第十教學(xué)單元——第三章病毒(一)

1、病病 毒毒病毒和我們的關(guān)系病毒和我們的關(guān)系“Virus”，它是由，它是由拉丁文中拉丁文中“virus”一詞演化而來(lái)，一詞演化而來(lái)，即即“有毒的物質(zhì)有毒的物質(zhì)”1886年，年，A. Mayer 發(fā)現(xiàn)具有傳染性的煙草花葉??；發(fā)現(xiàn)具有傳染性的煙草花葉??；1892年，年，D. Ivanovsky煙草花葉病病原體能通過(guò)細(xì)菌濾器：煙草花葉病病原體能通過(guò)細(xì)菌濾器： 一種能通過(guò)細(xì)菌濾器的一種能通過(guò)細(xì)菌濾器的“細(xì)菌毒素細(xì)菌毒素”或或“極小細(xì)極小細(xì)菌菌”1898年，年，M W Beijerinck對(duì)煙草花葉病病原體的研究結(jié)果：對(duì)煙草花葉病病原體的研究結(jié)果：1884年年Chamberland發(fā)明細(xì)菌濾器發(fā)明細(xì)菌濾器

2、1900年前后，包括口蹄疫（年前后，包括口蹄疫（foot and mouth disease）在內(nèi)的）在內(nèi)的多種動(dòng)植物疾病病原體的濾過(guò)性特性被證明。多種動(dòng)植物疾病病原體的濾過(guò)性特性被證明。F W Twort（1915年）、年）、F dHerelle（1917年），分別發(fā)現(xiàn)年），分別發(fā)現(xiàn)細(xì)菌（細(xì)菌（Shigella dysenteriae）病毒）病毒-噬菌體噬菌體1935年，年，W M Stanley首次提純并結(jié)晶了煙草花葉病毒；首次提純并結(jié)晶了煙草花葉病毒； Bawden等證明煙草花葉病毒的本質(zhì)為核蛋白；等證明煙草花葉病毒的本質(zhì)為核蛋白；1940年，年，Kausche首先用電鏡觀察到煙草花葉病

3、毒顆粒首先用電鏡觀察到煙草花葉病毒顆粒.1952年，年，Hershey和和Chase利用同位素證實(shí)噬菌體的遺傳物利用同位素證實(shí)噬菌體的遺傳物質(zhì)是質(zhì)是DNA，將人類(lèi)帶入病毒的分子生物學(xué)階段。，將人類(lèi)帶入病毒的分子生物學(xué)階段。 宿主細(xì)胞在病毒等多種誘生劑刺激下產(chǎn)生的一組相對(duì)分子宿主細(xì)胞在病毒等多種誘生劑刺激下產(chǎn)生的一組相對(duì)分子量低的糖蛋白，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能。分量低的糖蛋白，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能。分 、三組，分別由白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和三組，分別由白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。 、屬屬型干擾素，型干擾素，屬屬型干擾素。型干擾素。四、病毒的培養(yǎng)和純化四、病毒的培養(yǎng)和純化

4、將少量噬菌體與將少量噬菌體與大量宿主細(xì)胞混合后，大量宿主細(xì)胞混合后，在合適條件下培養(yǎng)一在合適條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后，在平板表定時(shí)間后，在平板表面布滿(mǎn)宿主細(xì)胞的菌面布滿(mǎn)宿主細(xì)胞的菌苔上，出現(xiàn)一個(gè)個(gè)肉苔上，出現(xiàn)一個(gè)個(gè)肉眼可見(jiàn)的透明小圓斑。眼可見(jiàn)的透明小圓斑。（ “負(fù)菌落負(fù)菌落” ） 設(shè)設(shè)0.10mL稀釋度為稀釋度為10-6的病毒懸液可產(chǎn)生的病毒懸液可產(chǎn)生75個(gè)噬菌斑，則樣品的噬菌斑形成單位為：個(gè)噬菌斑，則樣品的噬菌斑形成單位為：PFU/mL=（75 PFU /0.10 mL ）（106）=7.5 108若標(biāo)本經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋進(jìn)行接種并輔以染色處理，病毒可若標(biāo)本經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋進(jìn)行接種并輔以染色處理，病毒可在

5、培養(yǎng)的細(xì)胞單層上形成肉眼可見(jiàn)的局部病損區(qū)域，即在培養(yǎng)的細(xì)胞單層上形成肉眼可見(jiàn)的局部病損區(qū)域，即蝕斑（蝕斑（plaque）或稱(chēng)空斑。）或稱(chēng)空斑。 在某些感染病毒的宿主細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，出現(xiàn)光學(xué)在某些感染病毒的宿主細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，出現(xiàn)光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)的大小、形狀和數(shù)量不等的小體。顯微鏡下可見(jiàn)的大小、形狀和數(shù)量不等的小體。（鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、凝膠層析、離子交換等）（鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、凝膠層析、離子交換等）差速離心、梯度離心（超速離心）差速離心、梯度離心（超速離心） 個(gè)體小（測(cè)量單位個(gè)體?。y(cè)量單位nm），必需在電鏡下觀察；），必需在電鏡下觀察；基本構(gòu)造：核衣殼基本構(gòu)造：

6、核衣殼(nucleocapsid)非基本構(gòu)造非基本構(gòu)造DNA或或RNA核心核心衣殼衣殼包膜包膜刺突刺突螺旋對(duì)稱(chēng)衣殼病毒：煙草花葉病毒螺旋對(duì)稱(chēng)衣殼病毒：煙草花葉病毒 病毒可以根據(jù)衣殼中衣殼粒的排列方式將其分為病毒可以根據(jù)衣殼中衣殼粒的排列方式將其分為3 3種：種：二十面體對(duì)稱(chēng)衣殼病毒：腺病毒二十面體對(duì)稱(chēng)衣殼病毒：腺病毒復(fù)合對(duì)稱(chēng)衣殼病毒：復(fù)合對(duì)稱(chēng)衣殼病毒：T4T4噬菌體噬菌體 殼體外形如中空的蛋白質(zhì)圓殼體外形如中空的蛋白質(zhì)圓管，呈堅(jiān)硬或柔韌狀。管，呈堅(jiān)硬或柔韌狀。 由由2130個(gè)個(gè)相同的蛋白質(zhì)亞基相同的蛋白質(zhì)亞基（158個(gè)氨基酸）個(gè)氨基酸）以逆時(shí)針?lè)揭阅鏁r(shí)針?lè)较蚵菪隣钆帕?，形成一個(gè)長(zhǎng)向螺旋狀排列，

7、形成一個(gè)長(zhǎng)300nm，內(nèi)徑，內(nèi)徑4nm，外徑，外徑15nm的剛直中空柱。的剛直中空柱。ssRNA盤(pán)繞在盤(pán)繞在殼體內(nèi)面由亞基形成的溝內(nèi)，殼體內(nèi)面由亞基形成的溝內(nèi)，與蛋白質(zhì)亞基通過(guò)弱鍵結(jié)合。與蛋白質(zhì)亞基通過(guò)弱鍵結(jié)合。螺旋對(duì)稱(chēng)殼體病毒螺旋對(duì)稱(chēng)殼體病毒代表：代表：TMV流感病毒流感病毒衣殼有衣殼有20個(gè)等邊三角形面，個(gè)等邊三角形面，12個(gè)頂角。個(gè)頂角。包括包括12個(gè)五鄰體（分布在個(gè)五鄰體（分布在12個(gè)頂角上的個(gè)頂角上的衣殼粒）和衣殼粒）和240個(gè)六鄰體（分布在棱上和個(gè)六鄰體（分布在棱上和面上的非頂角衣殼粒）。核心為線狀雙面上的非頂角衣殼粒）。核心為線狀雙鏈鏈DNA(dsDNA)，核酸分子以高度卷曲，核

8、酸分子以高度卷曲的狀態(tài)存在于衣殼內(nèi)。的狀態(tài)存在于衣殼內(nèi)。 五鄰體五鄰體六鄰體六鄰體二十面體衣殼在形成時(shí)通常是由五邊形二十面體衣殼在形成時(shí)通常是由五邊形衣殼粒（五鄰體）和六邊形衣殼粒（六衣殼粒（五鄰體）和六邊形衣殼粒（六鄰體）組成的鄰體）組成的（參見(jiàn)（參見(jiàn)P74） 其殼體由頭部和尾部組成。通常頭部呈二十面體對(duì)稱(chēng)，尾其殼體由頭部和尾部組成。通常頭部呈二十面體對(duì)稱(chēng)，尾部呈螺旋對(duì)稱(chēng)。線狀部呈螺旋對(duì)稱(chēng)。線狀dsDNA折疊盤(pán)繞于頭部的核心。折疊盤(pán)繞于頭部的核心。代表：大腸桿菌的代表：大腸桿菌的T偶數(shù)噬菌體偶數(shù)噬菌體頭頭尾髓尾髓頸環(huán)頸環(huán)尾鞘尾鞘尾絲尾絲刺突刺突基板基板1、 病毒的核酸病毒的核酸病毒基因組大小

9、差別很大病毒基因組大小差別很大 最小的基因組（最小的基因組（MS2病毒，病毒，QB病毒）只有病毒）只有1 106 Da，僅夠編碼，僅夠編碼34種蛋白質(zhì)，這些病毒利用重疊基因來(lái)節(jié)省空種蛋白質(zhì)，這些病毒利用重疊基因來(lái)節(jié)省空間。最大的基因組（間。最大的基因組（T偶數(shù)噬菌體，皰疹病毒，痘病毒）達(dá)偶數(shù)噬菌體，皰疹病毒，痘病毒）達(dá)1.6 108 Da，可編碼，可編碼100多種蛋白質(zhì)。多種蛋白質(zhì)。單鏈單鏈DNA（ss DNA）；）；雙鏈雙鏈DNA（ds DNA）；）；單鏈單鏈RNA（ss RNA）；）；雙鏈雙鏈RNA（ds RNA）4種類(lèi)型種類(lèi)型(1) DNA病毒病毒 特殊的堿基：除常見(jiàn)核苷酸外，許多病毒具

10、有特殊的堿基，特殊的堿基：除常見(jiàn)核苷酸外，許多病毒具有特殊的堿基，如，大腸桿菌如，大腸桿菌T偶數(shù)噬菌體以偶數(shù)噬菌體以5-羥甲基胞嘧啶羥甲基胞嘧啶代替胞嘧啶。代替胞嘧啶。 (2) RNA病毒病毒 2、病毒的蛋白質(zhì)、病毒的蛋白質(zhì)3、病毒的其它化學(xué)成分、病毒的其它化學(xué)成分 （一）雙鏈（一）雙鏈DNA噬菌體的復(fù)制噬菌體的復(fù)制1. 一步生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)一步生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 病毒的滴度（病毒的滴度（titer），又稱(chēng)效價(jià)，是指每毫升樣品中），又稱(chēng)效價(jià)，是指每毫升樣品中含有的侵染性病毒粒子的數(shù)量。含有的侵染性病毒粒子的數(shù)量。(雙層平板法測(cè)雙層平板法測(cè))潛伏期：是從噬菌潛伏期：是從噬菌體吸附于宿主細(xì)胞體吸附于宿主細(xì)胞表面到子

11、代噬菌體表面到子代噬菌體釋放所需的最短時(shí)釋放所需的最短時(shí)間間裂解量：是每個(gè)受裂解量：是每個(gè)受侵染的細(xì)胞所產(chǎn)生侵染的細(xì)胞所產(chǎn)生的子代噬菌體的數(shù)的子代噬菌體的數(shù)目。目。 2. 噬菌體的復(fù)制過(guò)程（烈性噬菌體的裂解周期）噬菌體的復(fù)制過(guò)程（烈性噬菌體的裂解周期） 受體（吸附）位受體（吸附）位點(diǎn)：細(xì)胞壁上的點(diǎn)：細(xì)胞壁上的脂多糖、蛋白質(zhì)、脂多糖、蛋白質(zhì)、磷壁酸，以及鞭磷壁酸，以及鞭毛和菌毛毛和菌毛附著附著 固著固著 尾部收縮尾部收縮 刺入細(xì)胞刺入細(xì)胞 DNA注入注入T4噬菌體吸附和侵入宿主細(xì)胞過(guò)程：噬菌體吸附和侵入宿主細(xì)胞過(guò)程：如果大量噬菌體在短時(shí)間內(nèi)吸附于同一細(xì)胞上，使細(xì)胞壁產(chǎn)生許多如果大量噬菌體在短時(shí)間

12、內(nèi)吸附于同一細(xì)胞上，使細(xì)胞壁產(chǎn)生許多小孔，也可引起細(xì)胞立即裂解，但并未進(jìn)行噬菌體的增殖，這種現(xiàn)小孔，也可引起細(xì)胞立即裂解，但并未進(jìn)行噬菌體的增殖，這種現(xiàn)象稱(chēng)為象稱(chēng)為自外裂解自外裂解（lysis from without）。）。早期早期mRNA ：宿主：宿主RNA聚合酶開(kāi)始合成的病毒聚合酶開(kāi)始合成的病毒mRNA，即噬，即噬菌體菌體DNA復(fù)制前轉(zhuǎn)錄的復(fù)制前轉(zhuǎn)錄的mRNA。早期蛋白：早期早期蛋白：早期mRNA翻譯成的蛋白，這些蛋白將接管宿主翻譯成的蛋白，這些蛋白將接管宿主細(xì)胞并合成病毒核酸。其中一些酶將宿主細(xì)胞并合成病毒核酸。其中一些酶將宿主DNA降降解成核苷酸，為病毒解成核苷酸，為病毒DNA的合成

13、提供原料；一些的合成提供原料；一些蛋白對(duì)宿主細(xì)胞蛋白對(duì)宿主細(xì)胞RNA聚合酶進(jìn)行修飾，使其識(shí)別聚合酶進(jìn)行修飾，使其識(shí)別病毒的病毒的DNA啟動(dòng)子，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄合成中期啟動(dòng)子，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄合成中期mRNA。中期中期mRNA：即病毒：即病毒DNA復(fù)制所需的酶的復(fù)制所需的酶的mRNA。 噬菌體噬菌體DNADNA注入宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞自身的注入宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞自身的DNADNA、RNARNA和蛋白質(zhì)的合成便會(huì)中止，轉(zhuǎn)而合成病毒復(fù)制所需的成分。和蛋白質(zhì)的合成便會(huì)中止，轉(zhuǎn)而合成病毒復(fù)制所需的成分。中期蛋白中期蛋白：中期中期mRNA翻譯成的蛋白翻譯成的蛋白(DNA復(fù)制所需的酶、羥復(fù)制所需的酶、羥甲基胞嘧啶合成酶以

14、及晚期甲基胞嘧啶合成酶以及晚期mRNA聚合酶等聚合酶等)，病，病毒毒DNA開(kāi)始復(fù)制開(kāi)始復(fù)制(某些堿基的修飾是抵制宿主的限某些堿基的修飾是抵制宿主的限制制)。 多聯(lián)體多聯(lián)體-合成的合成的T4噬菌體噬菌體DNA具有末端冗余具有末端冗余(重復(fù)的一重復(fù)的一段堿基序列段堿基序列)，大約，大約6-10個(gè)克隆通過(guò)末端冗余序列個(gè)克隆通過(guò)末端冗余序列連接在一起，這種由若干單元同向相連形成的超連接在一起，這種由若干單元同向相連形成的超長(zhǎng)鏈長(zhǎng)鏈DNA稱(chēng)為多聯(lián)體，多聯(lián)體在裝配過(guò)程中被切稱(chēng)為多聯(lián)體，多聯(lián)體在裝配過(guò)程中被切割。割。 晚期晚期mRNA： DNA復(fù)制完成后合成的復(fù)制完成后合成的mRNA(指導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白、指導(dǎo)結(jié)構(gòu)

15、蛋白、裝配蛋白、溶菌酶等裝配蛋白、溶菌酶等)。晚期蛋白：噬菌體的結(jié)構(gòu)蛋白、裝配蛋白、溶菌酶等這些細(xì)晚期蛋白：噬菌體的結(jié)構(gòu)蛋白、裝配蛋白、溶菌酶等這些細(xì)胞裂解期間合成的蛋白質(zhì)胞裂解期間合成的蛋白質(zhì)。大致分為大致分為4個(gè)獨(dú)立的途徑：個(gè)獨(dú)立的途徑：1）頭部殼體裝入）頭部殼體裝入DNA形成形成成熟的頭部成熟的頭部2）由基板、尾管、尾鞘組）由基板、尾管、尾鞘組裝成無(wú)尾絲的尾部；裝成無(wú)尾絲的尾部；3）頭部與尾部自發(fā)結(jié)合；）頭部與尾部自發(fā)結(jié)合；4）裝上尾絲）裝上尾絲頭部頭部衣殼粒衣殼粒DNA衣殼衣殼尾部尾部尾鞘尾鞘噬菌體噬菌體尾絲尾絲 37培養(yǎng)時(shí)，侵染約培養(yǎng)時(shí)，侵染約22分鐘后，分鐘后，E. coli發(fā)生裂

16、解并發(fā)生裂解并釋放約釋放約300個(gè)個(gè)T4噬菌體。這一過(guò)程需要一些噬菌體。這一過(guò)程需要一些T4基因的支基因的支持：持： 一種基因指導(dǎo)溶菌酶的合成，溶菌酶可以攻擊細(xì)胞一種基因指導(dǎo)溶菌酶的合成，溶菌酶可以攻擊細(xì)胞壁的肽聚糖；壁的肽聚糖； 另一種噬菌體蛋白稱(chēng)為另一種噬菌體蛋白稱(chēng)為holin，它可破壞細(xì)胞膜，使，它可破壞細(xì)胞膜，使溶菌酶到達(dá)并破壞細(xì)胞壁，同時(shí)阻止細(xì)胞膜上的能量溶菌酶到達(dá)并破壞細(xì)胞壁，同時(shí)阻止細(xì)胞膜上的能量代謝反應(yīng)。代謝反應(yīng)。 （二）單鏈（二）單鏈DNA噬菌體的復(fù)制噬菌體的復(fù)制(1) X174噬菌體噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，利用宿主進(jìn)入宿主細(xì)胞后，利用宿主DNA聚聚合酶以單鏈合酶以單鏈D

17、NA為模板合成雙鏈模式為模板合成雙鏈模式(復(fù)制型復(fù)制型DNA或或RF DNA); (2)隨后復(fù)制型隨后復(fù)制型DNA將指導(dǎo)合成更多的將指導(dǎo)合成更多的RF DNA、mRNA和和+DNA基因組，基因組，mRNA翻譯成病毒蛋白；翻譯成病毒蛋白；(3)此類(lèi)噬菌體的裂解和釋放機(jī)制和此類(lèi)噬菌體的裂解和釋放機(jī)制和T4噬菌體基本相同。噬菌體基本相同。 E. coli噬菌體噬菌體X174的遺傳物質(zhì)是單鏈的遺傳物質(zhì)是單鏈DNA。其。其DNA序序列與病毒列與病毒mRNA相同，即為正鏈，其基因組中有重疊基相同，即為正鏈，其基因組中有重疊基因（因（overlapping genes）。）。復(fù)制過(guò)程復(fù)制過(guò)程1. X174復(fù)

18、制過(guò)程復(fù)制過(guò)程2. 絲狀絲狀ssDNA噬菌體噬菌體(如：如：fd噬菌體噬菌體)(1)絲狀噬菌體通過(guò)附著絲狀噬菌體通過(guò)附著于大腸桿菌性菌毛而侵于大腸桿菌性菌毛而侵染宿主細(xì)胞。染宿主細(xì)胞。(2)噬菌體噬菌體DNA在吸附蛋在吸附蛋白協(xié)助下沿著或通過(guò)菌白協(xié)助下沿著或通過(guò)菌毛注入宿主。毛注入宿主。(3)噬菌體噬菌體DNA首先合成首先合成復(fù)制型復(fù)制型DNA，然后進(jìn)行，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，噬菌體轉(zhuǎn)錄，噬菌體DNA以滾以滾環(huán)模式進(jìn)行復(fù)制。環(huán)模式進(jìn)行復(fù)制。絲狀絲狀ssDNA噬菌體單鏈?zhǔn)删w單鏈DNA為環(huán)形，位于衣殼中心。其復(fù)制為環(huán)形，位于衣殼中心。其復(fù)制過(guò)程不同于過(guò)程不同于X174噬菌體或其他噬菌體或其他ssDNA噬菌體。噬菌體。 A-蛋白蛋白細(xì)細(xì)胞胞壁壁細(xì)胞膜細(xì)胞膜衣殼蛋白衣殼蛋白噬菌體噬菌體ssDNA C-蛋白蛋白(4)子代顆粒的裝配是在噬菌體子代顆粒的裝配是在噬菌體DNA穿過(guò)宿主細(xì)胞外膜時(shí)完成穿過(guò)宿主細(xì)胞外膜時(shí)完成并分泌出來(lái)，