酶工程實驗小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的

1、實驗六實驗六 小麥萌發(fā)前后淀粉小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較酶活力的比較一、實驗目的一、實驗目的n1. 學習提取淀粉酶的方法。學習提取淀粉酶的方法。n2. 學習測定淀粉酶活力的方法。學習測定淀粉酶活力的方法。n3. 了解小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化了解小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化。二、實驗原理二、實驗原理n淀粉是植物最主要的貯藏多糖，也是人和動物的淀粉是植物最主要的貯藏多糖，也是人和動物的重要食物和發(fā)酵工業(yè)的基本原料。淀粉經淀粉酶重要食物和發(fā)酵工業(yè)的基本原料。淀粉經淀粉酶作用后生成麥芽糖、葡萄糖等小分子物質而被機作用后生成麥芽糖、葡萄糖等小分子物質而被機體利用。體利用。n淀粉酶主要包括淀粉酶主要

2、包括-淀粉酶淀粉酶和和-淀粉酶淀粉酶兩種。兩種。-淀淀粉酶可隨機地作用于淀粉中的粉酶可隨機地作用于淀粉中的-1,4-糖苷鍵，生糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。同時使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進行水解，每次淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進行水解，每次水解下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶。水解下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶。n淀粉的水解產物麥芽糖有還原性能與淀粉的水解產物麥芽糖有還原性能與3，5-二硝基二硝基水楊酸試劑反應，使其還原生成紅色水楊酸試劑反應，使其還原

3、生成紅色3-氨基氨基-5-硝硝基水楊酸?；畻钏?。n在一定范圍內，其顏色深淺與淀粉酶水解產物的在一定范圍內，其顏色深淺與淀粉酶水解產物的濃度成正比，可用麥芽糖（或葡萄糖）濃度表示，濃度成正比，可用麥芽糖（或葡萄糖）濃度表示，用比色法測定淀粉生成的還原糖的量，以單位重用比色法測定淀粉生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內生成的麥芽糖的量表示酶活量樣品在一定時間內生成的麥芽糖的量表示酶活力。力。 n休眠種子的淀粉酶活力很弱，種子吸脹萌動后，休眠種子的淀粉酶活力很弱，種子吸脹萌動后，酶活力逐漸增強，并隨著發(fā)芽天數(shù)的增長而增酶活力逐漸增強，并隨著發(fā)芽天數(shù)的增長而增加。本實驗觀察加。本實驗觀察小麥

4、種子萌發(fā)前后淀粉酶活力小麥種子萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化。的變化。三、試劑三、試劑 n1. 0.1標準麥芽糖溶液標準麥芽糖溶液 ：精確稱量：精確稱量100毫毫克麥芽糖，用少量水溶解后，移入克麥芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量容量瓶中，加蒸餾水至刻度。瓶中，加蒸餾水至刻度。n2pH 6.9，0.02molL磷酸緩沖液磷酸緩沖液 100毫毫升升n31淀粉溶液：淀粉溶液：1克可溶性淀粉溶于克可溶性淀粉溶于100毫毫升升 0.02molL磷酸緩沖液，其中含有磷酸緩沖液，其中含有 0.006molL氯化鈉氯化鈉。n413,5-二硝基水楊酸試劑二硝基水楊酸試劑: 1g 3,5-二硝基水楊酸溶于二硝基

5、水楊酸溶于20毫升毫升2摩爾摩爾L的氫的氫氧化鈉溶液和氧化鈉溶液和50毫升水中；再加人毫升水中；再加人30克克酒石酸鉀鈉，定容至酒石酸鉀鈉，定容至100毫升。若溶液毫升。若溶液混濁，可過濾?；鞚?，可過濾。n51氯化鈉氯化鈉n6石英砂石英砂四、操作步驟四、操作步驟n1 1種子發(fā)芽：種子發(fā)芽：n小麥種子浸泡小麥種子浸泡2.5 h后，放人后，放人25恒溫箱內或恒溫箱內或在室溫下發(fā)芽。在室溫下發(fā)芽。n 2 2 酶液提?。好敢禾崛。簄 取發(fā)芽第取發(fā)芽第3-4天的幼苗天的幼苗15株，放人乳缽內，株，放人乳缽內，加適量石英砂加適量石英砂(200mg)，加，加 1氯化鈉溶液氯化鈉溶液10毫升，用力磨碎。在室溫

6、下放置毫升，用力磨碎。在室溫下放置 20分鐘，分鐘，攪拌幾次。將提取液離心（攪拌幾次。將提取液離心（3000轉轉min）10分鐘。分鐘。將上清液倒人量筒，測定酶提取液的將上清液倒人量筒，測定酶提取液的總體積總體積V。進行酶活力測定時，進行酶活力測定時，將酶提取液用將酶提取液用Ph6.9的磷酸緩沖液稀釋的磷酸緩沖液稀釋10倍。倍。n取干燥種子取干燥種子15粒作為對照（提取步驟同上）。粒作為對照（提取步驟同上）。n3 3酶活力測定：酶活力測定：n （1）?。┤?5毫升刻度試管毫升刻度試管4支。編號。按下表要求加人各試劑支。編號。按下表要求加人各試劑（各試劑須（各試劑須25預熱預熱10分鐘）。分鐘）

7、。1（干種子）（干種子）2（濕種子）（濕種子）3（標準管）（標準管） 4（空白管）（空白管）酶液酶液0.50.5-標準麥芽標準麥芽糖溶液糖溶液-0.5-淀粉溶液淀粉溶液1111蒸餾水蒸餾水-0.5n將各管混勻，放在將各管混勻，放在25，水浴中保溫，水浴中保溫3分鐘后，分鐘后，立即向各管中加人立即向各管中加人1 3，5-二二硝基水楊酸溶液硝基水楊酸溶液2毫升毫升。n（2）取出各試管，放人沸水浴中加熱）取出各試管，放人沸水浴中加熱5分鐘。冷至室溫，加水稀釋至分鐘。冷至室溫，加水稀釋至25毫升。毫升。將各管充分混勻。將各管充分混勻。n（3）用空白管作對照；在）用空白管作對照；在500nm處測處測定各管的光吸收值，記錄結果。定各管的光吸收值，記錄結果。n4 4計計 算算n本實驗規(guī)定：本實驗規(guī)定：25時時3min3min內水解淀粉釋放內水解淀粉釋放1mg1mg麥芽糖麥芽糖所需的酶量為所需的酶量為1 1個酶活力單位（個酶活力單位（U U）。）。n根據(jù)溶液的濃度與光吸收值成正比的關系，即：根據(jù)溶液的濃度與光吸收值成正比的關系，即：A標準標準A未知未知C標準標準C未知未知nC（酶液管濃度）（酶液管濃度）A酶酶C標準標準A標準標準n則則15粒種子或幼苗的總活力單位粒種子或幼苗的總活力單位= C酶酶N酶酶V酶酶nN為酶液的稀釋倍數(shù)為酶液的稀釋倍數(shù)nV為提取酶液的總體積為提取酶液的總體積思考題思考