分子排阻色譜法(測定多糖分子量及其分布)--梁翠榮

1、分子排阻色譜法分子排阻色譜法測定多糖分子量及其分布分離原理分離原理 凝膠滲透色譜 Gel Permeation Chromatography GPC 也稱體積排阻色譜 Size Exclusion Chromatography SEC 讓被測量的高聚物溶液通過一根內(nèi)裝不同孔徑的色譜柱，柱中可供分子通行的路徑有顆粒間的間隙（較大）和顆粒內(nèi)的微孔（較?。?。當(dāng)聚合物溶液流經(jīng)色譜柱時，大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時移動的速度較快（即保留時間短）；小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，洗脫時移動的速度要慢得多（即保留時間長）。

2、經(jīng)過一定長度的色譜柱，分子根據(jù)相對分子大小被分開，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)。 測定方法測定方法l直接法：在測定淋出液濃度的同時，測定其粘度或光散射，從而求出其分子量。l間接法：用一組分子量不等的、單分散的試樣為標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別測定它們的淋出體積（保留時間），建立保留時間與分子量二者之間的關(guān)系，從而求出其分子量。間接法間接法 右旋糖酐分子量對照品（ 供右旋糖酐分子量測定用 中檢所） 右旋糖酐分子量D1 M 2500 ； 右旋糖酐分子量D2 M 4600 ； 右旋糖酐分子量D3 M 7100； 右旋糖酐分子量D4 M 10000； 右旋糖酐分子量D5 M 21400；右旋糖酐分子量D6 M 4

3、1100 ； 右旋糖酐分子量D7 M 84400； 右旋糖酐分子量D8 M 133800； 右旋糖酐分子量D0 M 180； 右旋糖酐分子量D2000 M 2000000校正原理 用已知相對分子質(zhì)量的單分散標(biāo)準(zhǔn)聚合物做一條淋洗體積或淋洗時間和相對分子量對應(yīng)關(guān)系曲線，稱為“校正曲線”。聚合物中幾乎找不到單分散的標(biāo)準(zhǔn)樣，一般用窄分布的試樣代替。在相同的測試條件下，做一系列的GPC標(biāo)準(zhǔn)譜圖，以重均分子量的對數(shù)值(lgM)對保留時間(t)作圖，所得曲線即為“校正曲線”。通過校正曲線，就能從GPC譜圖上計算各種所需相對分子量與相對分子量分布的信息。色譜柱 各種色譜柱的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和

4、最小極限。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，就會全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進(jìn)入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果。因此，色譜柱有一定的使用范圍。色譜柱的選用 親水性球型高聚物為填充劑（TSK G PWXL柱, Shodex OHpak SB HQ柱） 右旋糖酐鐵 TSK G2500 PWXL 右旋糖酐20 TSK G3000 PWXL 右旋糖酐40 TSK G4000 PWXL 右旋糖酐70 TSK G4000 PWXL檢測系統(tǒng) 多糖的檢測，最

5、常用的檢測器為示差折光檢測器（通用型檢測器）。通過連續(xù)地測定淋出液折光指數(shù)的變化來測定樣品的濃度，只要溶劑的折光指數(shù)與被測樣品的折光指數(shù)有區(qū)別均能檢測。 測定方法l色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 TSK G PWXL柱 柱溫35 進(jìn)樣量20l 流動相：0.71%硫酸鈉溶液(內(nèi)含0.02%疊氮化鈉) 0.5ml/min l取葡萄糖和葡聚糖2000，分別加流動相制成10mg/ml 的溶液，進(jìn)樣,測得保留時間tT和t0，對照品溶液和供試品溶液的保留時間均應(yīng)在tT和t0之間，理論板數(shù)按葡萄糖峰計算不小于5000。l對照品溶液：取右旋糖酐分子量對照品(中檢所) 適量，分別加流動相制成10mg/ml 的溶液，室溫放置過夜。l供試品溶液： 取供試品適量，加流動相制成10mg/ml 的溶液，室溫放置過夜。l測定法：取對照品溶液，進(jìn)樣，用GPC軟件計算回歸方程。取供試品溶液，同法測定，用GPC軟件算出供試品的重均分子量及分子量分布。 注意事項注意事項l1.在連接色譜柱之前，應(yīng)該預(yù)先用即將使用的流動相置換以前用過的流動相，注意控制流動相的流速，別超壓（適用的壓力范圍說明書上很詳細(xì)）。l2.與常規(guī)的HPLC法相同，使用時流動相和樣品過濾干凈。l3.色譜柱用后用水沖洗，連接的檢測器也要沖洗。絕對不能讓鹽保存