培養(yǎng)基配方及配制方法

1、培養(yǎng)基配方1 斜面菌種保存培養(yǎng)基1.1PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸0.5h,紗布 過濾，濾液補(bǔ)足1000ml，再加15g葡萄糖和15-20g瓊脂，充分溶解 后趁熱紗布過濾，分裝試管，每試管約 5-10ml （視試管大小而定）， 121 C滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?.2 麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基 麥芽汁的制備：干麥芽首先進(jìn)行粉碎（不能太粗，也不必太細(xì)。太粗影響糖化效率， 過細(xì)影響過濾速度） ，按麥芽重量的 34 倍加水， 攪拌均勻后，37 C左右浸泡1小時，然后緩緩加溫至5563C（在升 溫過程中應(yīng)不斷攪拌使溫度

2、均勻） ，保溫 46 小時（用 0.02摩爾/升碘 液測定為黃色至無色時） ，糖化結(jié)束。在糖化過程中，應(yīng)每小時攪拌 一次。取過濾后的清液，加 1.8%瓊脂，分裝試管，每試管約 5-10ml（視試管大小而定），121C滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面，冷 卻后貯存?zhèn)溆谩? 基菌落總數(shù)檢測2.1 平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基將胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、瓊脂15.0g加入 蒸餾水1000ml中，煮沸溶解后，調(diào)pH,然后在121C下滅菌15min, 取出，稍微冷卻后，帶熱倒入培養(yǎng)皿中。3 志賀氏菌檢測3.1 GN增菌液成分：胰蛋白胨：20g,葡萄糖：1g,甘露醇：2g，檸檬酸鈉：5g,

3、 去氧膽酸鈉0.5g，磷酸二氫鉀4g，磷酸氫二鉀1.5g,氯化鈉5g，蒸 餾水 1000ml。pH7.0制法：將上述物品加入蒸餾水中，加熱溶解煮沸，調(diào)pH 為 7.0，分裝，在115C高壓滅菌15mi n。3.2 HE瓊脂成分：胨：12g,牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水楊素2g,膽堿20g,氯化鈉5g,瓊脂1820g，蒸餾水1000ml0, 0.4%溴麝香草酚藍(lán) 溶液 16ml, Andrade指示劑 20ml.，甲液 20ml，乙液 20ml。pH7.5 制法：將上述前七種成分加入 400ml 蒸餾水中作為基礎(chǔ)液， 將瓊脂加 入到 600ml 蒸餾水中加熱溶解，加入甲液乙液到基礎(chǔ)液中

4、，調(diào) pH， 再加入指示劑，并與瓊脂液合并，待冷卻至5055C，傾注澆平板。注 1 ：此培養(yǎng)基不能高溫滅菌。注 2：甲液的配置：硫代硫酸鈉：34g,檸檬酸鐵鈉：4g,蒸餾水：100ml。注 3：乙液的配置：去氧膽酸鈉：10g,蒸餾水：100ml。注 4： Andrade 指示劑的配置：酸性復(fù)紅：0.5g, 1mol/l的氫氧化鈉溶液：16ml，蒸餾水：100ml。 將酸性復(fù)紅溶解于蒸餾水中， 加入氫氧化鈉溶液， 數(shù)小時后如復(fù)紅褪 色不全，再加氫氧化鈉溶液 12ml。3.3 SS瓊脂3.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：成分：牛肉膏：5g,胨：5g,三號膽鹽：3.5g,瓊脂：17g,蒸餾水： 1000ml 。

5、制法：將牛肉膏蛋白胨， 三號膽鹽加入到 400ml 蒸餾水中， 將瓊脂加 入到600ml蒸餾水中，煮沸使其溶解，然后液混合，于 121 C下滅菌 15mi n,保存?zhèn)溆谩?.3.2 完全培養(yǎng)基成分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1000ml，乳糖：10g，檸檬酸鈉：8.5g，硫代硫 酸鈉： 8.5g, 10%檸檬酸鐵溶液： 10ml, 1%中性紅溶液： 2.5ml, 0.1% 煌綠溶液： 0.33ml。制法：加熱融化基礎(chǔ)培養(yǎng)基,按比例加入處染料以外的所有成分,攪拌均勻，調(diào)pH7.0,加入中性紅溶液和煌綠溶液，混合均勻后澆平板。注 1：配制好的培養(yǎng)基宜當(dāng)日使用,或保存于冰箱 48h 內(nèi)使用。注 2：煌綠溶液配好后

6、,應(yīng)在 10日內(nèi)使用。注3:可以購買SS瓊脂的干燥培養(yǎng)基。3.4 麥康凱瓊脂成分：蛋白胨：17g,胨：3g，豬膽鹽（牛、羊膽鹽）：5g，氯化鈉：5g，瓊脂：17g,蒸餾水：1000ml，乳糖：10g，0.01%結(jié)晶紫水溶液： 10ml, 0.5%中性紅水溶液： 5ml。制法：將蛋白胨、胨、豬膽鹽、氯化鈉溶解于 400ml 蒸餾水中,調(diào) pH7.2，將瓊脂加入到600ml蒸餾水中加熱溶解，將兩液混合均勻，于121C下滅菌15min備用。臨用時加熱融化瓊脂，趁熱加入乳糖，等冷卻到5055C時，加入結(jié)晶紫和中性紅水溶液，攪拌均勻后澆平板。注：結(jié)晶紫和中性紅水溶液配好后，須經(jīng)高壓滅菌。3.5 伊紅美藍(lán)

7、瓊脂（ EMB ）成分：蛋白胨：10g,乳糖：10g，磷酸氫二鉀：2g，瓊脂17g, 2%伊紅Y溶液：20ml, 0.5%美藍(lán)溶液：10ml，蒸餾水1000ml, pH7.1。 制法：將蛋白胨、磷酸鹽、瓊脂溶解于蒸餾水中，調(diào) pH，于121 C 下滅菌 15min 備用。臨用時加熱融化瓊脂，并加入乳糖，冷卻至 5055C時加入伊紅和美 藍(lán)溶液,混合均勻后澆平板。3.6 三精鐵瓊脂成分：蛋白胨：20g,牛肉膏：5g,乳糖：10g,蔗糖：10g，葡萄糖：1g,氯化鈉：5g,六水硫酸亞鐵銨：0.2g，硫代硫酸鈉：0.2g，瓊脂:12g,酚紅：0.025g，蒸餾水：1000ml, pH7.4。制法：將

8、除瓊脂和酚紅以外的各種成分溶解于蒸餾水中，調(diào) pH，然 后加入瓊脂，加熱溶解，加入 0.2%酚紅水溶液12.5ml，搖勻，分裝 時量多一點，于121 C下滅菌15mi n,擱高層斜面?zhèn)溆谩?.6 葡萄糖半固體發(fā)酵管成分：蛋白胨：1g,牛肉膏：0.3g,氯化鈉：0.5g, 1.6%溴甲酚紫酒精溶液：0.1ml，葡萄糖：1g,瓊脂：0.3g,蒸餾水：100ml, pH7.4制法：將蛋白胨,牛肉膏,氯化鈉加入水中,調(diào) pH 后,加入瓊脂,煮沸溶解，再加入指示劑和葡萄糖。分裝，于121 C下滅菌15min,備用。3.7 半固體管成分：蛋白胨：1g,牛肉膏：0.3g，氯化鈉：0.5g,瓊脂：0.350.

9、4g, 蒸餾水： 100ml， pH7.4。制法：將上述成分溶于水中，加熱煮沸，并調(diào)pH后分裝小試管，121C 高壓滅菌15min，直立凝固備用。3.8 尿素瓊脂成分：蛋白胨：1g,氯化鈉：5g，葡萄糖1g,磷酸二氫鉀：2g, 0.4% 酚紅溶液：3ml，瓊脂：20g,蒸餾水：1000ml, 20%尿素：100ml, pH7.2±0.1。制法：將除尿素和瓊脂以外的成分配好，調(diào) pH，加入瓊脂后加熱使 其溶化并分裝小瓶，121C高壓滅菌15min,冷卻至5055C后，加入 經(jīng)過濾滅菌的尿素溶液，最終尿素濃度為2%,最終的pH應(yīng)為7.2 ±.1。 分裝于滅菌試管內(nèi),擱斜面?zhèn)溆谩?/p>

10、3.9 西蒙氏檸檬酸鹽瓊脂成分：氯化鈉：5g，七水硫酸鎂：0.2g，磷酸二氫銨：1g,磷酸氫二甲：1g,檸檬酸鈉：5g,瓊脂：20g,蒸餾水：1000ml, 0.4%溴麝香 草酚藍(lán)溶液： 40ml, pH6.8。制法：先將鹽類溶解于水中，調(diào) pH，再加瓊脂，加熱溶化，然后加 入指示劑，混合均勻后分裝試管，121C下滅菌15min，擱成斜面。實驗方法：挑取少量瓊脂培養(yǎng)物接種，于 36 C 士 1C培養(yǎng)4天，每天 觀察結(jié)果，陽性者斜面上有菌落生長。培養(yǎng)基由綠色轉(zhuǎn)為藍(lán)色。3.10 氰化鉀（ KCN ）培養(yǎng)基成分：蛋白胨：10g,氯化鈉：5g，磷酸二氫鉀：0.225g,磷酸氫二 鈉：5.64g,蒸餾水

11、：1000ml, 0.5%氰化鉀溶液：20ml, pH7.6。制法：將除氰化鉀以外的成分配好分裝，121C滅菌15mi n,放在冰 箱內(nèi)使其充分冷卻，每100ml培養(yǎng)基加入0.5%氰化鉀溶液2.0ml （最 后濃度為1:10000）,分裝于12mM 100mm滅菌試管，每管約 4ml, 立刻用橡皮塞塞緊，放在4C冰箱內(nèi)，至少可保存兩個月，同時將不 加氰化鉀的培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基，分裝備用。試驗方法：將瓊脂培養(yǎng)物接種于蛋白胨水內(nèi)成作為稀釋菌液,挑取 1 環(huán)接種于氰化鉀培養(yǎng)基，另外挑取 1環(huán)接種于對照培養(yǎng)基，在 36C 士 1C下培養(yǎng)12天，觀察結(jié)果，如有細(xì)菌生長，則為陽性，經(jīng) 2天 后不生長則為

12、陰性。注：氰化鉀是劇毒物質(zhì),使用時應(yīng)小心,切勿沾染,以免中毒。夏天 分裝培養(yǎng)基應(yīng)在冰箱內(nèi)進(jìn)行, 實驗失敗的主要原因是封口不嚴(yán), 氰化 鉀逐漸分解,變成氫氰酸氣體逸出,以致藥物濃度降低,細(xì)菌生長, 造成假陽性現(xiàn)象。3.11 氨基酸脫羧酶實驗培養(yǎng)基成分：蛋白胨：5g,酵母浸膏：3g，葡萄糖：1g,蒸餾水：1000ml, 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：1ml, L-氨基酸或 DL-氨基酸：0.5g或 1g/100ml，pH6.8。制法：除氨基酸以外的所有成分加熱溶解后，分裝每瓶100ml，分別 加入各種氨基酸：賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸。 L- 氨基酸按 0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入。再調(diào)pH6.8

13、，對照培養(yǎng)基不加氨基酸。分裝于 滅菌的小試管內(nèi)，每管0.5ml,上面滴加一層液體石蠟。115C高壓滅 菌 10min。實驗方法：從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于36 C士 1C下培養(yǎng)1824h,觀察結(jié)果，氨基酸脫羧酶陽性者由于產(chǎn)堿，培養(yǎng)基應(yīng)呈紫色。 陰性者因為堿性物質(zhì)產(chǎn)生, 但因葡萄糖產(chǎn)酸而是培養(yǎng)基變成黃色, 對 照管應(yīng)為黃色。3.12 蛋白胨水（靛基質(zhì)試驗用）成分：蛋白胨或胰蛋白胨：20g,氯化鈉：5g,蒸餾水：1000ml, pH7.4制法：將上述成飛混合均勻，分裝小管，121C滅菌15min。 靛基質(zhì)試劑：柯凡克試劑： 將 5g 對二氨基甲醛溶于 75ml 戊醇中,然后慢慢加入濃 鹽酸 2

14、5ml。歐-波試劑：將1g對二氨基苯甲醛溶于90ml95%的乙醇內(nèi)，然后慢慢 加入濃鹽酸 20ml。實驗方法：挑取少量接種物接種，在 36 C士 1C下培養(yǎng)12天，必要 時可培養(yǎng)45天，加入柯凡克試劑約0.5ml，輕搖試管，陽性者試劑 層呈深紅色,或加入歐 -波試劑,沿管壁流下,覆蓋于培養(yǎng)液表面, 陽性者接觸面上呈玫瑰紅色。注：蛋白胨應(yīng)含有豐富的色氨酸, 每批蛋白胨買來后應(yīng)用已知菌種實 驗。3.13 糖發(fā)酵管成分：牛肉膏：5g，蛋白胨：10g,氯化鈉：3g，十二水磷酸氫二鈉：2g, 0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液：12ml，蒸餾水：1000ml, pH7.4。葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，按 0.5%加入葡萄糖，分裝于有一個倒置小管的小試管內(nèi)，121C滅菌15min。其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后，分裝每瓶 100ml, 121 C滅 菌15min，另將各種糖類配好10%溶液，一同滅菌，將5ml糖溶液加 入到 100ml 液體培養(yǎng)基中,以無菌操作分裝小試管。注：蔗糖不純,加熱后會自行水解者,應(yīng)采用過濾法除菌。實驗方法：從瓊脂斜面上