酶工程實(shí)驗(yàn)小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的

1、實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 小麥萌發(fā)前后淀粉小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較酶活力的比較一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膎1. 學(xué)習(xí)提取淀粉酶的方法。學(xué)習(xí)提取淀粉酶的方法。n2. 學(xué)習(xí)測(cè)定淀粉酶活力的方法。學(xué)習(xí)測(cè)定淀粉酶活力的方法。n3. 了解小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化了解小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理n淀粉是植物最主要的貯藏多糖，也是人和動(dòng)物的淀粉是植物最主要的貯藏多糖，也是人和動(dòng)物的重要食物和發(fā)酵工業(yè)的基本原料。淀粉經(jīng)淀粉酶重要食物和發(fā)酵工業(yè)的基本原料。淀粉經(jīng)淀粉酶作用后生成麥芽糖、葡萄糖等小分子物質(zhì)而被機(jī)作用后生成麥芽糖、葡萄糖等小分子物質(zhì)而被機(jī)體利用。體利用。n淀粉酶主要包括淀粉酶主要

2、包括-淀粉酶淀粉酶和和-淀粉酶淀粉酶兩種。兩種。-淀淀粉酶可隨機(jī)地作用于淀粉中的粉酶可隨機(jī)地作用于淀粉中的-1,4-糖苷鍵，生糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時(shí)使淀粉的粘度降低，因此又稱(chēng)為液化酶。同時(shí)使淀粉的粘度降低，因此又稱(chēng)為液化酶。-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進(jìn)行水解，每次淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進(jìn)行水解，每次水解下一分子麥芽糖，又被稱(chēng)為糖化酶。水解下一分子麥芽糖，又被稱(chēng)為糖化酶。n淀粉的水解產(chǎn)物麥芽糖有還原性能與淀粉的水解產(chǎn)物麥芽糖有還原性能與3，5-二硝基二硝基水楊酸試劑反應(yīng)，使其還原生成紅色水楊酸試劑反應(yīng)，使其還原

3、生成紅色3-氨基氨基-5-硝硝基水楊酸。基水楊酸。n在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與淀粉酶水解產(chǎn)物的在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與淀粉酶水解產(chǎn)物的濃度成正比，可用麥芽糖（或葡萄糖）濃度表示，濃度成正比，可用麥芽糖（或葡萄糖）濃度表示，用比色法測(cè)定淀粉生成的還原糖的量，以單位重用比色法測(cè)定淀粉生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。力。 n休眠種子的淀粉酶活力很弱，種子吸脹萌動(dòng)后，休眠種子的淀粉酶活力很弱，種子吸脹萌動(dòng)后，酶活力逐漸增強(qiáng)，并隨著發(fā)芽天數(shù)的增長(zhǎng)而增酶活力逐漸增強(qiáng)，并隨著發(fā)芽天數(shù)的增長(zhǎng)而增加。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察加。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察小麥

4、種子萌發(fā)前后淀粉酶活力小麥種子萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化。的變化。三、試劑三、試劑 n1. 0.1標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液 ：精確稱(chēng)量：精確稱(chēng)量100毫毫克麥芽糖，用少量水溶解后，移入克麥芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量容量瓶中，加蒸餾水至刻度。瓶中，加蒸餾水至刻度。n2pH 6.9，0.02molL磷酸緩沖液磷酸緩沖液 100毫毫升升n31淀粉溶液：淀粉溶液：1克可溶性淀粉溶于克可溶性淀粉溶于100毫毫升升 0.02molL磷酸緩沖液，其中含有磷酸緩沖液，其中含有 0.006molL氯化鈉氯化鈉。n413,5-二硝基水楊酸試劑二硝基水楊酸試劑: 1g 3,5-二硝基水楊酸溶于二硝基

5、水楊酸溶于20毫升毫升2摩爾摩爾L的氫的氫氧化鈉溶液和氧化鈉溶液和50毫升水中；再加人毫升水中；再加人30克克酒石酸鉀鈉，定容至酒石酸鉀鈉，定容至100毫升。若溶液毫升。若溶液混濁，可過(guò)濾。混濁，可過(guò)濾。n51氯化鈉氯化鈉n6石英砂石英砂四、操作步驟四、操作步驟n1 1種子發(fā)芽：種子發(fā)芽：n小麥種子浸泡小麥種子浸泡2.5 h后，放人后，放人25恒溫箱內(nèi)或恒溫箱內(nèi)或在室溫下發(fā)芽。在室溫下發(fā)芽。n 2 2 酶液提?。好敢禾崛。簄 取發(fā)芽第取發(fā)芽第3-4天的幼苗天的幼苗15株，放人乳缽內(nèi)，株，放人乳缽內(nèi)，加適量石英砂加適量石英砂(200mg)，加，加 1氯化鈉溶液氯化鈉溶液10毫升，用力磨碎。在室溫

6、下放置毫升，用力磨碎。在室溫下放置 20分鐘，分鐘，攪拌幾次。將提取液離心（攪拌幾次。將提取液離心（3000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)min）10分鐘。分鐘。將上清液倒人量筒，測(cè)定酶提取液的將上清液倒人量筒，測(cè)定酶提取液的總體積總體積V。進(jìn)行酶活力測(cè)定時(shí)，進(jìn)行酶活力測(cè)定時(shí)，將酶提取液用將酶提取液用Ph6.9的磷酸緩沖液稀釋的磷酸緩沖液稀釋10倍。倍。n取干燥種子取干燥種子15粒作為對(duì)照（提取步驟同上）。粒作為對(duì)照（提取步驟同上）。n3 3酶活力測(cè)定：酶活力測(cè)定：n （1）?。┤?5毫升刻度試管毫升刻度試管4支。編號(hào)。按下表要求加人各試劑支。編號(hào)。按下表要求加人各試劑（各試劑須（各試劑須25預(yù)熱預(yù)熱10分鐘）。分鐘）

7、。1（干種子）（干種子）2（濕種子）（濕種子）3（標(biāo)準(zhǔn)管）（標(biāo)準(zhǔn)管） 4（空白管）（空白管）酶液酶液0.50.5-標(biāo)準(zhǔn)麥芽標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液糖溶液-0.5-淀粉溶液淀粉溶液1111蒸餾水蒸餾水-0.5n將各管混勻，放在將各管混勻，放在25，水浴中保溫，水浴中保溫3分鐘后，分鐘后，立即向各管中加人立即向各管中加人1 3，5-二二硝基水楊酸溶液硝基水楊酸溶液2毫升毫升。n（2）取出各試管，放人沸水浴中加熱）取出各試管，放人沸水浴中加熱5分鐘。冷至室溫，加水稀釋至分鐘。冷至室溫，加水稀釋至25毫升。毫升。將各管充分混勻。將各管充分混勻。n（3）用空白管作對(duì)照；在）用空白管作對(duì)照；在500nm處測(cè)處測(cè)定各管的光吸收值，記錄結(jié)果。定各管的光吸收值，記錄結(jié)果。n4 4計(jì)計(jì) 算算n本實(shí)驗(yàn)規(guī)定：本實(shí)驗(yàn)規(guī)定：25時(shí)時(shí)3min3min內(nèi)水解淀粉釋放內(nèi)水解淀粉釋放1mg1mg麥芽糖麥芽糖所需的酶量為所需的酶量為1 1個(gè)酶活力單位（個(gè)酶活力單位（U U）。）。n根據(jù)溶液的濃度與光吸收值成正比的關(guān)系，即：根據(jù)溶液的濃度與光吸收值成正比的關(guān)系，即：A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)A未知未知C標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)C未知未知nC（酶液管濃度）（酶液管濃度）A酶酶C標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)n則則15粒種子或幼苗的總活力單位粒種子或幼苗的總活力單位= C酶酶N酶酶V酶酶nN為酶液的稀釋倍數(shù)為酶液的稀釋倍數(shù)nV為提取酶液的總體積為提取酶液的總體積思考題思考