TobmRNA在結直腸癌組織表達的臨床病理學意義

1、Tob mRNA在結直腸癌組織表達的臨床病理學意義 作者：霍志斌， 王淑霞， 吳殿超， 肖琦海， 翟同善， 周總光 【關鍵詞】 結直腸癌摘 要：目的：研究Tob mRNA在結直腸癌組織及其相應的癌旁正常組織的表達，探討其在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：用熒光定量RT-PCR方法，檢測38例結直腸癌標本及其相應的癌旁正常組織Tob mRNA的表達。結果：38例癌組織Tob mRNA表達高于癌旁正常組織（P<0.005）； Tob mRNA表達隨著Dukes分期有增高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.005)。結論：在結直腸癌的發(fā)病機制中，Tob mRNA可能為致癌基因

2、。關鍵詞： 結直腸癌； Tob mRNA Association of Tob mRNA Expression with Clinicopathological Characteristics of Colorectal CancerAbstract： Objective： To investigate the expression of Tob mRNA in human colorectal cancer tissues, and their corresponding para-cancerous tissues , and to investigate the role of Tob

3、mRNA in the pathogenesis of colorectal cancer. Method： Quantitative real time RT-PCR was used to detect the expression of Tob mRNA in 38 colorectal cancers. Result： Compared to those from corresponding normal tissues the expression of Tob mRNA in colorectal cancer tissues were significantly increase

4、d. Moreover, the expression value of Tob in Dukes A,B,C,D was 8.32±1.90, 6.90±1.43, 6.01±1.25 and 3.48±0.69，respectively. Analyzed by one-way ANOVA,there were significant differences in the expression of Tob in defferent Dukes stage. Conclusion： The up-regulation expression of To

5、b mRNA may be closely associated with tumorigenesis of colorectal carcinoma. Key words： Colorectal cancer； Tob mRNATob基因是抗增殖基因，可抑制細胞的增殖1，最近的研究表明：在肺癌的發(fā)病機制中Tob可能為抑癌基因2。但是，結直腸癌組織Tob基因的表達情況國內(nèi)外未見報道。基于此，我們采用熒光定量 RT-PCR技術檢測了38例結直腸癌、癌旁正常組織Tob mRNA的表達，并初步探討其參與結直腸癌發(fā)生發(fā)展的機制。1 材料與方法11 材料：38例癌組織及相應的癌旁正常組織（距腫瘤10cm

6、以上）取自我院2003年7月至2005年1月外科手術切除的大腸癌新鮮標本，均經(jīng)病理證實?；颊吣挲g3576歲，平均56歲；男17例，女21例。根據(jù)Newland（1981）Dukes分期法， A期9例，B期17 例，C期8 例，D期4例。所有病例術前均未經(jīng)過放療和化療。組織取材后立即放入液氮內(nèi)冷凍，70冰箱保存。1.2 試劑及儀器：Trizol試劑盒 (GIBCO,USA) ,RT-PCR 試劑盒(MBI公司), PCR 試劑盒(MBI 公司)，DEPC（GIBCO,USA）, dNTP(MBI 公司)，GAPDH內(nèi)對照試劑盒(ABI,USA)，F(xiàn)TC2000實時熒光定量基因擴增儀（楓嶺公司，加

7、拿大）。1.3 引物設計：Tob基因上游引物：5CCAGTACAGTAATGCCTTTGATGT-3,下游引物：5CCGTGCATTTTAACTTGTACGAT-3, 探針：5CATTGAGGCCTCCATAGGCTGC-3,內(nèi)參照GAPDH上游引物:5- GGCATGGACTGTGGTCATGA-3,下游引物5 TGGGTGTGAACCACGAGAAC3，探針：5 CTGCACCACCAACTGCTTAGC3， 上述引物由上海生物工程技術服務公司合成。1.4 總RNA提取及cDNA制備：按照TRizol試劑盒說明提取結直腸癌組織、癌旁正常組織總RNA，RNA純度為：OD260/OD280&a

8、mp;gt;1.8。每個總RNA樣品取5l，加1l（0.2g/l）隨機引物，加6l DEPC水，混勻后瞬時離心，70變性5min，冰上冷卻5min，加入4l 5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、2l 10mmol/LdNTP混合物、1l RNA酶抑制劑、1l反轉(zhuǎn)錄酶，反應終體積為20l，20反應5min、42反應60min、70反應5min，冰上冷卻后置于20貯存?zhèn)溆谩?.5 熒光定量PCR反應：依次取10×PCR緩沖液3l、25mmol/L MgCl2 3l、25mmol/L dNTP 0.36l、5和3引物各1l、TaqMan探針 1l（10mol/L）、Taq 酶（5u/l）0.3l、

9、ddH2O 18.34l 、模板cDNA 5l加入0.5ml EP管至終體積30l。94預變性2min。然后按94 20s、53 30s、60 60s進行45個循環(huán)的PCR反應，5330s收集熒光。1.6 定量分析：用Tob mRNA Ct 值/內(nèi)參照GAPDH Ct值代表Tob mRNA的精確含量。1.7 統(tǒng)計學處理：Tob 基因表達以均數(shù)±標準差表示，用SPSS11.5統(tǒng)計軟件統(tǒng)計，配對t檢驗及單因素方差分析，以P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。2 結 果2.1 根據(jù)定量熒光PCR原理Ct值與擴增片斷的實際拷貝數(shù)呈反比，即Ct值越低，實際含量越高。結直腸癌組織Tob mRNA表達值

10、為6.89±1.90高于癌旁正常組織(7.84±2.00, p<0.005) 。2.2 Tob mRNA表達與臨床病理特征的關系：結直腸癌組織Tob mRNA表達隨著Dukes分期越晚其表達有增高趨勢，淋巴結轉(zhuǎn)移組結直腸癌組織Tob mRNA的表達高于無淋巴結轉(zhuǎn)移組癌組織，但Tob mRNA表達與患者的性別、年齡、腫瘤的分化程度無關。（表1)3 討 論結直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多階段及多基因參與的疾病，癌基因和抑癌基因表達失衡可導致腫瘤的發(fā)生3。認識大腸癌分子水平的改變將有助于結直腸癌的篩選、診斷、預后的判斷和基因治療。Tob基因是

11、抗增殖基因，可抑制細胞的增殖，最近的研究表明：在肺癌的發(fā)病機制中Tob可能為抑癌基因。我們用熒光定量 RT-PCR方法檢測了38例結直腸癌組織及癌旁正常組織Tob mRNA表達。結果表明TobmRNA在結直腸癌組織的表達明顯高于癌旁正常組織，且隨著Dukes分期越晚Tob mRNA表達越高，這提示Tob mRNA高表達促進了結直腸癌的發(fā)生和浸潤，其生物學功能表現(xiàn)為致癌基因，可能是結直腸癌的檢測指標之一。Tob mRNA在結直腸癌的表達和肺癌不同，可能和同一基因在不同腫瘤組織中具有不同的生物化學功能有關，因為腫瘤的發(fā)生發(fā)展是復雜的多基因、多步驟的一系列分子事件3。同樣的情況還見于磷脂結合蛋白An

12、nexin，其在乳癌、肝細胞癌為高表達而在食管癌和前列腺癌低表達47。周期素依賴激酶抑制因子p21在大部分腫瘤中是抑癌基因，但在一些腫瘤中如食管鱗狀細胞癌，p21過度表達促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其生物學功能表現(xiàn)為致癌基因8。綜上所述，Tob mRNA在大腸癌的形成過程中可能為致癌基因。但Tob基因在惡性腫瘤形成中的作用機制尚不完全清楚，有待進一步研究。表1 Tob mRNA表達與臨床病理特征的關系（略） 參考文獻：1 Matsuda, S., Kawamura-Tsuzuku, J., Ohsugi, M.,et al.Tob, a novel protein that interacts wi

13、th p185erbB2, is associated with anti-proliferative activityJ.Oncogene,1996，12(4):7052 Iwanaga K, Sueoka N, Sato A,et al . Alteration of expression or phosphorylation status of tob, a novel tumor suppressor gene product, is an early event in lung cancerJ. Cancer Lett, 2003，202(1):713 Fearon ER, Voge

14、lstein BA.Genetic model for colorectal tumourigenesis.Cell,1990，61:7594 Ahn SH,Sawada H,Ro JY,et al. Differential expression of annexin in human mammary ductal epithelial cells in normal and benign and malignant breast tissuesJ.Clin Exp Metastasis, 1997，15(2):1515 Madaki T,Tokuda M,Ohnishi M,et al.E

15、nhanced expression of the protein kinase substrate annexin in human hepatocellular carcinomaJ.Hepatology,1996，24(1):726 Xia SH,Hu LP,HuH,et al. Three isoforms of annexinare preferentially expressed in normal esophageal epithelia but down-regulated in esophageal squamous cell carcinomas J.Oncogene,2002，21(43):66417 Paweletz CP,Ornstein DK,Roth MJ,et al.Loss of annexincorrelates with early onset of tumorigenesis in esophageal and pro