小牛肝提取物對新生小鼠肝細(xì)胞損傷的影響

1、小牛肝提取物對新生小鼠肝細(xì)胞損傷的影響    【摘要】  目的 研究不同濃度的小牛肝提取物對新生小鼠肝細(xì)胞損傷的影響。方法 采用型膠原酶消化法制備游離肝細(xì)胞懸液，以低血清進(jìn)行肝細(xì)胞原代培養(yǎng)，1216 h后用0.1 mmol/L的H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，同時加以不同濃度的肝提取物，觀察(1001 000)mg/L的小牛肝提取物對肝細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果 小牛肝提取物在100 mg/L時即可起到保護(hù)肝細(xì)胞損傷的作用，但效果不明顯，在500 mg/L時可明顯保護(hù)肝細(xì)胞損傷，之后隨著濃度的加大保護(hù)作用逐漸減弱。結(jié)論 小牛肝提取物對H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷

2、具有一定的保護(hù)作用，其中以濃度為500 mg/L時效果最明顯。 【關(guān)鍵詞】  小牛肝提取物 H2O2 肝細(xì)胞培養(yǎng) 肝細(xì)胞損傷 保護(hù)作用Abstract：Objective  To study the effect of different concentrations of calf liver extract on the damage of the neonatal mice hepatocytes.   Methods  Hepatocytes were digested by IV-Collagenase and cultured wi

3、th low-serum medium, induced by H2O2 after 1216 h. Various concentrations of calf liver extract were added to the primary cultured hepatocytes to observe the effect of (1001 000) mg/L calf liver extract on the injured liver cell.  Results  Calf liver extract at 100 mg/L could protect the h

4、epatocytes from injury, but the effect was not obvious. At 500 mg/L, calf liver extract could protect the hepatocytes obviously. With increasing concentration, the protective effect weakened gradually.  Conclusions  Calf liver extract could  protect hepatocytes from damage induced by

5、H2O2, the effect at a concentration of 500 mg/L was the most obvious.    Key words：calf liver extract; H2O2; hepatocytes culture; hepatocytes injured; protective effect        小牛肝提取物以小牛肝為主要原料,經(jīng)物理方法提取的小分子蛋白質(zhì)，含有豐富的維生素B2、B12、葉酸、肝細(xì)胞刺激因子、嘌呤核苷和各種氨基酸，整體實驗已證

6、實對急性肝損傷具有保護(hù)作用1。為進(jìn)一步研究肝提取物的保肝作用，本文采用型膠原酶消化法分離肝細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，用H2O2體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷模型，在細(xì)胞水平上證實小牛肝提取物對肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，為生物藥的研發(fā)和應(yīng)用提供可靠依據(jù)。    1  材 料1.1  實驗動物 昆明株13 d新生小鼠，雌雄不限（遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供）1.2  藥品與試劑 小牛肝提取物；D-Hanks液；型膠原酶（美國Sigma公司）；RPMI-1640（北京賽馳生物科技有限公司）；青霉素100 g/mL，鏈霉素100 g/mL；H2

7、O2、胎牛血清（錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板；MTT試劑盒、ALT試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所）    2  方 法2.1  小牛肝提取物的制備取1 kg小牛肝，按文獻(xiàn)2的方法制備提取物。提取物呈微黃色粘稠狀液體，味腥；照分光光度法測定，在285 nm 的波長處有最大吸收；pH值應(yīng)為6.07.5；-20 保存。2.2  新生小鼠肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)    按文獻(xiàn)3 ，將乳鼠于75%酒精中浸洗10 s后斷頭處死，迅速取出肝臟置于含有雙抗的4 的D-Hnaks液中漂洗去除

8、血污，剝除被膜和血管等纖維成份，用剪刀將肝組織剪成1 mm3左右的小塊，再倒入4 D-Hanks液試管中，吸管吹打，待組織沉淀后吸出上清，如此反復(fù)3次后，加入0.2%型膠原酶，4 冰箱放置67 h。消化完全者可用吸管吹打散開，懸液經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾,得到懸液中加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，于4 冰箱中靜置30 min，多數(shù)上皮細(xì)胞沉于管底，而血細(xì)胞及碎片仍多浮于懸液中，棄懸液，加入RPMI-1640培養(yǎng)基，以1 000 r/min離心4 min，反復(fù)3次，最后加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，以1×106 cell/mL接種于培養(yǎng)板。10 h后首次換液，換以5%胎牛血清的培養(yǎng)基

9、，36 h后再次換液，并降低胎牛血清含量至1%，培養(yǎng)48 h后，采用無血清培養(yǎng)。2.3  肝提取物對H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的影響    按文獻(xiàn)4，取上述原代培養(yǎng)48 h肝細(xì)胞，設(shè)正常對照組、H2O2損傷模型組、肝提取物(100，500，700，1 000 mg/L)22254個劑量保護(hù)組。模型組和保護(hù)組加入H2O2 0.1 mmol/L5，同時保護(hù)組加入不同濃度的肝提取物，正常對照組加不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，收集96孔板中培養(yǎng)上清液檢測ALT活性，收集肝細(xì)胞測定MDA含量和SOD活力，MTT比色法測定96孔板中肝細(xì)胞的存活率。2.4 

10、 肝細(xì)胞存活率的測定    采用MTT比色法。使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)，施加處理因素，加入終濃度為5 g/L MTT液20 L/孔37 孵育4 h。終止培養(yǎng)前，輕輕吸棄上清培養(yǎng)液（勿吸走結(jié)晶），之后加入DMSO 150 L/孔，均勻振蕩15 min使結(jié)晶完全溶解，以DMSO為空白調(diào)零，測定570 nm波長處各組各孔的吸光度（A570）。細(xì)胞增殖越多越快，則吸光度越高；細(xì)胞毒性越大，則吸光度越低。并按公式：細(xì)胞存活率（實驗組A值 / 對照組A值）× 100%計算細(xì)胞存活比例。2.5  ALT的測定    采用賴氏

11、法。各組分別取大鼠肝細(xì)胞上清樣本1 mL于EP管內(nèi) ，按照試劑盒說明書步驟操作。505 nm波長，蒸餾水調(diào)零，測定吸光度，測定管吸光度減去對照管吸光度之差，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得相應(yīng)的值A(chǔ)LT/GPT活力單位進(jìn)行計算。以U/mL表示結(jié)果。2.6  MDA含量的測定    常規(guī)培養(yǎng)，加處理因素，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，取上清使用分光光度計（532 nm,蒸餾水調(diào)零）比色，測定吸光度。按以下公式計算MAD含量：MDA含量（測定管吸光度測定空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度） ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×測試前稀釋倍數(shù)(其中標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10 nm

12、ol/mL)。肝細(xì)胞MDA含量的結(jié)果以nmol/mL表示。2.7  SOD活性測定    常規(guī)培養(yǎng)，加處理因素。根據(jù)SOD對超氧陰離子自由基有專一抑制作用的原理，使超氧陰離子自由基氧化羥胺形成亞硝酸鹽減少，吸光度值降低。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入樣品和各種試劑，混勻，37 恒溫水浴40 min，加入顯色劑后混勻，室溫放置10 min，使用分光光度計（550 nm，蒸餾水調(diào)零）比色，測定吸光度。按以下公式計算SOD活力：    SOD活力（U/mL）(對照管吸光度測定管吸光度)/對照管吸光度÷50×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)。2.8  統(tǒng)計學(xué)處理    各組實驗數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS11.5軟件完成，采用方差分析及q檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。P<0.05 認(rèn)為結(jié)果有差異；P<0.01 認(rèn)為結(jié)果有顯著性差異。    3  結(jié)果3.1  肝提取物對肝細(xì)胞存活率的影響  &#