谷胱甘肽作為脂質(zhì)過氧化損傷指標的研究

1、谷胱甘肽作為脂質(zhì)過氧化損傷指標的研究    谷胱甘肽(GSH)是廣泛存在于細胞內(nèi)的小分子三肽化合物，它參與細胞內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運、糖代謝和DNA合成調(diào)節(jié)，在拮抗外源性毒物、氧自由基損傷、調(diào)節(jié)機體免疫功能、維持細胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、抑制細胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用1。多年來，人們試圖根據(jù)GSH被氧化還原的程度來評估氧自由基脂質(zhì)過氧化損傷，并取得了不少進展。 一、谷胱甘肽的一般生理特性 GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，是細胞內(nèi)呈液態(tài)、含巰基最為豐富的一類化合物，半胱氨酸氨基上的-SH為該分子化合物活性中心。GSH在不同臟器濃度不同，以肝內(nèi)最高，依次為脾、腎、

2、肺、腦、心、胰和骨髓，血液中濃度最低2；同一器官不同部位濃度相差亦較大，而同一細胞內(nèi)不同細胞器間GSH含量亦不一致。 谷胱甘肽氧化型(GSSG)為GSH的氧化形式，在氧化劑作用下GSH通過GSH-過氧化物酶（GSH-Px）氧化成GSSG；后者通過NADPH供氫，在谷胱甘肽還原酶（GSH-Rx）作用下又還原成GSH，二者構(gòu)成一動態(tài)平衡，使GSSG維持在總GSH量的110水平3，構(gòu)成一有效的抗氧化系統(tǒng)。生理狀態(tài)下，GSH/GSSG維持在高比率，而在氧化應(yīng)激時，GSH氧化成GSSG，GSH/GSSG比率下降，故可借以評估脂質(zhì)過氧化損傷情況。 GSH合成主要在肝內(nèi)，其合成除與半胱氨酸及NADPH含量有

3、關(guān)外，其合成限速酶谷胱甘肽合成酶（GCS）亦有重要作用。GCS有2個亞基GCLR和GCLS，以GCLR為主，GCLS起調(diào)節(jié)作用。在氧化狀態(tài)，GCLR的mRNA高表達且有劑量依賴性，而低水平GSH對GCLR的mRNA影響則不明顯；相反，抑制GSH-Rx后，GCLR的mRNA則高表達，提示GSSG對GCLR有調(diào)節(jié)作用，并進而反饋性調(diào)節(jié)GSH水平4。GSH清除主要在腎臟，占血循環(huán)總量5065，雙腎動脈中80的GSH和GSSG經(jīng)一次腎循環(huán)后被濾過，但可經(jīng)Na+-依賴性GSH酶轉(zhuǎn)運系統(tǒng)重吸收。 二、GSH拮抗自由基脂質(zhì)過氧化損傷機理 GSH在拮抗氧化性毒物中發(fā)揮重要作用，一方面可與毒物分子及其代謝物發(fā)生

4、結(jié)合反應(yīng)降低毒物毒性；另一方面可通過氧化還原反應(yīng)而降低毒物過氧化的能力，使含巰基酶免于被重金屬和氧化劑激活或使已氧化的含巰基酶還原而使其恢復(fù)活性。 在自由基大量產(chǎn)生時，細胞膜不飽合脂肪酸氧化成脂過氧基，并引起一系列繼發(fā)損傷。GSH可直接通過供H+拮抗氧自由基毒性，終止連鎖反應(yīng)，其本身則被氧化成GSSG。同樣，GSH在對抗氧自由基過氧化并抑制由此引發(fā)的細胞凋亡、壞死及自穩(wěn)態(tài)改變等方面亦發(fā)揮著重要作用。 GSH/GSSG體內(nèi)代謝有多種途徑，在氧化狀態(tài)下，GSH一方面被氧化成GSSG，表現(xiàn)為相應(yīng)GSH/GSSG的降升；另一方面，GSH與外源毒物及其代謝物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，最終生成硫醇脲酸經(jīng)尿排出，此時僅

5、為相應(yīng)GSH下降，而GSSG變化可能并不大，甚或因GSH消耗而GSSG亦降低5。GSSG除可被還原成GSH外，還可通過GST（谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶）發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。 三、體內(nèi)影響GSH水平因素 由于血中GSH主要源于肝臟等器官，所以血漿GSH水平無疑是間接反映有關(guān)器官，如肝、腎內(nèi)GSH水平的較理想指標。目前測定仍多停留在動物實驗階段，有關(guān)人血GSH濃度報道較少，近期報道人血濃度為1.000±0.167(715例)1。 在許多病理情況下，如糖尿病、酒精性肝病、肝硬化、外源性毒物致過氧化時，GSH水平下降。近期又發(fā)現(xiàn)艾滋病、帕金森病、衰老及低氧血癥病人的GSH也下降，并發(fā)現(xiàn)老年人伴GSH低

6、下者的身體健康狀況較高GSH者差。 Hagg等報道，在生理狀態(tài)下男性GSH水平高于女性，素食者高于非素食者，老年人GSH明顯下降，黑人GSH高于白種人1，6。另外人們還發(fā)現(xiàn)，GSH水平與體育活動程度及營養(yǎng)有關(guān)。 有趣的是，吸煙者GSH高于非吸煙者，這可能是機體對長期吸煙引起慢性氧化狀態(tài)的適應(yīng)性調(diào)節(jié)反應(yīng)，這也進一步提示，GSH在體內(nèi)抗氧化過程中的重要作用。 四、不同化學(xué)毒物誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化狀態(tài)下GSH/GSSG的變化 體外試驗顯示，當(dāng)細胞暴露于亞毒性濃度毒物時，GSH并不下降而是升高。 Cookson等7用神經(jīng)膠質(zhì)細胞分別與亞毒性濃度三甲基錫、三乙基錫共同培養(yǎng)24小時，細胞內(nèi)GSH顯著升高；Oc

7、hi8用中國倉鼠V79細胞與亞毒性濃度砷共同孵育時，發(fā)現(xiàn)在8小時GSH升高最大，之后降低；另外，亦有大量試驗顯示暴露于亞毒性濃度的鉛、汞、甲基汞等化合物亦使GSH升高9，提示可能是細胞在應(yīng)激時采取的一種保護性機制，與長期吸煙致GSH升高情況類似。 Palmeira等10將雄性Wistar大鼠肝細胞分別和不同毒性濃度的除莠劑百草枯和2,4-D共同進行體外培養(yǎng)，用Hissin酶化學(xué)法檢測GSH/GSSG。結(jié)果顯示，GSH濃度隨接觸時間而降低，孵育23小時降至最低水平，且存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，而GSSG則呈正比升高。Lora等用雄性Fischer344大鼠與不同濃度的雙氯乙基亞硝脲一起孵育并采用反相高

8、效液相色譜（HPLC）法檢測GSH/GSSG水平，亦得出同樣結(jié)論11。 有些實驗顯示，外周血GSSG變化較GSH敏感，這可能與細胞受損后GSH、GSSG釋放到細胞外水平不同有關(guān)。Navarro等14對成年OF1小鼠給予17 Gy的高能X線照射，并在不同時間測其血中GSH/GSSG。此外，對患乳腺癌及肺癌病人在接受不同劑量放射治療時亦采用HPLC法測定上述指標，結(jié)果顯示小鼠血中GSH濃度變化不顯著，GSSG升高，GSH/GSSG下降，并與放射劑量有劑量和時間依賴性，尤以2 小時GSSG升高最顯著；鼠肝、心、胰腺中變化亦明顯，且同時有GSH下降并有統(tǒng)計學(xué)意義；腫瘤放療病人結(jié)果亦顯示外周血GSSG水

9、平則隨放療累積量增加而升高，并有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，而GSH變化則不顯著。 但在以該指標評估脂質(zhì)過氧化損傷時，尚需注意到GSH/GSSG系統(tǒng)的參與情況。Lii等15采用雄性SD大鼠，分別予以百草枯(20和40 g/kg)、敵草快（85和190 mg/kg)染毒，結(jié)果見肝細胞GSH和GSSG及其比率變化均無統(tǒng)計學(xué)意義，而此時通過檢測氧自由基脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物硫巴比土酸反應(yīng)物，則顯示肝細胞有較嚴重氧自由基脂質(zhì)過氧化損傷，這可能與蛋白質(zhì)-S-谷胱甘肽化有關(guān)，GSH/GSSG 系統(tǒng)則可能未參與上述過程。 以GSH/GSSG作為指標評估脂質(zhì)過氧化損傷，諸多實驗結(jié)果有不小差異，可能與以下因素有關(guān)： 1測量方法：檢測GSH/GSSG方法有多種，歸納起來主要有2類：酶化學(xué)法和HPLC法。前者主要根據(jù)GSH在氧化還原過程中酶代謝動力學(xué)改變，如利用GSH被二硫代對二硝基苯氧化，生成硫硝基苯酸鹽的程度，間接反應(yīng)GSH/GSSG的水平。HPLC法則可據(jù)實驗波譜直接測定GSH/GSSG，敏感性、專一性較高，但操作復(fù)雜。兩種方法的結(jié)果多數(shù)一致1，15，而Floreani等16則認為HPLC較化學(xué)法 敏感10倍以上，兩方法所測結(jié)果有顯著差別，但都面臨同樣問題，如GSH/GSSG在細胞內(nèi)隔窒化(compartmentilizati