Cre_Loxp系統(tǒng)的應(yīng)用及進(jìn)展

1、作者簡(jiǎn)介 :任榮榮 (1981.11-, 女 , 碩士。研究方向 :電壓門(mén)控性鈉離子通道 1亞基在神經(jīng)病理性疼痛中的 作用。*通訊作者 :Tel :021 65790000, E mail :wangyingwei ·綜述 ·Cre/Loxp系統(tǒng)的應(yīng)用及進(jìn)展任榮榮 綜述 王英偉 審校(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院麻醉科, 上海 200092關(guān)鍵詞 Cre 重組酶; Loxp 位點(diǎn); 轉(zhuǎn)基因技術(shù); Cre/Loxp系統(tǒng)中圖分類(lèi)號(hào) Q812文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1008 1836(2008 02 0078 03隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展, 轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)揮 著越來(lái)越重要的作用

2、, 已經(jīng)滲透到人類(lèi)生活的各個(gè) 領(lǐng)域。所謂轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是將人工分離和修飾過(guò)的 基因?qū)氲缴矬w基因組中, 由于導(dǎo)入基因的表達(dá) 從而引起生物體性狀可遺傳的修飾。轉(zhuǎn)基因技術(shù)推 動(dòng)了從分子水平了解生命現(xiàn)象、 探討生命本質(zhì)、 研究 疾病發(fā)生機(jī)理等方面的發(fā)展。國(guó)內(nèi)外在動(dòng)物轉(zhuǎn)基因 技術(shù)方面均已開(kāi)展了卓有成效的工作。其中小鼠轉(zhuǎn) 基因研究方面成就最大、 發(fā)展最為迅速、 應(yīng)用最為廣 泛的就是應(yīng)用 Cre/Loxp系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行基因的敲 除、 激活、 倒轉(zhuǎn)和易位等。1Cre/Loxp系統(tǒng)的概述Cre/Loxp重組系統(tǒng)策略是進(jìn)行基因組定點(diǎn)突變 的新途徑 1,2。該系統(tǒng)在 80年代被引入后, 已被成功 的應(yīng)用于酵母菌、

3、 植物、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及小鼠身 上。 Cre/Loxp重組系統(tǒng)包括 Cre 重組酶和 Loxp 位點(diǎn) 兩個(gè)部分, Cre 重組酶由大腸桿菌噬菌體 P1的 Cre 基 因編碼, 由 343個(gè)氨基酸組成, 它不僅具有催化活 性, 而且跟限制酶相似, 識(shí)別特異的 DNA 序列, 如: Loxp 位點(diǎn), 引起重組。Loxp 位點(diǎn)是 Cre 重組酶作用的特異性重組位 點(diǎn) , 由 34bp 組 成 , 即 :ATAACTTCGTATAGCATA CATTATACGAAGTTAT , 兩個(gè) 13bp 的反向重復(fù)順序 和 8bp 的間隔區(qū)域構(gòu)成。 Cre 重組酶有 70%的重組 效率, 不借助任何輔助因子

4、, 作用于多種結(jié)構(gòu)的 DNA 底物, 如線(xiàn)形、 環(huán)狀, 甚至超螺旋 (被 Cre 重組酶 解螺旋成為線(xiàn)形結(jié)構(gòu) 1,3。 Cre 重組酶通過(guò)與 DNA 上 Loxp 位點(diǎn)的結(jié)合, 發(fā)揮其重組作用 1。 2Cre/Loxp系統(tǒng)的應(yīng)用Cre/Loxp重組系統(tǒng)可在哺乳類(lèi)細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因鼠 中因 Loxp 位點(diǎn)設(shè)計(jì)的不同而產(chǎn)生特異性重組 4 6。 其應(yīng)用主要包括基因失活或敲除、 基因激活、 基因顛 換、 基因易位, 還可以利用此系統(tǒng)進(jìn)行載體的構(gòu)建。 2.1內(nèi)、 外源基因失活或敲除相對(duì)傳統(tǒng)的基因突變技術(shù), Cre/Loxp系統(tǒng)借助 Cre 重組酶表達(dá)的特異性, 條件性敲除基因, 大大降 低了小鼠的死亡率。具體

5、分三部分:(1 在胚胎干細(xì)胞 (embryonic stem cell , ES cell 中通過(guò)置換型載體進(jìn)行同源重組, 向基因組靶位點(diǎn) 引入選擇標(biāo)記基因, 并在其兩側(cè)引入兩個(gè)同向排列 的 Loxp 位點(diǎn)。兩條同源染色體都帶有 Loxp 位點(diǎn)且 引入的 Loxp 位點(diǎn)不能干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄。將該 ES 細(xì)胞打入假孕母鼠中, 發(fā)育成 “ floxed 小鼠” 。但要 保證 “ floxed 小鼠” 表型要跟野生型小鼠一致。 (2 利用原核注射的方法獲得轉(zhuǎn)基因 “ Cre 小 鼠” 。此轉(zhuǎn)基因小鼠在特定的啟動(dòng)子下表達(dá) Cre 重 組酶, 其 Cre 酶的重組效率可以用其他的工具鼠 (如 Rosa2

6、6 檢測(cè)。(3 “ Cre 小鼠” 跟 “ floxed 小鼠” 交配, Cre 重組酶會(huì) 切掉 Loxp 位點(diǎn)之間的靶基因和 1個(gè) Loxp 位點(diǎn), 從而達(dá) 到靶基因的失活或敲除 4 7。 2006年, Berton 等 8利用 上述方法把大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (brain derived neurotrophic fac tor,BDNF 的局部表達(dá)降低, 產(chǎn)生類(lèi)似 長(zhǎng)期服用抗抑郁藥的抗抑郁效果, 從而證明了 BDNF 參與到神經(jīng)環(huán)路和行為可塑性的過(guò)程中。2.2基因激活利用 Cre/Loxp系統(tǒng)不僅可對(duì)基因進(jìn)行敲除, 還 可對(duì)基因進(jìn)行特定激活, 了解基因的正向效應(yīng)。在 兩個(gè)同向 Loxp

7、 位點(diǎn)之間加入終止信號(hào), Loxp 位點(diǎn)后 加入靶基因, 與 Cre 小鼠交配后, Cre 重組酶切除終78第 2期 任榮榮, 等. Cre/Loxp系統(tǒng)的應(yīng)用及進(jìn)展止信號(hào)及 1個(gè) Loxp 位點(diǎn), 其 Loxp 位點(diǎn)后面的靶基因 便被 “激活” 表達(dá)。 Hnasko 等 9選用多巴胺缺陷的 小鼠, 在表達(dá)內(nèi)源性酪氨酸羥化酶基因的前面加了1個(gè) Loxp pgk neo Loxp , (pgk 為酪氨酸羥化酶的終 止信號(hào), neo 為篩選標(biāo)記 , 正常情況下, 小鼠表達(dá) pgk , 后面的酪氨酸羥化酶不表達(dá); 在小鼠尾狀核注 入 Cre 重組酶的情況下, Cre 重組酶切掉終止信號(hào) pgk 和

8、1個(gè) Loxp 位點(diǎn), 酪氨酸羥化酶便表達(dá), 尾狀核 部位生成多巴胺, 從而研究神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺在這個(gè) 部位的功能。2.3基因插入采用同源重組技術(shù), 在基因組上人工構(gòu)建兩個(gè) Loxp 位點(diǎn), 借助構(gòu)建的兩個(gè) Loxp 位點(diǎn), 把兩端帶有 Loxp 位點(diǎn)的外源基因重組到基因組上, 此種重組是 雙向的, 既可以把外源基因重組到小鼠基因組內(nèi), 也 可把小鼠基因組內(nèi)源基因重組出來(lái), 這是定點(diǎn)整合 的重要手段之一。2.4基因倒轉(zhuǎn)在同一染色體上構(gòu)建兩個(gè)相反的 Loxp 位點(diǎn), 在 Cre 重組酶的作用下, Loxp 位點(diǎn)之間的靶基因反方 向倒轉(zhuǎn)。2.5基因易位在不同染色體上分別構(gòu)建 1個(gè) Loxp 位點(diǎn),

9、在 Cre 重組酶的作用下, Loxp 位點(diǎn)后面的基因發(fā)生重組, 不同染色體上大片段基因互相交換, 染色體易位。 Testa 等 10利用此原理進(jìn)行了如下操作:首先, 利用 同源重組的方法在 13號(hào)染色體 DEK 基因的內(nèi)含子 加入 Loxp 位點(diǎn)及篩選標(biāo)記 hygro (潮霉素 ; 其次, 利 用同樣的方法在二號(hào)染色體 CAN 基因的內(nèi)含子加 入篩選標(biāo)記 neo (新霉素 及 Loxp 位點(diǎn); 最后, 在 Cre 重組酶的作用下, DEK 基因片段與 CAN 基因片段交 換, 產(chǎn)生 DEK CAN 融合基因, 實(shí)現(xiàn)基因易位。 3Cre/loxp系統(tǒng)的新進(jìn)展80年代 Cre/Loxp系統(tǒng)的時(shí)間

10、與空間的控制依賴(lài) 于 Cre 的啟動(dòng)子, 現(xiàn)在發(fā)展為依賴(lài)于受體與配體的 結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)其時(shí)間、 空間的控制。目前, 可從兩個(gè)水平進(jìn)行調(diào)控, 即:轉(zhuǎn)錄水平和 翻譯后水平。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控以四環(huán)素 (抑制 控制 系統(tǒng)為例 11:在沒(méi)有四環(huán)素的情況下, 轉(zhuǎn)錄激活蛋 白與轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因相結(jié)合, 激活后面 Cre 重組 酶的表達(dá); 在四環(huán)素存在的情況下, 四環(huán)素與轉(zhuǎn)錄激 活蛋白相結(jié)合, 使其不能結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因, 從而達(dá)到了抑制的目的。翻譯后水平以雌激素系統(tǒng)為 例:2007年, Bradley 等 12在 scl 基因的啟動(dòng)子或加 強(qiáng)子 0.9E3后面加上 1個(gè) Cre er (er 表達(dá)雌激素他莫 西

11、酚的受體 的基因, Cre 基因就可以按照 scl 基因的 表達(dá)方式表達(dá), 從而得到 “ Cre er 工具小鼠” 。在正 常情況下 “ Cre er 工具小鼠” 不表達(dá) Cre 重組酶, 使用 雌激素他莫昔酚 (tamoxifen 誘導(dǎo)才能表達(dá) Cre 重組 酶。這只 scl Cre er 小鼠可以與其他的 “ Loxp 小鼠” 進(jìn)行交配, 交配的后代可以在特定時(shí)間注入雌激素tamoxifen , 與雌激素受體結(jié)合后, 表達(dá) Cre 酶, 就可以 對(duì)后代小鼠的 Loxp 位點(diǎn)進(jìn)行重組。為了避免體內(nèi) 雌激素的干擾, 可對(duì)雌激素受體基因的配體結(jié)合區(qū) 做一定程度的改變, 使其只能和某些雌激素衍生物

12、 相結(jié)合, 確保條件重組的特異性?，F(xiàn)在不僅用 Cre/Loxp系統(tǒng)進(jìn)行基因的失活或敲 除、 基因激活、 基因顛換、 基因易位, 還可以用其構(gòu)建 高效表達(dá)的載體。 2007年, 王文棋等 13利用此系統(tǒng) 構(gòu) 建 了 1個(gè) 高 效 表 達(dá) 綠 色 熒 光 蛋 白(Green fluorescent protein , GFP 的載體。在 Cre 酶的作用 下, 把 gfp 基因先從基因供體 pTLG 上切下來(lái), 然后通 過(guò)重組把 gfp 整合到基因受體 pET Loxp 受體上, 完 成 gfp 基因高效表達(dá)載體 pET gfp 的構(gòu)建, 從而使繁 瑣的傳統(tǒng)載體構(gòu)建變?yōu)楹?jiǎn)單的酶促反應(yīng), 極大地簡(jiǎn)

13、化了載體構(gòu)建步驟, 免去為構(gòu)建載體選擇酶切位點(diǎn) 的繁瑣, 為 Cre 酶在基因克隆和亞克隆中的應(yīng)用提 供了很好的研究基礎(chǔ)。利用 Cre/Loxp系統(tǒng)進(jìn)行遺傳操作具有顯著的優(yōu) 勢(shì), 許多學(xué)者對(duì)此已進(jìn)行了大量的研究工作, 此系統(tǒng) 被廣泛應(yīng)用于小鼠的轉(zhuǎn)基因研究中。 Cre/Loxp系統(tǒng) 短小精悍、 Cre 酶作用專(zhuān)一, 且不影響基因的正常表 達(dá)與調(diào)控, 該系統(tǒng)的應(yīng)用為轉(zhuǎn)基因技術(shù)開(kāi)辟出一條 嶄新的道路。參考文獻(xiàn)1Trinh KR , Morrison SL. Site specific and directional gene replacement mediated by Cre recombina

14、se J . Journal of Immunological Methods , 2000, 244(1:185 193. 2王友亮, 楊 曉 . 小鼠染色體工程的研究進(jìn)展J . 生物 工程學(xué)報(bào), 2002, 18(3:272 275.3Huang CF , Huang PT , Yang X. Progress of gene targeting in mouse J . 科學(xué)通報(bào) (英文版 , 2001, 46(4:265 271. 4Ruff CG , Kieffer BL. Conditional gene targeting in the mouse nervous system:

15、Insights into brain function and diseases J . Pharmacology &Therapeutics , 2007, 113(3: 79廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) (J GZMC 2008, 36(2619 634.5Brusa R. Genetically modified mice in neuropharmacology J . Pharmacol Res , 1999, 39(6:405 419.6Lewandoski M. Conditional control of gene expression in the mouse J . Nat R

16、ev Genet , 2001, 2(10:743 755. 7Wells T , Carter DA. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents:towards a comprehensive strategy J . J Neurosci Methods , 2001, 108(2:111 130. 8Berton O , McClung CA , Dileone RJ , et al. Essential role of BDNF in the mesolimbic dopamine pathway in s

17、ocial defeat stress J . Science , 2006, 311(5762:864 868. 9Hnasko TS , Perez FA , Scoura AD , et al. Cre recombinase mediated restoration of nigrostriatal dopamine in dopamine deficient mice reverses hypophagia and bradykinesia J . Proc Natl Acad Sci USA , 2006, 103(23:8858 8863. 10Testa G , Stewart

18、 AF. Creating a transloxation Engineering interchromosomal translocations in the mouse J . Embo Rep , 2000, 1(2:120 121.11Imayoshi I , Ohtsuka T , Metzger D , et al. Temporal regulation of Cre recombinase activity in neural stem cells J . Genesis , 2006, 44(5:233 238.12Bradley CK , Takano EA , G öthert JR , et al. Temporal Regulation of Cre Recombinase Activity in Scl Positive Neurons of the Central Nervous System genes