第八章酶定向進(jìn)化

1、1/1692/1693/1694/169(1) 從大量未知的生物種系中尋找 生物體系之所以能夠相對(duì)獨(dú)立地存在于自然界中，并維持其獨(dú)立性和生命的延續(xù)性，都是因?yàn)樯矬w內(nèi)的一系列酶在發(fā)揮著作用。 酶保證了生物體內(nèi)組成生命活動(dòng)的大量生化反應(yīng)得以按照預(yù)定的方向有序、精確而順利地進(jìn)行，幾乎所有生物的生理現(xiàn)象都與酶的作用緊密相關(guān)，可以這樣說(shuō)，沒(méi)有酶的存在，就沒(méi)有生物體的一切生命活動(dòng)。 天然酶的作用5/1696/1697/1698/1699/16910/16911/169理性設(shè)計(jì)示意圖12/16913/16914/16915/16916/16917/16918/16919/16920/16921/169酶基

2、因隨機(jī)突變構(gòu)建突變基因文庫(kù)篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶反復(fù)進(jìn)行易錯(cuò)PCRDNA 重排基因家族重排平板篩選法熒光篩選法噬菌體表面展示法細(xì)胞表面展示法核糖體表面展示法高通量篩選定向選擇22/16923/16924/16925/16926/16927/169酶性質(zhì)突變方法枯草桿菌蛋白酶E有機(jī)相活性/穩(wěn)定性易錯(cuò)PCR-內(nèi)酰胺酶總活力/底物專一性DNA改組枯草桿菌蛋白酶BPN穩(wěn)定性 盒式誘變對(duì)硝基苯酯酶底物專一性/有機(jī)相活性易錯(cuò)PCR/DNA改組 胸腺嘧啶核苷激酶底物專一性盒式誘變-半乳糖苷酶底物專一性DNA改組綠色熒光蛋白熒光DNA改組核酶底物專一性易錯(cuò)PCR/DNA改組天冬氨酸酶活性與穩(wěn)定性隨機(jī)/

3、定位誘變藥物和疫苗活性/專一性/最佳表達(dá)DNA改組28/16929/16930/16931/169第二節(jié) 酶基因體外隨機(jī)突變環(huán)境樣品產(chǎn)酶微生物的篩選微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶蛋白的分離純化酶蛋白的氨基酸序列的測(cè)定微生物的分子鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找酶蛋白序列酶蛋白序列比對(duì)及保守區(qū)確定設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物并擴(kuò)增保守區(qū)序列酶基因32/1698.2 酶基因體外隨機(jī)突變多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR是由美國(guó)科學(xué)家33/169體內(nèi)DNA的復(fù)制體系 34/169引物引物引物引物35/169dATPdATPdTTPdTTPdGTPdGTPdCTPdCTPMgMg2+2+模板：DNA引物：P1 P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反應(yīng)緩沖液輔

4、助因子：Mg2+36/169PCR反應(yīng)循環(huán)37/16938/16939/169隨機(jī)突變方法特點(diǎn)易錯(cuò)PCR技術(shù)error-prone PCR從酶的單一基因出發(fā)，在特定的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使堿基配對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)誤而引起基因突變基因重排技術(shù)DNA shuffling從兩條以上的正突變基因出發(fā)，經(jīng)過(guò)酶切和不加引物的PCR擴(kuò)增，使堿基序列重新排布而引起基因突變基因家族重排技術(shù)DNA family shuffling從基因家族的若干基因出發(fā)，經(jīng)過(guò)酶切和不加引物的PCR擴(kuò)增，使堿基序列重新排布而引起基因突變40/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法41/169易錯(cuò)PCR具體反應(yīng)條件要根據(jù)進(jìn)化目的、DNA

5、聚合酶種類和模版情況等多次試驗(yàn)而確定。8.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法-易錯(cuò)PCR技術(shù)42/16943/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法-易錯(cuò)PCR技術(shù)44/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法-易錯(cuò)PCR技術(shù)45/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法-易錯(cuò)PCR技術(shù)46/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法-易錯(cuò)PCR技術(shù)47/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法48/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法- DNA重排技術(shù)49/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法- DNA重排技術(shù)50/169DNA重排技術(shù)原理圖1. DNaseI產(chǎn)生隨機(jī)片段；產(chǎn)生隨機(jī)片段；2. 隨機(jī)片段變

6、性；隨機(jī)片段變性；3. 隨機(jī)片段復(fù)性；隨機(jī)片段復(fù)性；4. 延伸延伸 反復(fù)重復(fù)反復(fù)重復(fù)2-4步后，可獲得全長(zhǎng)步后，可獲得全長(zhǎng)DNA片段片段 8.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法- DNA重排技術(shù)51/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法- DNA重排技術(shù)52/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法- DNA重排技術(shù)DNA重排技術(shù)的改進(jìn) （1）53/1691個(gè)引物個(gè)引物2個(gè)模板個(gè)模板退火結(jié)合退火結(jié)合延伸產(chǎn)生短片段延伸產(chǎn)生短片段短片段為引物與短片段為引物與模板退火結(jié)合模板退火結(jié)合繼續(xù)延伸片段至繼續(xù)延伸片段至全長(zhǎng)的基因長(zhǎng)度全長(zhǎng)的基因長(zhǎng)度分離全長(zhǎng)基因，分離全長(zhǎng)基因，加入外源引物擴(kuò)加入外源引物擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。

7、增全長(zhǎng)基因。8.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法- DNA重排技術(shù)54/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法- DNA重排技術(shù)DNA重排技術(shù)的改進(jìn) （1）-交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)55/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法- DNA重排技術(shù)DNA重排技術(shù)的改進(jìn) （2）56/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法- DNA重排技術(shù)DNA重排技術(shù)的改進(jìn) （2）-隨機(jī)引物體外重組技術(shù)57/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法- DNA重排技術(shù)DNA重排技術(shù)的改進(jìn) （2）-隨機(jī)引物體外重組技術(shù)58/1698.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法（三）基因家族重排技術(shù)59/169uDNA shuffling與Fam

8、ily shuffling：基本過(guò)程大致相同出發(fā)基因不同8.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法-基因家族重排技術(shù)60/169當(dāng)以單一的酶分當(dāng)以單一的酶分子基因進(jìn)行定向子基因進(jìn)行定向進(jìn)化時(shí)進(jìn)化時(shí), , 基因的基因的多樣化起源于多樣化起源于易易錯(cuò)錯(cuò)PCRPCR 等反應(yīng)中等反應(yīng)中產(chǎn)生的產(chǎn)生的隨機(jī)突變隨機(jī)突變, , 所以采用這種過(guò)所以采用這種過(guò)程累積有益突變程累積有益突變的的速度比較慢速度比較慢。 從自然界中存在的從自然界中存在的基因家族基因家族出出發(fā)發(fā), , 利用它們之間的同源序列利用它們之間的同源序列進(jìn)行進(jìn)行DNA DNA 改組。由于每一個(gè)天改組。由于每一個(gè)天然酶的基因都經(jīng)過(guò)千百萬(wàn)年的然酶的基因都經(jīng)過(guò)千

9、百萬(wàn)年的進(jìn)化進(jìn)化, , 并且基因之間存在并且基因之間存在比較比較顯著的差異顯著的差異, , 所以獲得的重組所以獲得的重組基因庫(kù)充分體現(xiàn)了基因庫(kù)充分體現(xiàn)了基因的多樣基因的多樣化化，排除了不必要的突變，大，排除了不必要的突變，大大加速了基因的體外進(jìn)化速度。大加速了基因的體外進(jìn)化速度。DNA shufflingFamily shuffling8.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法-基因家族重排技術(shù)61/169單鏈化單鏈化限制性限制性內(nèi)切酶內(nèi)切酶消化消化Dnase I 消化消化無(wú)外源引物無(wú)外源引物PCR重組基因庫(kù)重組基因庫(kù)片段化片段化同源基因同源基因常規(guī)常規(guī)PCR3種基因家族改組方法原理圖種基因家族改組方法

10、原理圖1.常規(guī)基因家族改組。常規(guī)基因家族改組。2.單鏈單鏈DNA介導(dǎo)的基因家族改組。介導(dǎo)的基因家族改組。3.限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因家族改組限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因家族改組3種基因家族改組方法獲得的突變種基因家族改組方法獲得的突變基因多樣性比較基因多樣性比較 Kikuchi采用后采用后2種改組方法，從種改組方法，從兒兒茶酚茶酚2,3-雙加氧酶雙加氧酶的的2個(gè)同源基因出個(gè)同源基因出發(fā)發(fā), 對(duì)其進(jìn)行體外定向進(jìn)化的研究。對(duì)其進(jìn)行體外定向進(jìn)化的研究。最終篩選到的進(jìn)化酶在最終篩選到的進(jìn)化酶在50的的半衰半衰期期分別比兩種天然酶延長(zhǎng)分別比兩種天然酶延長(zhǎng)12和和26倍。倍。1007550250123產(chǎn)生的雜合基

11、因百分比產(chǎn)生的雜合基因百分比8.2.2 基因體外隨機(jī)突變方法-基因家族重排技術(shù)62/16963/169突變基因基因載體重組DNA突變基因文庫(kù)目的基因進(jìn)化酶基因重組組裝篩選表達(dá)64/1698.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建65/1698.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建66/1698.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建67/169（一）構(gòu)建基因文庫(kù)的質(zhì)量要求8.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建68/1698.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建69/1698.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建（二）構(gòu)建突變

12、基因文庫(kù)的主要過(guò)程70/1698.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建（二）構(gòu)建突變基因文庫(kù)的主要過(guò)程-載體選擇71/169質(zhì)粒載質(zhì)粒載體特點(diǎn)體特點(diǎn)1.有自主的有自主的復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)2.兩種以上的易于檢測(cè)兩種以上的易于檢測(cè)的的選擇性標(biāo)記選擇性標(biāo)記3.多種限制性內(nèi)切核酸多種限制性內(nèi)切核酸酶的單一酶的單一酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)4.4.適合適合小片段小片段DNADNA的重組的重組8.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建（二）構(gòu)建突變基因文庫(kù)的主要過(guò)程-載體選擇（1）質(zhì)粒載體72/169(2686 bp)73/1698.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建（二）構(gòu)建突變

13、基因文庫(kù)的主要過(guò)程-載體選擇74/16975/1698.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建（二）構(gòu)建突變基因文庫(kù)的主要過(guò)程-載體選擇76/1698.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建（二）構(gòu)建突變基因文庫(kù)的主要過(guò)程-載體選擇黏粒載體的基本屬性77/1698.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建（二）構(gòu)建突變基因文庫(kù)的主要過(guò)程-載體選擇黏粒載體78/1698.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建（二）構(gòu)建突變基因文庫(kù)的主要過(guò)程-載體選擇79/1698.3.1 酶基因突變的定向選擇-突變基因文庫(kù)的構(gòu)建（二）構(gòu)建突變基因文庫(kù)的主要過(guò)程-載體選擇80

14、/16981/1698.3.2 酶基因突變的定向選擇-基因重組82/1698.3.2 酶基因突變的定向選擇-基因重組83/16984/1698.3.2 酶基因突變的定向選擇-基因重組85/16986/1698.3.2 酶基因突變的定向選擇-基因重組87/169兩端加接頭88/1691972年，斯坦福大學(xué)的年，斯坦福大學(xué)的P. Labban和和P. Kaiser提出。提出。同聚加尾同聚加尾 法法 修飾末端連接（1）-人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶能在沒(méi)有模板的情況下能在沒(méi)有模板的情況下給給DNA的的3-OH端端加上脫氧核苷酸。加上脫氧核苷酸。原理：原理：分別給載體和插入片

15、斷加上分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的互補(bǔ)的核苷酸。核苷酸。加尾加尾堿基互補(bǔ)堿基互補(bǔ)8.3.2 酶基因突變的定向選擇-基因重組89/169缺點(diǎn)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：能把任何能把任何片段連接片段連接起來(lái)起來(lái)不能把不能把插入片插入片段再切段再切下來(lái)。下來(lái)。非酶切位點(diǎn)非酶切位點(diǎn)90/169用用T4 DNA連接酶連到平端連接酶連到平端DNA上，然上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。 linker用化學(xué)合成法合成的一段用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限的特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的平端雙鏈平端雙鏈。GGAATTCC CCTTAAGGEco

16、RI linker： linker的作用的作用8.3.2 酶基因突變的定向選擇-基因重組修飾末端連接（2）-銜接物(linker)連接91/169u 92/169u 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來(lái)。）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來(lái)。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段切下完整的插入片段2）能給載體連接上）能給載體連接上Polylinker:u優(yōu)點(diǎn)：8.3.2 酶基因突變的定向選擇-基因重組94/1691978年康奈爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。年康奈爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 BamHI adapt

17、er用用T4DNA連接酶連到連接酶連到DNA分子的兩分子的兩端，直接成為人工粘性末端。端，直接成為人工粘性末端。 adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。切位點(diǎn)序列）。 adapter的作用的作用8.3.2 酶基因突變的定向選擇-基因重組修飾末端連接（3）- DNA接頭 (adapter)連接法95/169Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG G

18、GCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接頭自我連接接頭自我連接96/16997/169接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，影響與影響與DNA片段的連接。片段的連接。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。連上后就能用。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：先用小牛腸先用小牛腸堿性磷酸酶堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，）處理接頭，水解掉其水解掉其5端的磷酸，防止自我連接。端的磷酸，防止自我連接。 （以后再用（以后再用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶加上磷酸。）加上磷酸。）防止自我連接防止自我連接8.3.2 酶基因突變的定向選擇-基因重組98/1695p-GA

19、TCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！ 5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP處理處理-OHHO-99/1698.3.3 酶基因突變的定向選擇(三)構(gòu)建突變基因文庫(kù)100/169E. coli感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)制備感受態(tài)制備0，0.1MCaCl2加入質(zhì)粒加入質(zhì)粒42熱激熱激90 s，立即冰浴立即冰浴富裕培養(yǎng)富裕培養(yǎng)抗性篩選抗性篩選LB-抗生素抗

20、生素8.3.3 酶基因突變的定向選擇-構(gòu)建突變基因文庫(kù)101/169102/1698.3.3 酶基因突變的定向選擇-構(gòu)建突變基因文庫(kù)103/169104/169突變基因文庫(kù)質(zhì)粒載體噬菌體載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因篩選8.3.4 酶基因突變的定向選擇-突變基因的篩選105/1698.3.4 酶基因突變的定向選擇-突變基因的篩選106/169細(xì)菌細(xì)菌誘發(fā)突變的誘發(fā)突變的因素因素5050 0 0C C培培養(yǎng)養(yǎng)突變體庫(kù)突變體庫(kù)選擇壓力選擇壓力耐受型突變體耐受型突變體一定濃度的一定濃度的-內(nèi)酰胺類抗生內(nèi)酰胺類抗生素素8.3.4 酶基因突變的定向選擇-突變基因的篩選107/1698.3.4 酶基因突變的定向選擇

21、-突變基因的篩選108/169（二）高通量篩選技術(shù)109/1698.3.4 酶基因突變的定向選擇-突變基因的篩選高通量篩選方法110/169111/169AmN2H112/169 -galactosidaseuBlue/ white screening or Lac selection誘導(dǎo)物：IPTG底物：X-gal113/169114/169115/169Homogenized activated sludge sample cultured on 1/10-strength LB plates amended with CPQP and viewed with (A) white ligh

22、t and (B) fluorescent light revealing colony with halo (arrow 1) and no halo (arrow 2). 116/169uStarch agar AmylaseuSpirit blue agar LipaseuMethylene blue tributyrin Lipase uSkim milk agar Caseinase uNutrient gelatin deep Gelatinase uDNase agar methyl green DNase 117/169豆豉纖溶酶安全性能好，溶栓能力強(qiáng)，而且無(wú)毒副作用，不引起內(nèi)

23、出血，半衰期長(zhǎng)。 118/169119/169120/169熒光素酶熒光素酶121/169該蛋白質(zhì)在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色螢光122/169A fusion of green fluorescent protein (GFP), calmodulin, and M13 Upper part: Structure of Ca2+-saturated GCaMP2 monomerLower part: Structure of calcium-free GCaMP2. 123/169124/169125/169126/169127/169128/169(a)Schematic of

24、M13 phage with phage DNA modified to display a protein or peptide as a fusion to the coat protein pIII.(b)Representation of M13 phage with nanoparticles (black spheres) nucleated onto pIII (dark blue). (c)Schematic of a metal- or semiconductor-binding peptide is displayed on coat protein pVIII129/16

25、9噬菌體展示庫(kù)建立過(guò)程重組：重組：不同基因分別被插不同基因分別被插入噬菌體基因組中入噬菌體基因組中分離純化：分離純化：純化噬菌體只純化噬菌體只是展示一個(gè)蛋白，多肽或者是展示一個(gè)蛋白，多肽或者抗體?？贵w。文庫(kù)建成：文庫(kù)建成：收集所有的噬收集所有的噬菌體就構(gòu)成一個(gè)文庫(kù)將噬菌菌體就構(gòu)成一個(gè)文庫(kù)將噬菌體文庫(kù)與靶蛋白相互作用，體文庫(kù)與靶蛋白相互作用，篩選能與靶蛋白相互作用的篩選能與靶蛋白相互作用的噬菌體噬菌體130/169131/169pIIIForeign DNAMediating protein gene132/169133/169134/169135/169136/169137/169138/16

26、9139/169ag1Ag1aga2aga1Aga1Aga2S SMAT細(xì)胞中ag1基因編碼-凝集素（-agglutinin）Ag1。MATa細(xì)胞中aga1和aga2基因分別a-凝集素的兩個(gè)亞基Aga1、Aga2，二者通過(guò)2對(duì)二硫鍵連接。MAT細(xì)胞和MATa可以通過(guò)Ag1和Aga2的相互作用發(fā)生凝集作用（agglutination），在細(xì)胞交配中起到重要作用。-cella-cell140/169141/169142/169143/169144/169145/169146/169147/169148/169149/169150/169Flolp C端端GPI 錨定系統(tǒng)錨定系統(tǒng)Flolp N端絮凝結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)端絮凝結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)151/169152/169153/169uGra