生物制藥工藝學(xué)思考題及答案

1、抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1. 青霉素發(fā)酵工藝的建立對抗生素工業(yè)有何意義？青霉素是發(fā)現(xiàn)最早，最卓越的一種B-內(nèi)酰胺類抗生素，它是抗生素工業(yè)的首要產(chǎn)品，青霉素是各種半合成抗生素的原料。青霉素的缺點是對酸不穩(wěn)定，不能口服，排泄快，對革蘭氏陰性菌無效。青霉素經(jīng)過擴環(huán)后，形成頭孢菌素母核，成為半合成頭孢菌素的原料。2. 如何根據(jù)青霉素生產(chǎn)菌特性進行發(fā)酵過程控制？青霉素在深層培養(yǎng)條件下，經(jīng)歷7個不同的時期，每個時期有其菌體形態(tài)特性，在規(guī)定時間取樣，通過顯鏡檢查這些形態(tài)變化，用于工程控制。第一期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡。第二期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜堿性，類脂肪小顆粒。第三期：形成脂肪包

2、含體，積累儲蓄物，沒有空洞，嗜堿性很強。第四期：脂肪包含體形成小滴并減少，中小空泡，原生質(zhì)體嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。第五期：形成大空泡，有中性染色大顆粒，菌絲呈桶狀。脂肪包含體消失，青霉素產(chǎn)量提高。第六期：出現(xiàn)個別自溶細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)無顆粒，仍然桶狀，釋放游離氨，pH上升。第七期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁。一到四期為菌絲生長期，三期的菌體適宜為種子。四到五期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強，通過工藝措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前發(fā)束發(fā)酵。3. 青霉素發(fā)酵工程的控制原理及其關(guān)鍵點是什么？控制原理：發(fā)酵過程需連續(xù)流加葡萄糖，硫酸銨以及前提物質(zhì)苯乙酸鹽，補糖率是最關(guān)鍵的控制指標(biāo)，不同時期分段控制

3、。在青霉素的生產(chǎn)中，及時調(diào)節(jié)各個因素減少對產(chǎn)量的影響，如培養(yǎng)基，補充碳源，氮源，無機鹽流加控制，添加前體等；控制適宜的溫度和ph，菌體濃度。最后要注意消沫，影響呼吸代謝。4. 青霉素提煉工藝中采用了哪些單元操作？ 青霉素不穩(wěn)定，發(fā)酵液預(yù)處理、提取和精制過程要條件溫和、快速，防止降解。提煉工藝包括如下單元操作：預(yù)處理與過濾：在于濃縮青霉素，除去大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，便于后續(xù)的分離純化過程。萃取：其原理是青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而青霉素易溶于水。脫色：萃取液中添加活性炭，除去色素，熱源，過濾，除去活性炭。結(jié)晶：青霉素鉀鹽在乙酸丁酯中溶解度很小，在乙酸丁酯萃取液中加入乙酸鉀-乙醇溶

4、液，青霉素鉀鹽可直接結(jié)晶析出。氨基酸發(fā)酵工藝1. 如何對谷氨酸發(fā)酵工藝過程進行調(diào)控？發(fā)酵過程流加銨鹽、尿素、氨水等氮源，補充NH4+；生物素適量控制在2-5g/L；pH控制在中性或微堿性；供氧充足；磷酸鹽適量。2. 氨基酸生產(chǎn)菌有什么特性，為什么？L-谷氨酸發(fā)酵微生物的優(yōu)良菌株多在棒狀桿菌屬、小短桿菌屬、節(jié)桿菌屬和短桿菌屬中。具有下述共同特性：細(xì)胞形態(tài)為短桿至棒狀；無鞭毛，不運動；不形成芽孢；革蘭氏陽性；生物素缺陷型；三羧酸循環(huán)、戊糖磷酸途徑突變；在通氣培養(yǎng)條件下產(chǎn)生大量L-谷氨酸。3. 生物素在谷氨酸發(fā)酵過程中的作用是什么？生物素是不飽和脂肪酸合成過程中所需的乙酰CoA的輔酶。生物素缺陷型菌

5、種因不能合成生物素，從而抑制了不飽和脂肪酸的合成。而不飽和脂肪酸是磷脂的組成成分之一。因此，磷脂的合成量也相應(yīng)減少，這就會導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整，提高細(xì)胞膜對谷氨酸的通透性，解除其對谷氨酸脫氫酶的抑制，源源不斷生產(chǎn)谷氨酸。維生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1. 比較分析現(xiàn)行維生素C的兩種生產(chǎn)工藝過程及本質(zhì)區(qū)別，有什么優(yōu)勢？現(xiàn)行的維生素c生產(chǎn)工藝過程有：萊氏化學(xué)合成法和兩步發(fā)酵法。萊氏化學(xué)合成法：D-葡萄糖為原料，進過催化氫化生成D-山梨醇，然后生物氧化轉(zhuǎn)變?yōu)長-山梨糖，酸性液中丙酮化，對-二仲醇進行保護。L-山梨糖高錳酸鉀在堿性溶液中氧化為二丙酮-2-酮-L-古龍酸，除去丙酮，內(nèi)酯化和烯醇化得到L-抗壞血酸。整

6、個合成過程必須保持第4位碳原子的構(gòu)型不變。兩部發(fā)酵法：催化氫化：催化氫化D-葡萄糖，控制壓力，在氫做還原劑、鎳做催化劑的條件下，將醛基還原成醇基，從而制備D-山梨醇。第一部發(fā)酵：D-山梨醇C2位羥基氧化為羰基，其他基團不變，微生物轉(zhuǎn)化得L-山梨糖。第二部發(fā)酵：L-山梨糖到2-酮基-L-古龍酸需要將C1位醇基氧化為羧基，保持其他基團不發(fā)生變化。其中兩步發(fā)酵法更具有優(yōu)勢。原因如下：以生物氧化代替化學(xué)氧化簡化了生產(chǎn)工藝。省略了丙酮化反應(yīng)步驟，節(jié)省了丙酮、硫酸等大量化工原料和其防爆設(shè)備，節(jié)約了成本，有利于安全生產(chǎn)。三廢和污染較小。提高了生產(chǎn)能力。2.維生素C的生產(chǎn)工藝中，手性中心是如何實現(xiàn)的？維生素C

7、分子中含有兩個手性碳原子，故有四個光學(xué)異構(gòu)體。其中L(+)-抗壞血酸括性最高，D（-）-異抗壞血酸活性僅為其20，工業(yè)上將其作為食品抗氧劑。D(-)-抗壞血酸和L(+)-異抗壞血酸幾乎無活性。3. 在未來，一步發(fā)酵能取代兩部發(fā)酵，成為維生素生產(chǎn)的主流工藝嗎，為什么？一步法發(fā)酵對工業(yè)菌株的山梨醇/糖旁路代謝途徑進行敲除。與原始菌株比較，發(fā)現(xiàn)單菌發(fā)酵24h后，培養(yǎng)基中剩余的山梨醇糖含量基本保持恒定，NSR缺失株相對于原始菌株殘?zhí)橇刻岣吡?5.9%?；蚬こ讨扑幑に?. 工程菌與宿主菌對培養(yǎng)基要求有何不同，為什么？碳源：大腸桿菌以蛋白胨等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源；酵母利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質(zhì)為碳

8、源。氮源：不同工程菌對氮源利用能力差異大，具有很高的選擇性。大腸桿菌利用酵母粉等大分子有機氮源；酵母利用氨基酸為氮源。選擇劑：基因工程大腸桿菌含有抗生素抗性基因，抗生素作為選擇劑；基因工程酵母菌常用氨基酸營養(yǎng)缺陷型。2. 影響工程菌培養(yǎng)工藝的主要參數(shù)是什么？如何優(yōu)化控制？溫度：生長與生產(chǎn)溫度不一致。較高溫度表達(dá)量大，易形成包涵體。策略：較低溫度下有利于表達(dá)可溶性蛋白質(zhì)。對于熱敏感的蛋白質(zhì)，高溫會降解破壞。策略：生產(chǎn)期可采用先高溫，然后低溫，變溫表達(dá)，避免蛋白質(zhì)降解。pH：了解發(fā)酵過程中各個階段的適宜pH以后，進一步設(shè)法控制pH在合適的范圍內(nèi)。 分階段控制pH：根據(jù)試驗結(jié)果來確定生長最適pH和產(chǎn)

9、物最適pH，以達(dá)到最佳生產(chǎn)。 溶解氧：從供應(yīng)量和需要量（菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累）二個方面考慮，使之需氧不超過設(shè)備的供氧能力，在臨界溶解氧濃度之上。3. 誘導(dǎo)物對生長和產(chǎn)物合成有何影響，為什么？誘導(dǎo)物用來誘導(dǎo)表達(dá)型工程菌。在細(xì)胞生長到一定階段，必需添加誘導(dǎo)物，以解除目標(biāo)基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。適宜的誘導(dǎo)時間非常重要。誘導(dǎo)物的濃度及其發(fā)酵溫度會影響表達(dá)量和產(chǎn)物存在形式?；瘜W(xué)誘導(dǎo)型啟動子：lzc、tac、T7等，誘導(dǎo)時間為對數(shù)生長期。溫度誘導(dǎo)型啟動子：PL、PR等，誘導(dǎo)時間為對數(shù)期或稍后一些?；蚬こ讨扑幑に?. 什么是基因工程菌，工程菌構(gòu)建的基本過程和各階段的主

10、要任務(wù)是什么，所涉及基因工程原理是什么？將目的基因?qū)爰?xì)菌體內(nèi)使其表達(dá)，產(chǎn)生所需要的蛋白的細(xì)菌稱為基因工程菌。工程菌構(gòu)建的基本過程如下：目標(biāo)基因克?。≒CR、文庫篩選、化學(xué)合成）表達(dá)載體構(gòu)建（酶切、鏈接）遺傳轉(zhuǎn)化與篩選（外源基因?qū)肱c培養(yǎng)）工程菌（獲得新形狀、功能、產(chǎn)生物質(zhì)）酶切：在特異位點上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應(yīng)的限制性片段。（DNA+緩沖液+限制性內(nèi)切酶；37，1小時；加熱、加EDTA終止；電泳檢查酶切完整性）鏈接：DNA雙鏈上相鄰的3羥基和5磷酸基團共價結(jié)合形成3-5磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA缺口重新連接起來。（載體片段和基因片段，緩沖液，連接酶；16-26，數(shù)小時；70

11、加熱10min終止反應(yīng)）轉(zhuǎn)化：把外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞的過程。（氯化鈣法向大腸桿菌導(dǎo)入外源基因）2. 目標(biāo)基因克隆的主要方法有哪些？分析其特點及其適用范圍PCR擴增。優(yōu)點：簡便快速，高效，數(shù)kb單基因克隆。缺點：DNA聚合酶活性和保真性限制。（94變性55退火72延伸94變性）文庫篩選。優(yōu)點：長片段，無堿基錯誤，位置序列基因克隆。缺點：繁瑣，過程復(fù)雜，耗時，昂貴?；瘜W(xué)合成：簡便，準(zhǔn)確，已知序列基因克隆，引物合成。缺點：受合成儀性能限制，長度很短。3. 大腸桿菌中高效表達(dá)蛋白藥物著重設(shè)計哪幾個方面？為了確保工程菌構(gòu)建的有效性，必須遵循GMP及其有關(guān)生物制品研究技術(shù)指導(dǎo)原則，做好菌種的記錄和管理。表

12、達(dá)載體，詳細(xì)記錄表達(dá)載體，包括基因的來源、克隆和鑒定，表達(dá)載體的構(gòu)建、結(jié)構(gòu)和遺傳特性。宿主細(xì)胞:詳細(xì)記錄宿主細(xì)胞的資料，包括細(xì)胞株系名稱、來源、傳代歷史、鑒定結(jié)果及基本生物學(xué)特性等。目標(biāo)基因序列:目標(biāo)基因的序列包括插入基因和表達(dá)載體兩端控制區(qū)的核苷酸序列，以及所有與表達(dá)有關(guān)的序列，做到序列清楚。重組人干擾素生產(chǎn)工藝1. 重組人干擾素生產(chǎn)工藝路線有哪幾條，有何缺點？體外誘生干擾素制備工藝：仙臺病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞：血漿人白細(xì)胞（病毒誘導(dǎo)）分離純化人白干擾素。缺點：產(chǎn)量低，1g IFN需要105L人血白細(xì)胞，來源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價格昂貴，潛在的血源性病毒污染的可能性。Namalva細(xì)胞培養(yǎng)（病

13、毒培養(yǎng)）合成干擾素分離純化多壓型混合干擾素。優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，用細(xì)胞培養(yǎng)8000L。缺點：活性低，退出臨床應(yīng)用。工程菌構(gòu)建發(fā)酵培養(yǎng)包涵體復(fù)性重組人干擾素。工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復(fù)性過程。缺點：生物合成、純化及制劑階段均使用了一些動物或人血液提取成分，仍然沒有擺脫潛在的傳播血源性疾病的危險。工程細(xì)胞系構(gòu)建細(xì)胞培養(yǎng)收集培養(yǎng)液分離純化重組人干擾素。工藝特點：分泌表達(dá)，產(chǎn)量低，成本高，過程控制嚴(yán)格?？梢宰龅綗o血清培養(yǎng)。 基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝。工藝特點：發(fā)酵周期短：幾個小時，無需變性、復(fù)性過程，獲得有活性產(chǎn)品，純化過程：淘汰抗體親和層析，制劑中采用非人血清白蛋白新型保護劑

14、，使得整個制造過程中不使用任何血液提取成分。2. 重組人干擾素發(fā)酵工段的關(guān)鍵控制點是什么，如何實現(xiàn)最優(yōu)化過程控制？搖瓶培養(yǎng)：搖瓶培養(yǎng)：30，pH7.0，250rpm，16-20h；種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐，接種量10%培養(yǎng)：30，pH7.0控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。3. 干擾素純化工藝的原理是什么？基于蛋白質(zhì)的電荷性除去雜質(zhì)，準(zhǔn)確控制緩沖液和上樣液的pH及電導(dǎo)值，純化干擾素4. 干擾素純化工藝過程中各工段的目的是什么？ 溶解粗干擾素：配置緩沖液（超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45m濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集），冷卻至2-10。在均漿器中完全溶解粗干擾素。 等點沉

15、淀與疏水層析：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液（含有人干擾素）。用NaOH調(diào)節(jié)上清液pH7.0，并用5M NaCl調(diào)節(jié)溶液電導(dǎo)值180ms/cm，上樣，進行疏水層析，利用干擾素的疏水性進行吸附。在2-10下，用0.025M磷酸緩沖液（pH7.0）+1.6M NaCl進行洗滌，除去非疏水性蛋白。用0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）進行洗脫，收集洗脫液，干擾素。 或等電點沉淀與鹽析：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導(dǎo)值40 ms/cm，2-10靜置過夜，除雜蛋白。1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。調(diào)整溶液pH8.0，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。 陰離子交換層析與濃縮：0.01M

16、磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂，鹽濃度線性梯度550ms/cm進行洗脫，2-10，配合SDS-PAGE收集干擾素峰。把目標(biāo)餾分合并，調(diào)整溶液pH和電導(dǎo)值，10ku超濾膜，0.05M醋酸緩沖液（5.0）中透析。 陽離子交換層析與濃縮：用0.1M醋酸緩沖液（pH0.5）平衡樹脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度5-50ms/cm進行洗脫，配合SDS-PAGE收集干擾素峰。合并餾分，10ku超濾膜系統(tǒng)。 凝膠過濾層析：0.15M NaCl的0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統(tǒng)和樹脂。上樣，相同洗脫液進行洗脫。合并干擾素部分。 無菌過濾分裝：0.22m膜過濾干擾素溶液，分裝，-20以下的冰

17、箱中保存。動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝1. 離體動物細(xì)胞對葡萄糖和谷氨酰胺的代謝特征是什么？蛋白質(zhì)的合成、修飾、分泌功能與制藥有何關(guān)系？葡萄糖代謝：糖酵解為主，生成丙酮酸和乳酸。丙酮酸經(jīng)TCA循環(huán)，氧化產(chǎn)生CO2和水，釋放能量。葡萄糖一小部分進入PPP途徑，生成4、5、7碳糖和NADPH。谷氨酰胺：作為氮源，轉(zhuǎn)氨、脫氨（為主），合成非必需氨基酸。大多數(shù)谷氨酰胺通過脫氨生成谷氨酸，并釋放銨離子。小部分谷氨酰胺通過轉(zhuǎn)氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代謝的前體。氨基酸在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體上，以mRNA為模板，進行密碼翻譯，生成蛋白質(zhì)的多肽鏈。在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和高爾基體內(nèi)加工修飾形成糖基化蛋白質(zhì)。糖基結(jié)構(gòu)易

18、變化，不同細(xì)胞系糖基化特征不同，要根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)選擇適宜細(xì)胞系。2. 制藥動物細(xì)胞系的種類和特點有哪些？有限細(xì)胞系：是生長和壽命有限的細(xì)胞，經(jīng)過若干傳代培養(yǎng)后失去增殖能力，老化死亡。有限生長，無致瘤性，有接觸抑制性。e.g.2BS。壽命取決于細(xì)胞來源的物種和年齡、器官。胚成纖維細(xì)胞人（50代），雞胚（30代），小鼠（8代）無限細(xì)胞系：壽命和活性不受傳代次數(shù)影響的細(xì)胞系，可連續(xù)培養(yǎng)。也稱為永久細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系。沒有接觸抑制現(xiàn)象，對培養(yǎng)條件和營養(yǎng)因子等要求低，倍增時間短，非常適合于制藥工業(yè)生產(chǎn)。人源細(xì)胞系：Namalwa，WI-38，MRC-5哺乳動物細(xì)胞系：CHO，貼壁或懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲

19、透壓有較高的忍受能力。BHK-21，C127，Vero雜交瘤細(xì)胞系：脾臟B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞通過原生質(zhì)體融合，獲得的雜交細(xì)胞。無血清培養(yǎng)，高密度懸浮生長，容易轉(zhuǎn)染和生長，大量分泌和高效表達(dá)3. 與大腸桿菌和酵母系統(tǒng)相比，哺乳動物源細(xì)胞系統(tǒng)制藥的優(yōu)缺點，如何選擇？CHO細(xì)胞：Chinese hamster ovary，中國倉鼠卵巢，亞二倍體核型，2n=22。特點：貼壁型生長，也可懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。最為普遍和成熟表達(dá)糖基化蛋白藥物的細(xì)胞。多種衍生突變株，高表達(dá)。BHK-21細(xì)胞：成纖維樣細(xì)胞，非整倍體，2n=44.用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。C127細(xì)胞，貼壁生長，適

20、合于牛乳頭病毒DNA載體的轉(zhuǎn)化。Vero細(xì)胞：多倍體核型，貼壁依賴性。Vero6最為常用，增至病毒，生產(chǎn)疫苗。4. 工程動物細(xì)胞系的建立：基本過程，表達(dá)載體設(shè)計，轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)方案篩選和鑒定方法。它們與基因工程微生物的異同是什么？5. 動物細(xì)胞培養(yǎng)基組成成分及其作用是什么？與微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)基相比，有何特殊性？動物細(xì)胞培養(yǎng)基的成分主要有糖類、氨基酸、維生素與無機鹽、激素及附加成分。作用：糖類提供細(xì)胞生長的碳源和能源。分解后釋放出能量ATP。氨基酸可通過生糖或生酮途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛑舅幔g接提供能量。維生素既不是細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)，也不是能量物質(zhì)，對代謝和生長起調(diào)節(jié)和控制作用。無機鹽是細(xì)胞代謝所需酶的輔基

21、，同時保持細(xì)胞的滲透壓和緩沖PH的變化。激素對細(xì)胞的生長有刺激作用。貼附因子的作用是讓細(xì)胞的貼壁生長。6. 生產(chǎn)用最適動物細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)該選擇哪種，為什么？合成培養(yǎng)基，組分穩(wěn)定，容易配置。已有幾十種合成培養(yǎng)基，大部分已商品化7. 如何控制動物細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量？培養(yǎng)用水質(zhì)：必須按照GMP要求進行制備，除去普通水中的各類元素、有毒或有害物質(zhì)及微生物和熱源，達(dá)到純水標(biāo)準(zhǔn)。緩沖液：H2CO3/NaCHO3；NaH2PO4/Na2HPO4；恒定pH。平衡鹽溶液：BBS，由NaCl、無機鹽和葡萄糖、緩沖劑、指示劑組成。滿足細(xì)胞對鹽離子、碳營養(yǎng)要求；pH和滲透壓要求；直觀觀察pH。磷酸鹽緩沖液：PBS，KCl

22、、KH2PO4、NaCl、NaHPO4。培養(yǎng)物、器皿的洗滌液。氨基酸配置：50倍濃縮液。使用L型氨基酸，對于DL混合型氨基酸，使用量應(yīng)該加倍。谷氨酰胺不穩(wěn)定，需單獨配置（100倍濃縮液，-20保存）。8. 基質(zhì)依賴性與非依賴性細(xì)胞系對培養(yǎng)條件的要求有什么不同？如何滿足？貼壁依賴性細(xì)胞：依賴于生長基質(zhì)，并在表面才能生長的細(xì)胞。只能貼壁生長。多數(shù)天然細(xì)胞。非貼壁依賴性細(xì)胞：不依賴于生長基質(zhì)，可懸浮生長。淋巴細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞。生長基質(zhì)：改變介質(zhì)表面特性，支撐、促進動物細(xì)胞貼附的物質(zhì)。為支持介質(zhì)表面提供適量帶正電荷，細(xì)胞被吸附在介質(zhì)上。9. 細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有幾種方法，有何特點，如何選擇應(yīng)用？

23、單層貼壁培養(yǎng)。單層貼壁培養(yǎng)是指把細(xì)胞貼附于一定的固體支持表面上，生長形成單層細(xì)胞的培養(yǎng)方法，適合于貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)是指細(xì)胞在細(xì)胞反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮生長的培養(yǎng)過程，主要對于非貼壁性依賴性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞。微囊培養(yǎng)。把動物細(xì)胞包埋在微載體內(nèi)或膠囊內(nèi)固定化后，進行懸浮培養(yǎng)，適合于貼壁依賴性和非貼壁依賴性細(xì)胞。微載體培養(yǎng)。微載體是三維培養(yǎng)系統(tǒng)，有很大的比表面積，細(xì)胞貼附于載體上增值，再懸浮于細(xì)胞液中，兼具有貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點。10. 比較微生物發(fā)酵控制過程的異同動物細(xì)胞微生物溫度在線，恒溫，水套層，電熱片，加溫三基點，發(fā)酵熱對生長和生產(chǎn)影響，變溫控制，降溫攪拌，泡沫低轉(zhuǎn)速，

24、加剪切保護劑，消沫劑基于供氧與混合，化學(xué)消沫劑與分散劑，機械消沫溶解氧臨界氧濃度供氧與耗氧的平衡，臨界氧濃度之上CO2需要通入，調(diào)節(jié)pH尾氣，呼吸強度pH恒定，緩沖劑，通氣，補料，綜合控制三基點，變pH，加酸/堿；緩沖劑，補料代謝檢測與分析底物消耗，副產(chǎn)物生成，胞內(nèi)代謝，分泌底物消耗，產(chǎn)物的生成，生物化學(xué)變化補料補充營養(yǎng)，控制代謝過程解除底物抑制，增加前體放料解除副產(chǎn)物，收獲產(chǎn)物解除產(chǎn)物抑制重組人紅細(xì)胞生成素的生產(chǎn)工藝1. 比較各種表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)rhEPO的優(yōu)缺點。SV40病毒啟動子的表達(dá)載體，在COS-1中瞬時表達(dá)hEPO。昆蟲SF9細(xì)胞中桿狀病毒載體表達(dá)rhEPO。產(chǎn)率有所改善，糖基化程度較

25、小。家蠶系統(tǒng)表達(dá)，糖基化簡單，藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性較低、活性較差等問題。大腸桿菌表達(dá)，僅具體外抗原結(jié)合活性。干擾素-基因啟動子的rhEPO表達(dá)載體，BALL-1細(xì)胞，產(chǎn)生較高量的rhEPO。CHO、BHK細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，rhEPO與天然EPO結(jié)構(gòu)、活性相似。2. CHO培養(yǎng)生產(chǎn)rhEPO的基本工藝過程及其控制點是什么，為什么？復(fù)蘇：液氮凍存的CHO細(xì)胞系在37中水浴快速融化。無菌離心，棄上清。培養(yǎng)：加適量DMEM（10%小牛血清），37、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)傳三代。消化：用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞后，制成細(xì)胞濃度約為2.5×106個/ml。用于接種。反應(yīng)器滅菌：加纖維素載體片及pH7.0的

26、PBS緩沖液，高壓滅菌。接種：排出PBS緩沖液，加DMEM培養(yǎng)基（含10血清），接入種子細(xì)胞。貼壁培養(yǎng)：pH7，<50r/min，37，DO50-80%。擴增培養(yǎng)：80100r/min。pH7，37。 灌流培養(yǎng)：控制溫度、DO、pH值等培養(yǎng)條件，進行無血清培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)。收獲培養(yǎng)物：連續(xù)收獲，48保存。控制點：攪拌控制：接種后,攪拌速度緩慢，使細(xì)胞貼附于載體上，隨著細(xì)胞數(shù)量的增加逐漸提高攪拌速度。溫度控制：較為嚴(yán)格，恒定37pH值控制：7.2-7.4,輸入CO2和碳酸氫鹽溶液維持其恒定。溶解氧控制：在50-80的范圍內(nèi)，通入氧氣、空氣、氫氣或氮氣的比例混合氣體。葡萄糖控制：流加補料代謝廢

27、物控制：監(jiān)測銨、乳酸鹽類等，維持較低濃度，減少對細(xì)胞損害。3. rhEPO分離純化工藝中使用了哪些操作單元，為什么？收獲培養(yǎng)液、透析、過濾、DEAE離子交換、凝膠過濾。三廢處理工藝1. 簡述制藥企業(yè)清潔生產(chǎn)的途徑資源綜合利用原料資源的綜合利用、水資源的綜合利用、二次資源綜合利用、廢物綜合利用；改革工藝和裝備原料處理工藝的改革、產(chǎn)品制造工藝的全過程統(tǒng)籌、裝備技術(shù)的更新；改進操作和加強管理；必要的末端處理。2. 簡述制藥工業(yè)的末端污染特點制藥廠排出的污染物通常具有毒性、刺激性和腐蝕性?；瘜W(xué)制藥廠的污染物還具有數(shù)量少、組分多、變化大、間歇排放、pH不穩(wěn)定、COD高等特點。這些特點與防治措施的選擇有直

28、接關(guān)系。3. 制藥廢水分為哪幾種類型？有何特點？如何治理？含懸浮物或膠體的廢水。廢水中所含的懸浮物一般可通過沉淀、過濾或氣浮等方法除去。是廢水的常規(guī)預(yù)處理程序。氣浮法的原理：利用高度分散的微小氣泡作為載體去粘附廢水中的懸浮物，使其密度小于水(相對密度<1)而上浮到水面，從而實現(xiàn)固液分離。對于懸浮物質(zhì)：用沉淀、氣浮、過濾等方法去除。對于樹脂狀物：由于不易上浮和沉淀，須采用輔助手段（如通入壓縮空氣、直接蒸汽加熱、加入無機鹽等）使懸浮物聚集起來沉淀或氣浮分離。對于極小膠體：可用混凝法或吸附法處理。含酸堿性廢水。化學(xué)制藥過程中常排出各種含酸或堿的廢水，其中以酸性廢水居多。含酸濃度高的廢水應(yīng)考慮盡量回收利用及綜合利用，如利用廢硫酸制作磷肥等。含酸（堿）1%以下而沒有經(jīng)濟價值的廢水經(jīng)中和后才能排放，以免腐蝕排水管道，危害水中生物。中和時，盡量采用廢堿或廢酸，也可考慮用氨水中和，然后用于灌溉。若中和后的廢水水質(zhì)符合國家規(guī)定的排