WB詳細操作過程(共6頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上一、制膠1、 注意一定要將玻璃板洗凈，最后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干2、玻璃板干凈后，對著與膠接觸的面對其靠攏，整齊的夾到綠色架子里，再按照說明書，配制分離膠（分為兩塊的配制與一塊的配制）， 其中PAGE（解凍現(xiàn)拿現(xiàn)用，聚丙酰胺（4度冰箱冷藏），在加入分離膠之前用水檢驗是否漏水3、用槍頭，對好玻璃板的邊緣打下去，注意快速不要漏出去，液面要平，根據(jù)插梳子的位置，加入到一定高度，最后在加滿純水覆蓋其上，封膠4、靜置40min,將分離膠上的水倒出，觀察分離膠是否有較好的制作好5、配制濃縮膠（分為兩塊的配制與一塊的配制），配制好后迅

2、速的加入到玻璃板內(nèi)，并插上梳子，靜置30min6、結(jié)束后，將玻璃板取下，放入純水的盒子里，放入到4度冰箱內(nèi)備用二、提取蛋白1、取出六孔板，吸取原培養(yǎng)液丟棄，靠邊加入PBS洗滌（500ml），輕晃，吸取廢液丟棄，洗滌三次2、加入蛋白裂解液（視細胞數(shù)量而定） 加入裂解液之后，調(diào)小移液槍量程，反復(fù)摧打至培養(yǎng)皿底部全透明3、將產(chǎn)物吸入1.5ml的EP管，用震蕩機振蕩30s，冰浴10min，反復(fù)三次，取的兩支EP管標注蛋白名字）4、振蕩離心 13000轉(zhuǎn)，4度，5min5、用移液槍取離心后的上清液至新取的EP管，1.5ml 2支，注意名稱的對稱6、放入80度冰箱儲存三、蛋白定量測定1、準備工作：BCA工

3、作液、蛋白標準液、96孔板、冰盒、提取的蛋白2、按照說明書計算所需BCA工作液的量，A液：B液=50：13、在孔板蓋子上標記，加標準液（8個）與樣品的標記，在本子上寫好濃度梯度，對著位置加入標準液濃度0，1，2，4，8，12，16，20，之后在標準樣品的孔內(nèi)，用pbs加滿到20微升4、加完標準液，在對應(yīng)的孔里加樣品20微升，最后將配好的BCA液加入到標準液和樣品中各200微升，5、放在37度振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩孵育30分鐘6、提前將酶標儀打開7、時間到了之后，去將孔板拿出放入酶標儀中測蛋白：步驟：sessionnewnextuse defaultnext finish設(shè)置波長（526）出倉file

4、 wizard設(shè)置孔板數(shù)no.of unknowsadd and close左上角results左下方右鍵點（report/export)把左側(cè)中的data添加到右框點save to file 選擇儲存路徑保存 出倉放板、入倉、開始8、若沒有錯誤，則將剩余的蛋白根據(jù)比例1：4（ Loading buffer：蛋白）加入 Loading buffer9、孵育100度，5min，提前將電鍋浴打開10、完成后放入-80度四：樣品蛋白處理 準備：PBS，移液槍，1.5mlEP管 步驟：取出上樣樣品至1.5 ml離心管中，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超

5、過15 l，加樣孔的最大限度可加20 l樣品。）上樣前要將樣品于電浴鍋中煮5 min使蛋白變性。1、稀釋樣品：五、電泳準備：電泳液500ml （現(xiàn)配),蛋白膠，10微升移液槍與槍頭，樣品，maker,冰盒，電泳裝置步驟：1、將SDSPAGE膠放入電泳槽中，加足夠電泳液，電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。（短玻板向內(nèi)，長玻璃板面向外，對準電極：紅色為正極、黑色的為負極）2、上樣：用移液槍吸取樣品，并且吸出的樣品不要有氣泡，將加樣的槍頭插至加樣孔中緩慢加入樣品，先加入marker,根據(jù)蛋白濃度計算在后面的孔中加入蛋白樣品，在加入完樣品之后，最后一個孔中加入marker3、將電泳盒蓋上蓋子，第一次設(shè)置

6、 80V，跑30min，時間到之后觀察蛋白印跡是否marker的金黃色的條帶跑出之后，將電泳改為120V，跑1h30min4、在此時間內(nèi)準備電轉(zhuǎn)液 大燒杯中先倒300-400ml 去離子水，防止發(fā)熱，燒杯裂開； 100ml 10電轉(zhuǎn)液200 ml甲醇；去離子水定容到1000ml 六：轉(zhuǎn)膜準備：電轉(zhuǎn)液、鑷子、濾紙、PVDF膜、電轉(zhuǎn)裝置，冰盒步驟：1、在加有轉(zhuǎn)移液的盤里放入轉(zhuǎn)膜樣的夾子、一塊海綿墊2、PVDF膜在甲醇中浸泡30s，小心將膜放入電轉(zhuǎn)液中3、將夾子打開，根據(jù)情況將短玻璃拿開并保持水平，根據(jù)海綿墊的大小形狀4、要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒

7、玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于海綿墊上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將PVDF膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。5、夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在盆里放冰將轉(zhuǎn)移槽放進去。用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h。6、轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用七

8、、免疫反應(yīng) 1 .  將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。（提前配備封閉液，2.5g的奶粉，50毫升的PBST 搖勻后放入到4度下?lián)u床里備用）2、提前塑封口袋3、   將一抗用TBST稀釋至適當濃度（在1.5 ml離心管中）；取出備用的塑封口袋，加入抗體溶液，從封閉液中取出膜，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育12 h后，放入4度冰箱內(nèi)過夜4、次日，將膜拿出放在冰上，在盒子里倒PBST備用，用鑷子輕輕將膜夾出放入盒子中，在室溫內(nèi)搖床8min 5次5、在第三次搖床時準備二抗，從4度冰箱內(nèi)拿出相應(yīng)抗體備用，并拿出配二抗所用的25ml瓶子，準備移液槍和槍頭，按1：5000的比例加入二抗和封閉液，如：加10ml的奶封閉液、2微升的二抗，配完后搖勻，并放在搖床上和膜一起搖動6、完成后將盒子內(nèi)的水倒出，剩余的水用槍吸出，再用槍頭加入二抗，每個5ml再用振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40min7、拿出后，倒出二抗液體，加入PBST在室溫內(nèi)搖床8min 5次8、在第四次洗膜時，準備顯影的東西：盤子、鑷子、1000的移液槍、200微的移液槍、顯影杯，并提前開顯影的機器十 、化學(xué)發(fā)光，顯影1、在4度里拿顯影液，將黑和白兩種試劑1：1等體積混合；各加1ml，將膜蛋白面擺正放