慢性馬兜鈴酸腎病大鼠模型腎組織中蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)

1、慢性馬兜鈴酸腎病大鼠模型腎組織中蛋白質(zhì)組的差異表達(dá) 作者：孫世仁，陳光磊，寧曉暄,陳威 【關(guān)鍵詞】 馬兜鈴酸；大鼠；腎組織；雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質(zhì)組Differentially expressed proteins in renal tissues of rat models of chronic aristolochic acid nephropathy【Abstract】 AIM: To establish the 2dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE) profiles from aristolochic

2、 acid nephropathy (AAN) rat renal tissues and normal renal tissues and to identify the differentially expressed proteins. METHODS: Establish chronic renal interstitial fibrosis model in rats by peritoneal injection with aristolochic acid (AA). The total proteins from AAN models and normal rat renal

3、tissues were separated by 2D PAGE. The differentially expressed proteins in 2DPAGE maps were analyzed using image analysis software. RESULTS: The rat models of AAinduced chronic renal interstitial fibrosis were established successfully. Clear, wellresolved and reproducible 2D PAGE patterns of AAN mo

4、dels and normal rat renal tissues were obtained and many differentially expressed proteins were found. CONCLUSION: The differentially expressed proteins of renal tissues can be induced by AA in Wistar rats. These proteins maybe mediate the toxicity of aristolochic acid to renal tissues.【Keywords】 ar

5、istolochic acid; rats; renal tissues; 2D PAGE; proteome【摘要】 目的： 制備慢性馬兜鈴酸腎病的大鼠模型，建立馬兜鈴酸腎病大鼠腎組織和正常大鼠腎組織的雙向電泳圖譜，從而展示差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步篩選介導(dǎo)馬兜鈴酸毒性作用的蛋白質(zhì)分子奠定基礎(chǔ). 方法：應(yīng)用馬兜鈴酸腹腔注射制備大鼠慢性馬兜鈴酸腎病模型，提取其腎組織中總蛋白質(zhì)，采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對模型組和正常組腎組織中蛋白質(zhì)進(jìn)行差異展示. 結(jié)果：成功制備了慢性馬兜鈴酸腎病大鼠模型，并建立了模型組和正常組大鼠腎組織的雙向電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)了差異蛋白質(zhì). 結(jié)論：馬兜鈴酸導(dǎo)致大鼠腎組織中蛋

6、白質(zhì)差異表達(dá)，這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能介導(dǎo)了馬兜鈴酸的毒性作用.【關(guān)鍵詞】 馬兜鈴酸；大鼠；腎組織；雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質(zhì)組【中圖號(hào)】 R587.10引言自Vanhrweghem等1報(bào)道了因減肥藥引起“中草藥腎?。–hinese herbs nephropathy，CHN）”以來，含馬兜鈴酸成分的中草藥所致的腎損害馬兜鈴酸腎?。╝ristolochid)，共16 wk. 在用藥開始后第8，12，16，20，24 wk分別處死6只大鼠. 正常對照組（n=5）：每只大鼠腹膜內(nèi)注射生理鹽水2 mL/d，共16wkPAGE電泳：預(yù)先制備垂直電泳用凝膠，將進(jìn)行完IEF并平衡后的膠條轉(zhuǎn)移至凝膠的上

7、方，用10 g/L熱瓊脂糖溶膠封固. 在PROTEAN II Xi垂直電泳槽的上下槽中加入電極緩沖液后按照預(yù)設(shè)程序進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)前沿距下緣0.5 cm時(shí)停止電泳. 最后參照BioRad推薦的硝酸銀染色方法進(jìn)行染色. 凝膠通過Imagescanner掃描儀以及LabScan掃描軟件進(jìn)行掃描獲取圖像，利用PDQUEST圖像分析軟件對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，圖像分析包括蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測、編輯、背景扣除和點(diǎn)的匹配等.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 10.0軟件和Excel上進(jìn)行.2結(jié)果2.1慢性馬兜鈴酸腎病模型的鑒定馬兜鈴酸組用藥后8 wk，腎小球、腎小管間質(zhì)、腎血管均未見損害；用藥后12

8、 wk，腎小球未見改變，部分腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生空泡變性；用藥后16 wk，腎臟近曲小管上皮細(xì)胞明顯腫脹，管腔縮小，并伴有部分腎小管上皮細(xì)胞壞死及凋亡；20 wk時(shí)腫脹的小管上皮細(xì)胞逐漸縮小，部分遠(yuǎn)曲小管出現(xiàn)擴(kuò)張，個(gè)別腎小管萎縮，但未見間質(zhì)出現(xiàn)纖維化；24 wk時(shí)可見較多腎小管出現(xiàn)萎縮，腎間質(zhì)出現(xiàn)多灶性纖維化（圖1）.2.2馬兜鈴酸誘導(dǎo)的大鼠腎組織中蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)根據(jù)馬兜鈴酸處理后大鼠不同時(shí)間腎組織病理改變的結(jié)果提示，腎臟于12 wk開始出現(xiàn)早期的病變，因此取12 wk時(shí)的腎組織進(jìn)行雙向電泳. 在二維平面上將小鼠腎臟組織蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，得到2D電泳圖譜（圖2），正常對照組和馬兜鈴酸腎病模型組

9、的匹配率為83.4%，有大量蛋白質(zhì)點(diǎn)相對含量增加或降低，或新出現(xiàn)，其中87個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在模型組比正常組上調(diào)2倍，18個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)5倍以上，73個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào)2倍. 部分表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)數(shù)據(jù)見表1，其中蛋白質(zhì)點(diǎn)1271，1823和2001在正常組弱表達(dá)，而在模型組高表達(dá)；蛋白質(zhì)點(diǎn)1567和1789在正常組中無表達(dá)，而在模型組出現(xiàn)表達(dá)；蛋白質(zhì)點(diǎn)1398在模型組中表達(dá)低于正常組.圖1正常對照組和馬兜鈴酸組大鼠腎組織Masson 400（略）圖2馬兜鈴酸大鼠腎組織的雙向電泳圖（略）表1正常組和馬兜鈴酸腎病模型組部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)（略）3討論我國學(xué)者早在1964年就發(fā)現(xiàn)了木通致急性腎衰（ARF）的病例，但

10、由于僅為個(gè)例報(bào)道，無臨床與病理分析，故未引起重視. 由于一些常用中草藥及中成藥都含有馬兜鈴酸，如關(guān)木通、廣防己、青木香、天仙藤、馬兜鈴、尋骨風(fēng)、朱砂蓮及龍膽瀉肝丸、二十五味松石丸、十香返生丸、大黃清胃丸、小兒金丹片、止咳化痰丸、分清五淋丸、安陽精制膏、導(dǎo)赤丸、婦科分清丸、純陽正氣丸、冠心蘇合丸、排石顆粒、跌打丸等，因而由馬兜鈴酸引起的腎損害在臨床上十分常見. 北京中日友好醫(yī)院報(bào)道，由馬兜鈴酸引起的慢性AAN占其全科慢性腎小管間質(zhì)疾病的80%，此病很可能是我國最常見的慢性腎小管間質(zhì)疾病2, 目前尚無有效的治療. 因此，尋找出馬兜鈴酸導(dǎo)致腎臟損害的始動(dòng)分子，進(jìn)而早期診斷和治療（在蛋白質(zhì)或基因水平進(jìn)

11、行干預(yù)和阻斷）將是解決馬兜鈴酸腎損害的關(guān)鍵，也正是我們的研究目標(biāo).差異蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要方面，它是著重于尋找和篩選多個(gè)樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜,揭示細(xì)胞生理和病理狀態(tài)的進(jìn)程與本質(zhì)、對外界環(huán)境刺激的反應(yīng)途徑以及細(xì)胞調(diào)控機(jī)制,同時(shí)獲得對某些關(guān)鍵蛋白的定性和功能分析，因此差異蛋白質(zhì)組學(xué)為一些疾病的病因?qū)W和治療學(xué)的研究提供了很好的思路. 雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)是當(dāng)前分離鑒定蛋白質(zhì)的兩大支柱技術(shù). Kennedy7利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了慶大霉素處理組蛋白質(zhì)所發(fā)生的特異性的變化，結(jié)果得到了一些新的蛋白質(zhì)標(biāo)志物. Aicher等8利用該技術(shù)分析了環(huán)孢菌素A處理后鼠的腎臟，鑒別出一種新的鈣結(jié)合蛋白，而該蛋白可能作為腎臟毒性的一個(gè)新的標(biāo)志物. 差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究同樣也適用于中藥毒性分子靶點(diǎn)的篩選和鑒定. 為此，我們在建立慢性馬兜鈴酸腎病模型的基礎(chǔ)上用雙向電泳技術(shù)篩選和比較模型動(dòng)物腎組織中馬兜鈴酸誘導(dǎo)的差異蛋白質(zhì)分子，為進(jìn)一步尋找馬兜鈴酸導(dǎo)致腎損害的分子靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ).我們利用雙向電泳系統(tǒng)，對馬兜鈴酸誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化早期（12 wk）大鼠模型的腎組織和正常大鼠腎組織進(jìn)行蛋白差異展示，軟件分析顯示雙向電泳圖譜的匹配率可達(dá)83.4%，同時(shí)出現(xiàn)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)，提示這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能參與馬兜鈴酸腎損害早期過程，可能是毒性作用的始動(dòng)分子. 我們還需對這些差異蛋白質(zhì)分子進(jìn)行