丹參酮IIA泊洛沙姆188固體分散體的制備及研究

1、丹參酮IIA-泊洛沙姆188固體分散體的制備及研究趙霞 .周長(zhǎng)新 .莫建霞.（浙江大學(xué)藥學(xué)院現(xiàn)代中藥研究所）摘要：目的：制備丹參酮IIA泊洛沙姆188固體分散體，對(duì)其溶出度及性質(zhì)進(jìn)行研究 方法：用熔融法制備丹參酮IIA泊洛沙姆188固體分散體，并對(duì)固體分散體進(jìn)行溶出度測(cè)定，IR，DSC,X-RD等分析以鑒別藥物在載體中的存在形式;結(jié)果：丹參酮IIA在泊洛沙姆188中以微晶形式存在，溶出度大大提高; 結(jié)論：泊洛沙姆188是提高丹參酮IIA溶出度較為理想的載體。關(guān)鍵詞：丹參酮IIA，泊洛沙姆188，固體分散體丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge )的干燥

2、根及根莖。丹參首載于神農(nóng)本草經(jīng)，中華人民共和國(guó)藥典歸納丹參具活血化瘀，涼血消腫，清心除煩之功效。根據(jù)丹參主要成分的性質(zhì)可分為水溶性的酚酸類如丹酚酸、丹參素、原兒茶醛等和脂溶性的二萜醌類如丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮等，其中丹參酮IIA ( Tanshinone A , Tan) 是脂溶性成分中含量較高的活性成分，其藥理作用主要有抗急性缺氧作用；抗心率失常作用；改善平滑肌作用；抗心肌肥厚作用；抗血小板聚集作用等1。近期研究結(jié)果表明丹參酮IIA在治療缺血性腦中風(fēng)方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值2。 丹參酮IIA為櫻紅色針狀結(jié)晶，結(jié)構(gòu)式見下圖，其三維結(jié)構(gòu)和分子的能量函數(shù)決定了其為高熔點(diǎn)物質(zhì)，且難溶于水，丹參

3、酮IIA的親水/疏水指數(shù)為79/401=0.1970，丹參酮I的親水/疏水指數(shù)為80/3770.2122這些脂溶性化合物一旦進(jìn)入體液內(nèi)，在水分子的驅(qū)動(dòng)下將會(huì)產(chǎn)生疏水相互作用。圖1 丹參酮IIA結(jié)構(gòu)過去認(rèn)為丹參酮A 腸道吸收差,臨床起效慢,口服藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)也已證明3，故有人將其磺化成水溶性鈉鹽：丹參酮A磺酸鈉(DS - 201) 供臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用的注射液，用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗死等，但其不足之處是排泄過速，作用時(shí)間短暫。此外離子型的磺酸鈉鹽難以通過血腦屏障，顯然不適合腦中風(fēng)患者的臨床治療?，F(xiàn)有的用作治療心腦血管疾病的丹參酮制劑主要有片劑、膠囊劑等，缺陷在于經(jīng)口服吸收后生物利用度不高。

4、現(xiàn)采用固體分散技術(shù)增加丹參酮IIA的溶出度，固體分散體是指將難溶性藥物在水溶性載體中形成分子分散體系,以改善藥物的溶解性能,增加藥物的溶出速度和胃腸道對(duì)藥物的吸收速度,從而提高藥物的生物利用度，經(jīng)研究表明黃豆苷元固體分散物膠囊相對(duì)普通膠囊劑生物利用度高5 倍多4 。本研究所選用的水溶性固體分散材料泊洛沙姆188（Poloxamer188），分散能力強(qiáng)，具有最佳乳化性能和安全性，熔點(diǎn)低，易溶于水，能與許多藥物形成空隙固溶體5，利用Poloxamer188作為載體制備固體分散體，可大大提高溶出速率和生物利用度7。1 實(shí)驗(yàn)部分11 儀器與試藥丹參酮IIA（浙江大學(xué)藥學(xué)院現(xiàn)代中藥研究所自制）；泊洛沙姆

5、188（德國(guó)BASF公司）；其它試劑均為分析純。電動(dòng)攪拌機(jī)（鞏義市予華儀器有限 公司）；QM-1SP行星式球磨機(jī)（南京大學(xué)儀器廠）；JASCO V-550紫外分光光度計(jì)；Victor22紅外光譜儀（BRUKER.Co）；粉末衍射R-ASIX RAPID (Rigaku,Japan)，HPLC（Waters 2695 液相色譜儀，Waters 2487 紫外可見檢測(cè)器）；RCD一6型藥物溶出度儀(上海黃海藥檢儀器廠) 差示熱量掃描儀（美國(guó)TA DSC Q100）12 方法121 固體分散體的制備 將泊洛沙姆188置于燒瓶中，于80油浴上加熱至完全溶解，分別按5、10、15、20、25重量將丹參酮

6、IIA加入其中，用電動(dòng)攪拌機(jī)充分?jǐn)嚢?，使其分散均勻后，立即于冰鹽浴中驟冷，冷凍維持1h后取出，于干燥器內(nèi)過夜干燥，用球磨機(jī)粉碎后過200目篩，得到不同質(zhì)量比的固體分散體。122 物理混合物的制備 將丹參酮IIA與泊洛沙姆188分別研磨成細(xì)粉末后，混合均勻。123 不同樣品體外溶出度的測(cè)定按中國(guó)藥典(2005版) 附錄中有關(guān)槳法規(guī)定進(jìn)行，轉(zhuǎn)速(50士1)rmin，水浴溫度(37士05)，溶出介質(zhì)為蒸餾水。取不同濃度的丹參酮IIA泊洛沙姆固體分散體，按投藥量相當(dāng)于20mg丹參酮IIA計(jì)算，分別于2，5，8，10，15，20，30min 各取樣3ml，0.45um濾膜過濾，同時(shí)補(bǔ)充同溫度3ml的溶出

7、介質(zhì)，濾液直接或稀釋后，HPLC檢測(cè)。色譜條件：色譜柱：phenomenex C18 (250 mm×4.6mm,5m)；流動(dòng)相：甲醇水80：20流速：1mlmin-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；柱溫：302 結(jié)果與討論21體外溶出度測(cè)定結(jié)果下圖是Poloxamer188丹參酮IIA在水中溶出曲線，原料藥物在水中幾乎不溶，在90min溶出還不到1，而固體分散體的溶出則大大加快，同時(shí)也可看出載體比例越大，固體分散體溶出速度越快。當(dāng)藥物濃度達(dá)到25時(shí)溶出時(shí)間最長(zhǎng)且溶出度達(dá)不到100。圖2丹參酮IIA固體分散體累積溶出曲線 1 丹參酮IIA 2 Tansh泊洛沙姆5：95 3 Tansh泊洛沙

8、姆 10：90 4 Tansh泊洛沙姆 15：75 5 Tansh泊洛沙姆 20：80 6 Tansh泊洛沙姆 25：7522丹參酮IIA與泊洛沙姆188分子間的作用221 紅外實(shí)驗(yàn)結(jié)果由紅外光譜可知,質(zhì)量比相同的機(jī)械混合物和固體分散物在紅外掃描圖譜上基本相似。在固體分散體和物理混合物中，1671cm-1的藥物分子羰基的伸縮振動(dòng)峰都存在，說明藥物中存在丹參酮IIA的分子，固體分散體中丹參酮IIA和泊洛沙姆188分子間未發(fā)生化學(xué)反應(yīng) ,它們之間僅僅是物理作用。圖3 IR圖譜 DSC測(cè)定分析根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道丹參酮IIA的熔點(diǎn)為218.5。在差示熱量掃描（DSC）分析中可見泊洛沙姆的吸收峰為51.79，

9、固體分散體的吸收峰為53.03，保持程序升溫一直至300，未見有熔點(diǎn)為218.5的單一的丹參酮IIA的熱譜曲線。上述實(shí)驗(yàn)中，固體分散體的熔點(diǎn)較丹參酮IIA下降達(dá)165.5，表明用泊洛沙姆188作為固體分散劑，既能降低丹參酮IIA分子之間的非鍵能，不會(huì)因溫度過高而導(dǎo)致化學(xué)成分的變化或結(jié)構(gòu)破壞，同時(shí)又使固體分散物具有較好的水溶性。圖4 差示熱量掃描（DSC）圖223 X-RD實(shí)驗(yàn)結(jié)果從圖中可以看出，固體分散體中丹參酮IIA和泊洛沙姆188呈現(xiàn)尖銳的衍射峰，表明泊洛沙姆188和丹參酮IIA均以結(jié)晶形式存在，而不是以無定形態(tài)存在的，同時(shí)隨著藥物濃度的不同，衍射峰中所出現(xiàn)的藥物的峰強(qiáng)度也不同，說明藥物沒

10、有發(fā)生化學(xué)的變化。有些基質(zhì)如PVP等可與藥物分子形成氫鍵，從而在固體分散體中將看不到藥物的衍射峰,這和分散載體的性質(zhì)有關(guān)。62.3 討論載藥量為25%的固體分散體溶出度明顯降低，且達(dá)不到100溶出，在用0.45um的濾膜過濾時(shí)已能明顯看到濾膜上有殘留，說明此時(shí)泊洛沙姆188的分散已基本接近飽和狀態(tài)。泊洛沙姆188能顯著提高丹參酮IIA的溶出度，這和載體材料的性質(zhì)關(guān)系密切，在固體分散體中，藥物周圍被可溶性載體材料包圍，使疏水性藥物具有良好的可濕潤(rùn)性，因此溶出速率提高。8研究結(jié)果表明，丹參酮IIA在泊洛沙姆中的分散含量可以達(dá)到20，大大高于PEG制備的固體分散體（5-10）9. 故泊洛沙姆188是

11、提高丹參酮IIA的溶解度及溶出速度的良好載體，對(duì)于制備理想的丹參酮制劑有較好的開發(fā)及利用價(jià)值。圖5 X-粉末衍射圖參考文獻(xiàn)：1 梁勇，羊裔明，袁淑蘭丹參酮藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展 J.中草藥，2000，31(4)：304-3062 B.Y.H.Lam,A.C.Y.Lo et.neuroprotective efffects of tanshinones in transient focal cerebral ischemia in miceJ.Phytomedicine,2003(10),286-2913薛明，汪漢卿隱丹參酮及其代謝物在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究J.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1999，34(2)

12、：81844孫玉雯，等固體分散技術(shù)在中藥制劑中的應(yīng)用 J.中藥材，2004，27(11)：880-882 5鄭俊民 主編.藥用高分子材料學(xué)M.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.2003.1686陸 彬 主編藥物新劑型與新技術(shù)M北京：人民出版社199816227Hse Weuts,Diete Kempen et.Phase behaviour analysis of solid dispersions of loperamide and two structually related compounds with the polymers PVP-K30 and PVP-VA64 J European

13、Journal of Pharmaceutical Sciences,2004(22)375-385圖1-4帶有大量硼原子的賴氨酸樹突的結(jié)構(gòu)示意圖33 樹枝狀大分子用作醫(yī)學(xué)上的造影劑樹枝狀大分子的另一個(gè)應(yīng)用就是作為造影劑用在磁共振成像方法（MRI）中，這種方法可用于器官、血管、組織的造影定位。這種方法的物理依據(jù)是通過在一個(gè)確定的非均勻磁場(chǎng)下對(duì)體內(nèi)水的質(zhì)子核磁共振信號(hào)進(jìn)行測(cè)量，來定位水信號(hào)的來源。當(dāng)要描述單個(gè)器官或血管時(shí)，還需使用對(duì)比試劑。重金屬離子的順磁絡(luò)合體由于偶極-偶極相互作用，可以使質(zhì)子更快地釋放，可用于對(duì)比試劑。用對(duì)比試劑渲染的區(qū)域就可以被非常精確地識(shí)別和定位。目前在臨床上用小分子和釓

14、形成的絡(luò)合物來定位血管有很大的缺點(diǎn)，因?yàn)檫@些物質(zhì)注射進(jìn)入血管后立刻擴(kuò)散到血管外，結(jié)果起不到對(duì)比渲染的作用。而一般的大分子與釓形成的絡(luò)合物，由于在體內(nèi)無法通過腎排除干凈，所以一直無法應(yīng)用于臨床。Wiener等人發(fā)現(xiàn)，采用樹枝狀結(jié)構(gòu)的對(duì)比試劑可以大大增加這些物質(zhì)在血管里的停留時(shí)間，并且能夠被腎徹底排除，所以這類結(jié)構(gòu)的對(duì)比試劑可以作為理想的定位血管等組織的對(duì)比試劑。例如，他們將葉酸連接到以氨為核的第四代胺基中止的PAMAM樹枝狀大分子上，再將其與2-(4-異硫氰酸根芐基)-6-甲基二亞乙基三胺五乙酸反應(yīng)生成螯合物f-PAMAM-TU-DTPA。研究結(jié)果表明，細(xì)胞在受體特異性的方式下可以結(jié)合樹枝狀大分

15、子的葉酸鹽，這說明將樹枝狀大分子的葉酸鹽作為磁共振成像的造影劑是一種很有前途的定位腫瘤的新方法9。A.G.Schering制備了一種可以連接24個(gè)釓金屬原子的賴氨酸樹枝狀大分子/釓絡(luò)合物，這類絡(luò)合物表現(xiàn)出很好的成像效果，已經(jīng)用于臨床研究。在2001年12月的自然生物技術(shù)（Nature Biotechnology）雜志上，約翰霍普金斯大學(xué)的J.Bulte等10發(fā)表文章說，被磁化標(biāo)記的樹枝狀納米分子可以用來跟蹤被移植到活鼠腦內(nèi)的干細(xì)胞。他們合成了連有氧化鐵分子的樹枝狀大分子，并將它們放進(jìn)含有由干細(xì)胞培養(yǎng)出的腦細(xì)胞的培養(yǎng)液中，磁化的樹枝狀大分子被腦細(xì)胞吸收，接著將這些腦細(xì)胞注射進(jìn)老鼠的腦內(nèi)。運(yùn)用磁共

16、振成像來探測(cè)樹枝狀大分子中的氧化鐵，研究者能夠追蹤被移植腦細(xì)胞的位置，從而觀察到它們何時(shí)在大腦中生成新的組織。34 樹枝狀大分子用作藥物載體作為藥物載體，樹枝狀大分子比其它藥物分子有著明顯的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)。首先，它的表面連有大量的官能團(tuán)，經(jīng)過修飾可以連接大量藥物分子；其次，高代的樹枝狀大分子在空間呈球狀分布，內(nèi)部存在著較大的孔腔，這些孔腔里可以包埋藥物分子。這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使樹枝狀大分子的載藥量大大提高。如果在表面官能團(tuán)上連接具有藥物靶向引導(dǎo)功能的基團(tuán)，樹枝狀大分子還可以用于藥物的靶向控釋。而且樹枝狀大分子的粒徑一般在10nm左右，所以在實(shí)現(xiàn)藥物釋放的同時(shí)不會(huì)造成血栓的形成。 PAMAM樹狀大分子是聚電

17、解質(zhì)。在水中末端基的一級(jí)胺和內(nèi)腔中的三級(jí)胺均可質(zhì)子化,質(zhì)子化的程度取決于溶液的pH。聚電解質(zhì)的質(zhì)子化強(qiáng)烈地影響其構(gòu)象。Chen 等人11 用熒光光譜法研究了6.0G PAMAM樹狀大分子與探針分子DNS(52二甲胺基212萘酚磺酸) 結(jié)合的機(jī)理。發(fā)現(xiàn)在帶正電荷的樹狀大分子與帶負(fù)電的DNS 之間是靠靜電作用結(jié)合的。PAMAM樹狀大分子的酸性解離一級(jí)常數(shù)、二級(jí)常數(shù)分別為pKa1 = 10 和pKa2 = 415。當(dāng)pH > 10 時(shí),PAMAM表面的一級(jí)胺很少被質(zhì)子化。因而不易發(fā)生靜電作用。隨著pH 降低,一級(jí)胺的表面開始質(zhì)子化,到pH 為8.3 時(shí),三級(jí)胺也開始質(zhì)子化。因此,在5.5 &l

18、t; pH < 10 時(shí),PAMAM樹狀大分子與DNS 發(fā)生靜電結(jié)合作用。Watkins 等人12 也證明了PAMAM樹狀大分子在pH = 7 時(shí),對(duì)染料nile red 的結(jié)合量最大。這與Chen 等人的研究結(jié)果是一致的。Watkins 研究小組還發(fā)現(xiàn)將乙二胺的亞甲基鏈增長(zhǎng)到12 個(gè)碳,其包裹量將遠(yuǎn)高于乙二胺為核的樹狀大分子。這是由于在pH = 7 時(shí),相連的兩個(gè)帶電契形物相互排斥,形成一個(gè)拉長(zhǎng)的樹狀大分子。這樣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)特別利于更多的染料分子陰離子對(duì)親脂性核的接近以發(fā)生靜電作用。利用這種靜電作用,Milhem等人13 將樹狀大分子用作脂溶性弱酸性藥物布洛芬的增溶劑研究。發(fā)現(xiàn)比傳統(tǒng)的增

19、溶劑SDS 具有更大的增溶效果。4展望 聚酰胺胺（PAMAM）樹狀大分子的合成目前存在的問題是過程復(fù)雜、效率低、多數(shù)品種難以得到純度高和量大的樣品。對(duì)于發(fā)散法合成的關(guān)鍵是要研究更快、更有效的的分離和純化的方法。國(guó)外對(duì)其應(yīng)用的研究主要集中在基因載體、藥物緩釋材料、納米復(fù)合材料、膜材料、光學(xué)材料和作用機(jī)理等方面，國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究也已經(jīng)開始，但國(guó)外已經(jīng)有商品化的聚酰胺胺（PAMAM）樹狀分子，國(guó)內(nèi)還沒有，這也限制了國(guó)內(nèi)研究人員對(duì)其進(jìn)行更廣泛和深入的研究和應(yīng)用。參考文獻(xiàn)：1 譚惠民，羅運(yùn)軍樹枝形聚合物化學(xué)工業(yè)出版社2002：1892 Tomalia D. A. H. Baker. J. Dewald.

20、et, al. A New Class of Polymers: Starburst-Dendritic Macromolecules. Polym. J. (Tokyo) . 1985, 17(1): 1173 Perez G P, Crooks R R. Selectively Permeable Dendrimers as Molecular GatesJ. TheElectro-chemical Society Interface. 2001, 10: 344 Genderen M H P, Baars M W P L, Meijer E W, et al. Observing ind

21、ividual generations inpoly(propyleneimine) dendrimers with natural-abundance 15N-NMR spectroscopyJ. Recl.Trav. Chim.Pays-Bas. , 1994, 113: 5735 John M. J. , Donald A. Tomalia. Dendrimers and Dendritic Polymers. Electronic. 2001: 5946 Delong R, Stephenson K, Loftus T, et al. Characterization of compl

22、exes of oligonucleotideswith polyamidoamine starburst dendrimers and effects on intracellar deliveryJ. J. Pharm. Sci., 1997, 86: 762 7 Bielinska A, Kukowska L J F, Johnson J, et al. Regulation of in vitro gene expression usingantisense oligonucleotides or antisense expression plasmids transfected using starburstPAMAM dendrimersJ. N