醫(yī)學(xué)檢驗本科畢業(yè)論文范例,供參考

1、 畢 業(yè) 論 文題 目：乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法學(xué)驗證 姓 名： 學(xué) 號： 系 別： 年 級： 專 業(yè)：   指導(dǎo)教師： 二 一 一 年 十二 月目 錄中文文獻(xiàn)英文摘要前 言。1. 材料與方法。1.1 試劑盒1.2 儀器1.3 方法鋪板方案加樣步驟2. 結(jié)果2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍2.2 準(zhǔn)確度（回收率）的驗證22.3 精密度的驗證2.3.1 板內(nèi)精密度的驗證2.3.2 板間精密度的驗證2.4 檢測限（LOD）計算53. 討論53.1 乙肝表面抗原定量分析的意義53.2 常用定量分析方法63.3 方法概述63.4 方法學(xué)驗證內(nèi)容63.5 結(jié)果分析及應(yīng)用評價7參考文獻(xiàn)7

2、乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法學(xué)驗證摘 要目的：對福州藍(lán)圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗證，以判斷是否能用于臨床樣本分析。方法：ELISA法定量分析，應(yīng)用試劑盒HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品從濃度為8ng/ml做2倍稀釋的6個濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以6，3，1.5ng/ml 3個濃度梯度5復(fù)孔做準(zhǔn)確度，精密度和檢測限等方法學(xué)驗證。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.997，準(zhǔn)確度97.07%，1.5ng/ml的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)<15%的要求，檢測限LOD為0.172ng/ml，低濃度樣品（<1.5ng/ml）的檢測在準(zhǔn)

3、確性和精密度方面都低于高濃度樣品，不適合低濃度樣品的檢測。結(jié)論：該HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒不能用于臨床標(biāo)本的分析。關(guān)鍵詞 乙肝表面抗原 ELISA 定量分析 方法學(xué)驗證The reification of the HBsAg ELISA quantitative methodologyAbstractObject: to verify the quantitative methodology of Fuzhou blueprint biological engineering company to make sure whether it ca be used to the an

4、alysis of Clinical Sample. Methods: ELISA quantitative methodology , make an Application of the standard HBsAg kit from the concentration of 8 ng/ml do 2 times diluted six concentration gradient to constitute a standard curve, testing With 6, 3, 1.5 ng/ml 3 a concentration gradient 5 accurately prec

5、ise and detection .Results: standard curve ,R2=0.997, the accuracy of RSD of 1.5ng/m is 16.78%，the RSD that cannot meet the demand of ng/ml basic level is less than <15% in common. The LOD is 0.172ng/ml, the testing of Low concentration samples （<1.5ng/ml）are lower than high concentration samp

6、les in both accuracy and precision , which as a result make it unsuitable for low concentration sample testing. Conclusion: the ELISA quantitative analysis kit of HBsAg cannot be used for the analysis of Clinical Sample.Key wordsHBsAg Quantitative analysis Verification Methodology. 前 言乙肝病毒感染是我國最常見的感

7、染性疾病之一，而乙型肝炎血清標(biāo)志物是檢測乙肝病毒感染最主要的病原標(biāo)志。隨著免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，抗原抗體檢測靈敏度明顯提高，使低水平乙肝病毒得以檢出，對臨床診斷及流行病學(xué)有重要意義1。ELISA法具有較高靈敏度、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、可進(jìn)行定量和半定量測定等優(yōu)點，可以在酶免疫分析儀上做批量檢測。目前臨床上多傾向于做定量分析，若想知道檢驗結(jié)果是否可靠，實驗室則必須對所用試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗證，本實驗對福州藍(lán)圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行準(zhǔn)確度，精密度和檢測限等方法學(xué)驗證，現(xiàn)報告如下。1. 材料與方法1.1 試劑盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒，福州藍(lán)圖生

8、物工程有限公司出品。1.2 儀器酶標(biāo)儀：Bio-Rad 680 ；洗板機(jī)：Bio-Rad 1575；超純水系統(tǒng)：Millipore Elix ；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)上海精宏實驗設(shè)備有限公司；振蕩器（蘇州管械，KJ-201A）；移液器；Tip頭；EP管。1.3 方法溶液配置 1×PBS緩沖液的配置： 稱取8g NaCl、 0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可。標(biāo)準(zhǔn)品的配置：原始標(biāo)準(zhǔn)品濃度為8 ng/ml。取6個2mlEP管，分別標(biāo)記為S1-S6。50ul

9、/well, 共1孔需50ul，每孔配置60ul備用，按照下表稀釋方案進(jìn)行稀釋。編號終濃度（ ng/ml）預(yù)加1×PBS取剩余（ul）標(biāo)記（ul）S180標(biāo)準(zhǔn)品120S2460S16060S3260S26060S4160S36060S50.560S46060S60.2560S56060 質(zhì)控品的配置：50ul/well, 共5復(fù)孔需250ul，配置300ul備用，取3個2mlEP管，分別標(biāo)記為C1，C2，C3，按照下表稀釋方案進(jìn)行稀釋。編號終濃度（ ng/ml）預(yù)加1×PBS取剩余（ul）標(biāo)記（ul）C16150標(biāo)準(zhǔn)品450C23300C1300300C31.5300C23

10、003001.3.2鋪板方案 取出試劑盒中已包被酶標(biāo)板，取出板條，按照下表鋪板方案進(jìn)行鋪板在相應(yīng)孔中依次加入系列標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及空白對照，每孔50ul?？瞻讓φ占尤?×PBS緩沖液。12345AS1C1C2C3PBSBS2C1C2C3PBSCS3C1C2C3DS4C1C2PBSES5C1C3PBSFS6C2C3PBS加樣步驟加入酶標(biāo)抗體，50 ul/well，震蕩。37電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育60min，取出后洗板4次， 加入A、B液, 50 ul/ well，37電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育15 min。加入終止液，50 ul/ well。酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，蓋上蓋子，在電腦上打開Microplat

11、e Manager 5.2軟件，選擇450nm波長（參照波長630nm），設(shè)置LAYOUT和報告模式，測定各孔吸收值。2. 結(jié)果2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度對應(yīng)的實測OD值HBsAg(ng/ml)84210.50.25OD 1.661.000.620.390.310.27以HBsAg理論濃度為橫坐標(biāo)，所測OD值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察線性關(guān)系，結(jié)果顯示R2=0.9973，顯示具有良好的相關(guān)性2.2 準(zhǔn)確度（回收率）的驗證 質(zhì)控品理論稀釋濃度對應(yīng)實測濃度值HBsAg(ng/ml)測定值1234566.244.565.736.096.4033.363.293.553.283.48

12、1.51.241.271.171.171.20質(zhì)控品做了3個濃度梯度，每個濃度做了5個復(fù)孔，下表是對每個濃度梯度進(jìn)行準(zhǔn)確度（回收率）的驗證。HBsAg(ng/ml)測定值（ng/ml）回收率（%）平均回收率RR（%）3個濃度的平均回收率66.24103.9397.5897.07%4.5675.925.7395.576.09101.456.40106.6033.36112.13113.073.29109.573.55118.403.28109.403.48115.831.51.2482.4780.561.2784.671.1778.071.1777.671.2079.93 結(jié)果顯示HBsAg 6

13、ng/ml和3ng/ml的平均回收率為97.58%，113.07%，滿足限度要求在85%-115%的范圍內(nèi)，而HBsAg 1.5ng/ml的平均回收率為80.56%，滿足方法定量限在80%-120%的范圍內(nèi)。3個濃度梯度的平均回收率為97.7%，顯示準(zhǔn)確性好。2.3精密度的驗證2.3.1 板內(nèi)精密度的驗證HBsAg(ng/ml)測定值RSD(%)1234566.244.565.736.096.405.80±0.7412.7333.363.293.553.283.483.39±0.123.501.51.241.271.171.171.201.21±0.043.69上

14、表中RSD(%)這一參數(shù)表示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，也就是變異系數(shù)CV值，HBsAg 6ng/ml的5個復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73%，顯示孔間差異較大，精密度不高，但是也符合ng/ml級RSD水平的一般應(yīng)<15%的要求，其中有一孔濃度為4.55，與其它孔比較差異較大，可能是由于操作引起例如加樣不準(zhǔn)。而3ng/ml,和1.5ng/ml的變異系數(shù)CV為3.5%，3.7%，符合顯示孔間重復(fù)性好，符合ng/ml級RSD水平的一般應(yīng)<15%的要求，精密度高。 板間精密度的驗證 從同一實驗室中獲取2組同樣的數(shù)據(jù)，做板間精密度的驗證。首先對同一實驗條件下不同實驗人員所獲得的數(shù)據(jù)是否可用于板間分析做驗

15、證。HBsAg(ng/ml)84210.50.25第二組OD值1.981.420.860.580.400.31第三組OD值 1.310.770.360.170.090.03以HBsAg理論濃度為橫坐標(biāo)，所測OD值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察線性關(guān)系。以上標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示第二組數(shù)據(jù)的R2 =0.967，第三組數(shù)據(jù)R2 =0.991。第二組數(shù)據(jù)由于有一些孔與標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離較大，但考慮到隨機(jī)抽樣與均數(shù)存在一定誤差，還是可以用于統(tǒng)計學(xué)分析。下表對3組數(shù)據(jù)做板間分析。HBsAg(ng/ml)測定值RSD(%)1234566.236.105.994.555.785.395.736.086.346.086.

16、646.496.396.845.966.04±0.55 9.1033.363.362.593.282.932.713.553.532.813.283.072.493.472.992.523.06±0.3712.061.51.241.461.191.271.51.241.171.731.251.161.711.211.191.761.111.34±0.2316.78從表中3個組的數(shù)據(jù)比較可知，HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的RSD分別為9.10%，12.06%，滿足對ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)<15%的要求，精密度高。而HBsAg 1.5ng/ml

17、的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)<15%的要求，顯示低濃度的孔間重復(fù)性差，精密度不是很高，故以下對HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的三組數(shù)據(jù)做分析。 對HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的準(zhǔn)確性，精密度分析HBsAg(ng/ml)測定值（ng/ml）回收率（%）平均回收率RR（%）SD%CV%第一組數(shù)據(jù)1.5 ng/ml1.2482.4780.562.983.701.2784.671.1778.071.1777.671.2079.93第二組數(shù)據(jù)1.5 ng/ml1.4697.60109.19.498.701.50100.001.73115.601.721

18、14.531.77117.67第三組數(shù)據(jù)1.5 ng/ml1.1979.4780.273.804.741.2583.131.2583.531.2281.071.1174.13 從上表可知第一組數(shù)據(jù)和第三組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性差，精密度高。而第二組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高，而精密度相對于第一組和第三組數(shù)據(jù)要好。綜上對于HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的這一低濃度梯度的板內(nèi)準(zhǔn)確性和板間精密度相對于高濃度的線性要差一些。2.4 檢測限（LOD）計算 LOD為取空白孔的OD值的均數(shù)加2倍標(biāo)準(zhǔn)差。12345MeanSDLOD空白孔OD值0.1580.1530.160.1620.170.160.006220.172由上表可

19、知，LOD為0.172。檢測限（LOD）表示分析方法檢測低濃度樣品的能力，也稱為方法的靈敏度，LOD通常為標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點，要求標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點應(yīng)>LOD，此標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低濃度點為0.25，大于LOD（0.172），故此標(biāo)準(zhǔn)曲線線性好。3. 討論3.1 乙肝表面抗原定量分析的意義乙肝表面抗原是乙肝兩對半的其中一項，乙肝兩對半定性檢測對乙肝疾病的診斷，病情監(jiān)測，療效觀察起到了一定的作用。但隨著臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，乙肝兩對半定性檢測已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床及患者的要求，特別是在療效觀察以及乙肝疫苗注射后抗體產(chǎn)生情況的觀察上有明顯的不足。隨著檢驗醫(yī)學(xué)的發(fā)展，乙肝兩對半定量測定成為可行，大大

20、彌補(bǔ)了乙肝兩對半定性檢測的不足。而且乙肝兩對半定量檢測可與HBV DNA熒光測定相互補(bǔ)充，綜合評價患者病情與藥物療效，為低含量的慢性乙肝、病毒攜帶者提供了正確判斷病情的依據(jù)【2】。這在目前的臨床治療中應(yīng)用十分廣泛。3.2 常用定量分析方法此次實驗只是對一種試劑盒的可用性進(jìn)行方法學(xué)驗證， 而目前常用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA法又稱解離增強(qiáng)鑭系熒光免疫分析，是近十年發(fā)展起來的一種微量分析方法。此技術(shù)集酶標(biāo)記、同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點于一身，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，且測定范圍更寬，試劑盒貨架壽命長，操作簡便和非放射性等特點，成為最有潛力的一種標(biāo)記免疫分析方法【3】。全自動酶免

21、分析儀目前也廣泛應(yīng)有，自動化、標(biāo)準(zhǔn)化的操作手段使實驗達(dá)到了全過程控制和全過程標(biāo)準(zhǔn)化分析，大大提高了實驗的精密度【4】，使檢測結(jié)果更趨穩(wěn)定，從而保證了實驗結(jié)果的可靠性。3.3 方法概述目前普遍使用的HBsAg試劑盡管在制備時采用了高親和力的單克隆抗體，并且使包被抗體、酶標(biāo)抗體的結(jié)合位點盡可能的遠(yuǎn)。以避免競爭抑制，最大程度地解決鉤狀效應(yīng)（HOOK）的問題【5】。本次實驗是對實驗室的一種試劑盒，即福州藍(lán)圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗證，以判斷是否能用于臨床樣本分析。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗。往預(yù)先包被HBsAg捕獲抗體的包被微孔中，依次加

22、入標(biāo)本，標(biāo)準(zhǔn)品，HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化為黃色。顏色的深淺和樣品中得HBsaAg呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度OD值，計算樣品濃度。應(yīng)用試劑盒HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品從濃度為8，4，2，1, 0.5 ，0.25ng/ml 6個濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以6，3，1.5ng/ml 3個濃度梯度5復(fù)孔做質(zhì)控，進(jìn)行準(zhǔn)確度，精密度和檢測限等方法學(xué)驗證。選擇最低濃度為0.25ng/ml的原因是因為，絕大多數(shù)HBV感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg，含量在5ng/ml 600ug/ml之間，高者可達(dá)2000ugml

23、以上【6】，滿足了現(xiàn)階段文獻(xiàn)報道的最低濃度值。3.4 方法學(xué)驗證內(nèi)容 方法學(xué)驗證內(nèi)容一般包括標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確度，精密度和檢測限。標(biāo)準(zhǔn)曲線亦稱校正曲線，系指生物樣品中所測定的樣品濃度與響應(yīng)的相關(guān)性，通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評件，此實驗所用了6個濃度點建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法準(zhǔn)確度指待測濃度與真實濃度的接近值了，一般用相對回收率表示，限度要求在85%115%的范圍內(nèi)。精密度則表示分析方法的可重復(fù)性，是對同一樣品每次測定結(jié)果的一致性，用標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，可做板內(nèi)和板間的驗證，對于ug/ml級水平的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差一般應(yīng)<10%, ng/ml級水平的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差一般應(yīng)<15%。檢測

24、限則表示分析低濃度樣品的能力，通常又稱為靈敏度。3.5 結(jié)果分析及應(yīng)用評價第一組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.9973，顯示具有良好的相關(guān)性，HBsAg 濃度為6ng/ml和3ng/ml 的回收率分別為為97.58%，符合113.07%，符合限度要求在85%115%的范圍內(nèi)。但是HBsAg 濃度為.5ng/ml的回收率為80.56%，顯示此試劑盒對于低濃度樣品的檢測準(zhǔn)確度差。在精密度方面，6，3，1.5ng/ml變異系數(shù)CV分別為12.73% ，3.69% ，3.50%，而HBsAg 6ng/ml的5個復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73%，顯示孔間差異較大，精密度不高，但是也符合ng/ml級RSD水平的一般應(yīng)<15%的要求，其中有一孔濃度為4.55，與其它孔比較差異較大，可能是由于操作引起例如加樣不準(zhǔn)不屬于試劑盒的問題，故可以認(rèn)為此試劑盒