谷氨酸搖瓶發(fā)酵

1、谷氨酸搖瓶發(fā)酵 班級(jí)：生物工程* 姓名：* 學(xué)號(hào)：200900* 指導(dǎo)老師：黃*摘要谷氨酸主要用來生產(chǎn)味精，是索遜1856年發(fā)現(xiàn)的。谷氨酸的生物合成包括糖酵解作用（EMP途徑）、戊糖磷酸途徑（HMP途徑）、三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）、乙醛酸循環(huán)和丙酮酸羧化支路（CO2固定反應(yīng)）?，F(xiàn)在谷氨酸生產(chǎn)菌主要是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細(xì)菌。影響谷氨酸發(fā)酵過程的參數(shù)有很多，谷氨酸發(fā)酵過程主要受種子質(zhì)量，培養(yǎng)基組成，溫度，pH以及供氧速率等因素控制。關(guān)鍵詞：谷氨酸，發(fā)酵，生物合成途徑，生產(chǎn)菌種，影響因素。AbstractMost of the Glutamic acid is used t

2、o produce aginomoto.It was discovered by Sorson in 1856. Glycolytic pathway,pentose phosphat epathway,tricarboxylic acid cycle,glyoxylate cycle and pyruvate carboxylase branch are included in the pathway of biosynthesis of glutamic acid.Presently Corynebacterium，Brevibacterium，Microbacterium and Art

3、hrobacterium are used to produced Glutamic . microorganism.The state of glutamic fermentation depends on many parameters and variables，e.g，the quality of seeds ，medium composition，temperature of fermentation，pH of broth and supply rate of oxygen. Key word：glutamic，fermentation，biosynthetic pathway，p

4、roducing strains，influencing factors.前沿谷氨酸是氨基酸的一種，主要用于生產(chǎn)谷氨酸鈉，即味精。谷氨酸是生物機(jī)體內(nèi)氮代謝的基本氨基酸之一，在代謝上具有重要意義。不論在食品、化妝品，還是在醫(yī)藥行業(yè)，谷氨酸都具有很大的用途。谷氨酸在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程中占據(jù)重要地位。味精被使食用后，經(jīng)胃酸作用轉(zhuǎn)化為谷氨酸，被消化吸收后構(gòu)成蛋白質(zhì)，并參與體內(nèi)其他代謝過程，有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。谷氨酸食用后，有96%在體內(nèi)被吸收，其余經(jīng)氧化后在尿中排出。味精的生理作用如下：（1）合成人體代謝所需要的其他氨基酸 谷氨酸雖非人體必需的氨基酸，但它在生物體蛋白質(zhì)代謝中是一種很活躍的物質(zhì)。谷

5、氨酸通過轉(zhuǎn)氨反應(yīng)吧氨基酸轉(zhuǎn)移到酮酸上，合成人體代謝所需要的其他氨基酸。（2）作為難組織的能源和改善腦機(jī)能 腦組織只能氧化谷氨酸，而不能氧化其它氨基酸。谷氨酸能與蛋白質(zhì)的分解代謝中所產(chǎn)生的氨基酸相結(jié)合，能起腦組織的能源作用，他能通過血腦屏障，因此，谷氨酸對(duì)改進(jìn)和維持腦機(jī)能是必要的。谷氨酸對(duì)于防治腦震蕩或腦神經(jīng)損傷亦有一定療效。長(zhǎng)期適當(dāng)?shù)胤霉劝彼幔商岣呱窠?jīng)有缺陷兒童的智力。（3）谷氨酸有降低血液中氨中毒的作用 當(dāng)肝臟有疾病，肝功能受損時(shí)，血液中氨含量增高，引起嚴(yán)重的氨代謝紊亂，導(dǎo)致肝昏迷。而谷氨酸能與氨起作用，生成谷氨酰胺，境地血液中氨含量，從而起著解“氨毒”的作用。1987年3月17日至23

6、日在荷蘭海牙召開的聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）食品添加劑專家聯(lián)合委員會(huì)第十九次會(huì)議，對(duì)該委員會(huì)1973年確立的味精ADI量：120mg/kg體重，即每50kg體重的人，每天允許食用6g這一規(guī)定作了重大修改，宣布取消對(duì)味精的食用限量，但保留了12周以下嬰兒搖慎用的意見。本文將用天津短桿菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，并分析殘?zhí)橇?，OD值以及谷氨酸產(chǎn)量。1. 材料與方法1.1準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)器皿： 帶10mL刻度的比色管24支，離心管12個(gè)，槍頭滅菌并烘干約200支，滅菌移液管1mL 5支。1.2菌種制備：實(shí)驗(yàn)室提供。1.3培養(yǎng)基配制及接種斜面培養(yǎng)基配制 葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g牛肉膏

7、0.5g，氯化鈉0.125g，瓊脂0.8，PH7.0。配制完后分裝五支試管，塞上軟塞，牛皮紙包扎。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 分別稱量葡萄糖70/80/90各兩份于貼有標(biāo)簽的大三角瓶中，每瓶加入玉米漿0.54g，0.144gMgSO4，0.18gKH3PO4，0.63gK2H2PO4，20%尿素過濾除菌，分裝26ml/500ml三角瓶。相關(guān)試劑的配制 0.9%生理鹽水：稱取0.9g氯化鈉溶于蒸餾水并定溶至100ml. 50%葡萄糖配法：稱取50g葡萄糖溶解于蒸餾水中并定溶至100ml，用于補(bǔ)料。 20%尿素：稱取22g尿素溶于蒸餾水閉關(guān)定溶至100ml。 3mol/L鹽酸：取12mol/L濃鹽酸令鹽酸：水

8、為1:3配制100.。 2mol/L氫氧化鈉：稱取8g氫氧化鈉溶解于蒸餾水中并定溶至100ml。滅菌 將配制好的試劑（尿素除外）于115下滅菌30min。1.4轉(zhuǎn)接活化斜面 將菌種TG866轉(zhuǎn)接畫滿斜面，32培養(yǎng)20h。1.5搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵搖瓶接種 開無菌操凈臺(tái)紫外燈30min，取三支已經(jīng)長(zhǎng)滿菌種的斜面培養(yǎng)基試管，用滅菌移液管分別吸取1mL已滅菌的生理鹽水加入試管，反復(fù)沖洗斜面，直至將菌種全部洗脫下來為止。 向已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基加入1.2mL尿素，用2mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH7.27.5，將菌種按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，九層紗布封口，240rmp，32搖瓶發(fā)酵40h。測(cè)定OD620值

9、測(cè)定0h的OD值。每隔3h測(cè)定一次OD值。 在無菌臺(tái)取樣0.5mL至離心管中，8000r/min離心3min，上清液用于測(cè)定殘?zhí)橇亢凸劝彼岙a(chǎn)量（0h除外），沉淀稀釋于10mL比色管中，用722光柵分光光度計(jì)在620nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值。菌種OD值可以反映菌體的濃度，通過菌體的濃度可知菌種生長(zhǎng)情況。殘?zhí)橇亢凸劝彼崃康臏y(cè)定 取中上清液100µL于10mL比色管中，用蒸餾水稀釋至刻度，用生物傳感分析儀測(cè)定殘?zhí)橇亢凸劝彼崃俊?生物傳感分析儀使用方法：開機(jī)后，進(jìn)樣針用蒸餾水洗兩次，再用標(biāo)準(zhǔn)液潤(rùn)洗兩次，吸取標(biāo)準(zhǔn)液25µL打入進(jìn)樣口，進(jìn)樣要一秒內(nèi)完成，進(jìn)完樣后觀察分析儀上的“進(jìn)樣”指示

10、燈，若指示燈一直亮則表明已經(jīng)標(biāo)定好，若指示燈一直閃，則重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣，直至進(jìn)樣等不閃并一直亮著。一般需要標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣三次以上。補(bǔ)料 葡萄糖70兩瓶測(cè)量前先每瓶加入0.5mL葡萄糖溶液，然后測(cè)量，當(dāng)葡萄糖含量低于30時(shí)，按30時(shí)加入0.5mL葡萄糖的比例加入葡萄糖。2、谷氨酸發(fā)酵機(jī)制 谷氨酸的生物合成途徑主要有： Glucose的酵解，EMP Glucose的有氧氧化，HMP 丙酮酸的有氧氧化，TCA循環(huán) 乙醛酸循環(huán)途徑，DCA循環(huán) 二氧化碳固定反應(yīng) KGA的還原氨基化 這六條途徑之間是相互聯(lián)系和相互制約的，如圖所示：谷氨酸產(chǎn)生菌大多數(shù)為生物素缺陷型,谷氨酸發(fā)酵時(shí),通過控制生物素亞適量(貧乏量)

11、,引起菌種代謝失調(diào), 使谷氨酸得到大量積累。此外，菌種能利用CO2 產(chǎn)生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸的大量積累。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：3.1 OD值測(cè)定 通過對(duì)葡萄糖70g/L加酵母膏、葡萄糖70g/L加玉米漿、葡糖糖100g/L加酵母膏、葡萄糖100g/L加酵母膏定時(shí)取發(fā)酵液測(cè)OD值，繪出OD曲線為： OD值是反應(yīng)菌體濃度，通過菌體濃度可知菌體生長(zhǎng)情況。0h時(shí)的OD值理論上四條曲線應(yīng)該基本在同一點(diǎn)，但圖可以看出，葡萄糖70g/L加酵母膏的菌體在0h時(shí)含量較其它三瓶多，可能的原因是接種先后及菌種在接種進(jìn)搖瓶時(shí)的濃度造成影響。由圖可以看出，曲線1、3、4接種后0至9h就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，9至24小時(shí)進(jìn)入了

12、平穩(wěn)期，隨后1、4就進(jìn)入了衰亡期。 3.2谷氨酸測(cè)定 四瓶培養(yǎng)基中，只有第二瓶葡萄糖70g/L加玉米漿的產(chǎn)谷氨酸。繪出其OD值、殘?zhí)橇亢凸劝彼岙a(chǎn)量入圖下： 由圖可以看出，谷氨酸產(chǎn)量隨時(shí)間穩(wěn)定上升，最高產(chǎn)量為20。通過OD值曲線和谷氨酸產(chǎn)量曲線，可以看出，谷氨酸從0至6小時(shí)是斜率最高，菌種的量在下降，葡萄糖含量也在下降，說明，當(dāng)培養(yǎng)基里的營(yíng)養(yǎng)比較充分時(shí)，谷氨酸產(chǎn)量是最高的。谷氨酸產(chǎn)生菌大多數(shù)為生物素缺陷型,谷氨酸發(fā)酵時(shí),通過控制生物素亞適量(貧乏量) ,引起菌種代謝失調(diào), 使谷氨酸得到大量積累。產(chǎn)生菌體內(nèi)乙醛酸循環(huán)（DCA）的關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶，該酶是一種調(diào)節(jié)酶，或稱為別構(gòu)酶，其活性可以通過某

13、種方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過該酶酶活性的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)DCA循環(huán)的封閉DCA循環(huán)的封閉式實(shí)現(xiàn)G。糖的代謝才能沿著 - 酮戊二酸的方向進(jìn)行, 從而有利于谷氨酸的積累。4.實(shí)驗(yàn)總結(jié)在谷氨酸發(fā)酵中，如果能改變細(xì)胞膜的通透性，是谷氨酸不斷地排到細(xì)胞外面，就會(huì)大量生成谷氨酸。葡萄糖70g/L加酵母膏中菌體生長(zhǎng)很好，但谷氨酸產(chǎn)量低。據(jù)研究表明，細(xì)胞膜的通透性直接影響谷氨酸產(chǎn)量。此外，有幾個(gè)因素對(duì)谷氨酸產(chǎn)量產(chǎn)生影響：（1） 溫度對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響 （2） 溶氧對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響 （3） 生物素對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響 生物素的主要作用是作為乙酰輔酶A的輔酶影響磷脂的合成，進(jìn)而影響谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞膜的通透性，同時(shí)也影響細(xì)菌的代

14、謝途徑。目前，企業(yè)多采用添加玉米漿、糖蜜或純生物素等形式控制生物素的亞適量。5.參考文獻(xiàn)1 賀小賢.生物工藝原理M.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007年12月2 陳寧.氨基酸工藝學(xué)M.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2008年3月附：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)12月24日 周一8：30培養(yǎng)基pH值加尿素/ml測(cè)OD值殘?zhí)橇縢/L谷氨酸產(chǎn)量g/L1231212酵母膏1號(hào)7.0 0.50.830 0.8310.832535522酵母膏2號(hào)7.0 0.50.800 0.8030.802575522葡70（加酵母膏)1號(hào)5.81.0 1.2061.2051.205181732葡70（加玉米漿）2號(hào)5.41.50.8940.8940

15、.89530303312月24日 周一11:30培養(yǎng)基pH值加尿素/ml補(bǔ)糖/mL測(cè)OD值殘?zhí)橇縢/L谷氨酸產(chǎn)量g/L1231212酵母膏1號(hào)7.20.200.9260.9270.926757222酵母膏2號(hào)8.0 000.8880.890 0.890 676322葡70（加酵母膏)1號(hào)6.90.301.2771.2761.278302932葡70 2號(hào)8.0 00.50.860 0.8590.85530285512月24日 周一14:30培養(yǎng)基pH值加尿素/ml補(bǔ)糖/mL測(cè)OD值殘?zhí)橇縢/L谷氨酸產(chǎn)量g/L1231212酵母膏1號(hào)7.5001.0051.0131.011373811酵母膏2號(hào)

16、7.20.200.9570.960 0.963434311葡70（加酵母膏)1號(hào)6.21.21.51.3471.4011.350 151522葡70 2號(hào)7.700.50.8480.8510.84927269812月24日 周一17:30培養(yǎng)基pH值加尿素/ml補(bǔ)糖/mL測(cè)OD值殘?zhí)橇縢/L谷氨酸產(chǎn)量g/L1231212酵母膏1號(hào)7.0 0.501.0541.0521.057353511酵母膏2號(hào)7.5000.9770.9720.963414111葡70（加酵母膏)1號(hào)6.50.851.251.4171.4151.414181922葡70 2號(hào)6.70.751.00 0.9520.950.94

17、82424101112月24日 周一 20:30培養(yǎng)基pH值加尿素/ml補(bǔ)糖/mL測(cè)OD值殘?zhí)橇縢/L谷氨酸產(chǎn)量g/L1231212酵母膏1號(hào)7.500.50.9950.9940.996373722酵母膏2號(hào)7.20.201.0141.0081.007333412葡70（加酵母膏)1號(hào)6.70.7511.400 1.3991.400 242533葡70 2號(hào)8.0 010.9460.9450.9463334121222:00培養(yǎng)基補(bǔ)糖/ml加尿素/mL酵母膏1號(hào)00酵母膏2號(hào)00葡70（加酵母膏)1號(hào)5.0 2.0 葡70 2號(hào)3.50.712月25日周二 8:30培養(yǎng)基pH值加尿素/ml補(bǔ)糖/mL測(cè)OD值殘?zhí)橇縢/L谷氨酸產(chǎn)量g/L1231212酵母膏1號(hào)6.4001.2031.2031.204252154酵母膏2號(hào)6.4001.220 1.219