工方法在體外造成雜種細(xì)胞內(nèi)特定染色體的不同位置發(fā)

10、生斷裂，形成各種類型的末端缺失，獲得一套特定染色體的缺失雜種細(xì)胞，然后通過檢測(cè)缺失雜種細(xì)胞內(nèi)基因產(chǎn)物存在與否對(duì)許多基因進(jìn)行區(qū)域定位。1986年復(fù)旦大學(xué)遺傳研究所利用此法，將編碼乙醇脫氫酶基因首先定位在4q21位置上。此外，利用染色體缺失定位原理將編碼紅細(xì)胞酸性磷酸酶1(ACP1)的基因也成功地定位到2p23內(nèi)。發(fā)現(xiàn)一個(gè)2號(hào)染色體短臂末端缺失的兩個(gè)患兒，細(xì)胞學(xué)檢查出一個(gè)患兒的斷點(diǎn)在2p23末端部分，但來自這個(gè)孩子的培養(yǎng)細(xì)胞中有ACP1的活性，第二個(gè)孩子的染色體缺失是從2p23的最近一端直到末端，帶這種染色體的細(xì)胞沒有ACP1酶的活性，因此推斷出ACP1的基因在2p23內(nèi)，圖328。體細(xì)胞遺傳學(xué)原

11、理應(yīng)用于人類基因定位技術(shù)要求所定位的基因必須在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)。只有編碼參與細(xì)胞代謝的酶或細(xì)胞表面標(biāo)記的基因才能滿足以上要求。這項(xiàng)技術(shù)無法測(cè)定在培養(yǎng)細(xì)胞中沒有表型表達(dá)的基因。重組DNA技術(shù)可以克服上述局限性，于是發(fā)展了以下新方法。(三)DNA介導(dǎo)的基因定位隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，許多人體基因已經(jīng)克隆，基因的結(jié)構(gòu)和功能得到了詳細(xì)的研究，并且發(fā)現(xiàn)了一大批存在于人體基因組的DNA隨機(jī)片段和限制性多態(tài)位點(diǎn)。因而只需要通過分子雜交方法直接在染色體DNA水平上進(jìn)行定位，但是仍然需要以體細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)。正是由于DNA重組技術(shù)與體細(xì)胞雜交技術(shù)的有機(jī)結(jié)合和巧妙應(yīng)用，使定位基因的數(shù)量、定位的精確度、準(zhǔn)確性和

12、效率都大大提高。1克隆基因定位法 采用已克隆基因的cDNA探針與保留在雜種細(xì)胞內(nèi)的人染色體DNA順序進(jìn)行分子雜交，來確定克隆基因所在的染色體。例如，要定位人體白蛋白基因，需要應(yīng)用人體白蛋白基因cDNA做為探針，分別與經(jīng)過Hind酶切后的人體細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)雜交。雜交后的人體細(xì)胞DNA顯示6.8kb帶型，CHO細(xì)胞的DNA顯示3.5kb帶型。進(jìn)一步在含有人體4號(hào)染色體的人CHO雜種細(xì)胞中，用Hind酶切后，再與白蛋白基因的cDNA探針雜交，如果出現(xiàn)6.8kb和3.5kb帶型者稱為陽性雜種細(xì)胞，而不含有人體第4號(hào)染色體的雜種細(xì)胞中只顯示3.5kb帶型為陰性細(xì)胞。由于人體白蛋白基因的

13、cDNA探針的特異性，Hind雜交帶只出現(xiàn)在含有人體4號(hào)染色體的雜種細(xì)胞中，所以將此基因定位在4號(hào)染色體上。又例如利用人的-珠蛋白基因克隆DNA制備的探針與含有人不同染色體組合的細(xì)胞雜交，結(jié)果只有攜帶人11號(hào)染色體的細(xì)胞株才能與之發(fā)生雜交，于是就將該基因定位于11號(hào)染色體上。再進(jìn)一步采用只含有人的11號(hào)染色體的CHO細(xì)胞株，誘變處理這些細(xì)胞株，再分離出丟失11號(hào)染色體不同片段的5個(gè)亞克隆。經(jīng)過丟失性狀和丟失帶的組配可構(gòu)建成11號(hào)染色體圖，隨后分別提取這5個(gè)攜帶有不同缺失的亞克隆DNA，并用限制酶EcoRI分別處理這些DNA樣本，用凝膠電泳展示這些限制酶酶切DNA片段，再用已克隆基因探針與之雜交

14、。結(jié)果表明，該基因探針可與亞克隆J1-23、J1-10和J1-11雜交，而與J1-9或J1-7亞克隆DNA不雜交。因此-珠蛋白基因被進(jìn)一步定位于J110斷裂點(diǎn)與J19斷裂點(diǎn)之間的間隔部位。2原位雜交法這是一種應(yīng)用比較廣泛的直接的基因定位方法，以標(biāo)記(同位素、生物素或熒光染料)的探針直接同中期染色體進(jìn)行原位雜交?，F(xiàn)以14.9kb的順序的定位為例說明此方法的基本原理。由于對(duì)于這個(gè)DNA片段的功能未知，但知道其在每個(gè)單倍體基因組中至少有12個(gè)拷貝。首先將14.9kb的順序克隆到噬菌體上，用切口移位法標(biāo)記3H，將標(biāo)準(zhǔn)的顯微制片上的人體中期染色體除去RNA，并將染色體DNA變性。然后將放射性標(biāo)記的探針加

15、到染色體制片上，16h保溫后，洗去過量的未結(jié)合的DNA，最后，進(jìn)行放射性自顯影，統(tǒng)計(jì)最集中的放射性標(biāo)記在第幾號(hào)染色體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)放射性標(biāo)記集中在1號(hào)染色體短臂的端粒區(qū)，即在分帶1p36處。熒光原位雜交結(jié)果顯示的熒光亮點(diǎn)處即表示探針與染色體上的相應(yīng)的結(jié)合處，表明克隆到的片段的位置。下表顯示利用原位雜交法所定位的人體基因的基本情況。二、人類染色體作圖先前介紹的是運(yùn)用不同的技術(shù)把基因(或分子標(biāo)記)定位在特定染色體上。這是基因組分析的第一步驟。第二層次的分析是具有較高分辨率的染色體作圖，目的是確定一個(gè)基因在染色體圖上的位置。由前已知人類基因組有3×109bp，其中還包含著大量的重復(fù)序列。每條染

16、色體都是一個(gè)巨大的DNA分子，例如X染色體的DNA分子就可能有1.6億個(gè)bp。要在這樣龐大的序列中確定某一特定基因或序列的位置并繪制出染色體圖，就如在北京這樣的大城市中尋找某一個(gè)人一樣困難。因此，對(duì)人類基因組進(jìn)行細(xì)致的劃分和標(biāo)記，正如對(duì)某一個(gè)街區(qū)的每一個(gè)小胡同都予以命名，每一院落都進(jìn)行編號(hào)一樣。差不多每500kb就設(shè)一個(gè)特異的DNA標(biāo)記，以此來作為界定一個(gè)基因或序列的可辨認(rèn)的界標(biāo)(landmark)。限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，特定的DNA序列、RFLP、STS、EST等都是有用的遺傳界(路)標(biāo)。(一)限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphi

17、sms，RFLPs)由于各種原因引起DNA內(nèi)核苷酸排列順序改變，當(dāng)這種改變涉及到限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，利用限制性內(nèi)切酶將DNA分子切割成許多長度不等的限制性片段，這些具有不同長度的限制性片段類型在人群中所呈現(xiàn)的多態(tài)分布現(xiàn)象就稱為限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)。對(duì)于特定的DNA所產(chǎn)生的限制性片段是特異的，它能作為某一DNA(或具有這一DNA的個(gè)體)的特有的“指紋”。利用RFLPs作為遺傳界標(biāo)可以成為對(duì)人類基因組作物理圖譜的基礎(chǔ)。此外，當(dāng)多態(tài)性順序與人類遺傳性疾病的基因連鎖時(shí)，可作為遺傳病的產(chǎn)前診斷或雜合子的標(biāo)記，以及親子鑒定的遺傳分析等等。由于核DNA的RFLP不能直接觀察，通常采用一組組

18、隨機(jī)克隆的基因組片段作為探針，與同一種群或家族的不同個(gè)體的基因組的限制酶消化產(chǎn)物雜交，來檢測(cè)各個(gè)片段。RFLP作圖經(jīng)常用在一個(gè)特定個(gè)體，其結(jié)果作為其他個(gè)體作圖的標(biāo)準(zhǔn)，同樣方法應(yīng)用到人類基因組分析上。例如收集來自61個(gè)正常家庭，每個(gè)家庭平均有8個(gè)子女，共計(jì)488個(gè)個(gè)體的RFLP圖譜，作為整個(gè)人類基因組作圖中的標(biāo)準(zhǔn)。一幅理想的有參考價(jià)值的RFLP圖譜，其分辨率應(yīng)在1cM左右。RFLP作為人類基因組的一種遺傳標(biāo)記，其中許多已經(jīng)定位。在此基礎(chǔ)上，只要證明某一基因與某一限制性片段多態(tài)性連鎖緊密，則兩者必定在同一染色體上相鄰的位置。RFLP作圖也是研究遺傳性疾病的一種有力的綜合研究手段。用RFLP制備的探

19、針對(duì)患者家系的DNA樣品進(jìn)行分析，當(dāng)大致證實(shí)某致病基因與RFLP探針檢出的RFLP有連鎖關(guān)系時(shí)，再逐步改用距離較小的探針對(duì)該區(qū)段作進(jìn)一步分析，就可以逼近以致精確定位某致病基因的位置。至今已采用這種作圖法對(duì)許多遺傳病的基因進(jìn)行了定位。(二)數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat,VNTR)人類的VNTR座位上包含了不同數(shù)目的33bp的串聯(lián)重復(fù)DNA，分布在整個(gè)基因組的不同位點(diǎn)上，這些重復(fù)成分構(gòu)成了DNA指紋分析的基礎(chǔ)。所謂DNA指紋是指限制性酶消化產(chǎn)物在southern雜交中的一系列帶紋，不同帶紋代表了在染色體不同位置上的不同長度的DNA序列。如果雙親

20、在某一特定帶紋上表現(xiàn)不同時(shí)，那么這種差異即變成了雜合位置并可用來作圖。圖329給出了一個(gè)簡單的例子，圖中所示的是親本和5個(gè)子女的簡化指紋。所舉的例子說明了連鎖分析的方法。分子標(biāo)記之間可以相互參照作圖，也可以以表型效應(yīng)的位點(diǎn)為參照。例如在上圖中，F(xiàn)、H總在一起遺傳，有可能連鎖，母親中A、B在子代中是分開來的(1、3、5有A，2、4有B)，表現(xiàn)等位基因的分離，A、D不連鎖，F(xiàn)和H，F(xiàn)和E在反式緊密連鎖，P等位基因很可能與I、C連鎖?？傊?，RFLP和VNTR標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，使得構(gòu)建分辨率為1cM水平上的人類遺傳圖譜成為可能。但是厘摩(cM)仍是一個(gè)巨大的DNA片段，在人類染色體上估計(jì)有大約100萬個(gè)bp(1000kb)的距離。三、人類基因組的物理作圖最高層次上的基因組作圖是對(duì)克隆化(也可以不是)的DNA片段進(jìn)行物理作圖(physicalmapping)，它具有最高的分辨率，因?yàn)檫@是靠直接操作DNA片段得到的。由于DNA是基因組的物理材料，所以這種方法稱為物理作圖。將各種遺傳界標(biāo)標(biāo)明在DNA分子上，以物理長度單位堿基對(duì)的數(shù)目作為彼此間的距離，無需作雜交分析子代性狀，也無需作家系調(diào)查，用物理、化學(xué)技術(shù)直接確定界標(biāo)在染色體DNA分子中的位置，因而可構(gòu)成分辨率高的精確圖譜。物理圖譜有許多種，其中之一就是RFLP圖譜，利用識(shí)別6個(gè)或4個(gè)堿