復方丹參滴丸含藥血清誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為心肌樣細胞

1、復方丹參滴丸含藥血清誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為心肌樣細胞         11-01-13 09:59:00     編輯：studa20                     作者：武重陽 孫蘭軍 趙英強 徐強 劉晉平【摘要】  目的 觀察復方丹參滴丸

2、含藥血清體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)分化為心肌樣細胞的能力。方法 采用全骨髓直接貼壁的方法分離培養(yǎng)大鼠MSCs，流式細胞儀鑒定細胞表面標記;采用復方丹參滴丸的含藥血清體外定向誘導第四代MSCs，應用免疫細胞化學法、原位雜交組織化學法、透射電子顯微鏡鑒定心肌樣細胞。結果 大鼠MSCs細胞表面抗原CD90、CD106陽性，CD34、CD45、CD31陰性。經復方丹參滴丸含藥血清誘導向心肌樣細胞分化后，免疫細胞化學法顯示輔肌動蛋白(Actinin)、結蛋白(desmin)強陽性，原位雜交組織化學法顯示肌球蛋白重鏈(MHC)強陽性表達。結論 復方丹參滴丸含藥血清能促使MSCs分化為心肌樣細

3、胞，為中藥干預MSCs治療缺血性心臟病提供干細胞實驗依據。 【關鍵詞】  復方丹參滴丸;骨髓間充質干細胞;心肌樣細胞;分化;活血化瘀傳統(tǒng)觀點認為心肌細胞不能再生，現(xiàn)在的治療手段和措施通常不能防止左心室重構和心力衰竭的進程。目前認為干細胞可以重塑心肌細胞，有望可以替代壞死心肌組織。Tomita等1觀察了自體骨髓基質細胞移植對大動物心肌再生的作用,結果提示移植細胞可形成島樣心肌細胞,促進血管新生,防止左室重塑,提高局部及全心的收縮功能。通過骨髓間充質干細胞(MSCs)心肌內移植,組織病理學和免疫組化的方法顯示輸入的干細胞可以分化為心肌樣細胞,血管平滑肌細胞和內皮細胞2,而且能增加血管密度

4、?；钛鲱愔兴幹委熑毖孕呐K病有肯定的療效，復方丹參滴丸具有抗心肌缺血、缺氧和擴張冠脈作用,臨床主要用于治療冠心病心絞痛。本研究旨在探討活血化瘀中成藥復方丹參滴丸能否在體外干預大鼠MSCs分化為心肌樣細胞，并為詮釋活血化瘀類中藥治療缺血性心臟病機制提供動物實驗依據。1 材料與方法1.1 試劑與器材1.1.1 試劑 DMEM低糖培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)均為Gibco公司產品，小鼠抗大鼠熒光標記抗體CD34PE(Santa Cruz)、CD106PE(Biolegend)，CD31FITC、D45FITC、CD90FITC(Serotec)，陰性對照：小鼠Ig

5、G1PE、小鼠IgG1FITC(Santa Cruz)。小鼠抗大鼠單克隆抗體sarcomeric 輔肌動蛋白(Actinin)、結蛋白(desmin)，肌球蛋白重鏈原位雜交試劑盒(天津灝洋生物制品科技有限公司)。1.1.2 器材 CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma)，H600透射電子顯微鏡(HITACHI)，流式細胞儀(Calibur，美國BectonDickinson公司)，6孔培養(yǎng)板，25 cm2、75 cm2塑料培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus)，Heraeus離心機(D37520，德國Osterode公司)。1.1.3 實驗動物 清潔級SD大鼠，

6、雄性，由中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物中心提供，動物許可證號：scxk津20050001。1.2 方法1.2.1 骨髓MSCs的分離擴增 100120 g雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡510 min，無菌條件下取大鼠股骨、脛骨，去除附著于骨表面的組織，去除股骨、脛骨的骨骺，用20 ml DMEM沖洗骨髓腔獲取骨髓細胞，收集于離心管內，充分吹打制成細胞懸液，1 000 r/min，20離心10 min，收集細胞，用20 ml完全培養(yǎng)基(DMEM，20%FBS，青霉素G 100 U/ml、鏈霉素100 U/ml，谷氨酰胺0.2 mmol/L)重懸細胞，接種于75 cm2的塑料培養(yǎng)

7、瓶中，全程置于5% CO2，37，飽和濕度的孵箱中靜置培養(yǎng)。35 d首次換液，以后每隔34 d換液洗去未貼壁細胞，原代細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶底面的80%90%時，用0.25%胰酶(含1%EDTA)按13進行消化傳代。1.2.2 MSCs的表面抗原檢測 取第四代骨髓MSCs，經0.25%胰酶(含1%EDTA)消化，PBS洗滌23次，經流式細胞儀檢測細胞表面標記。1.2.3 復方丹參滴丸含藥血清制備 根據成人日服藥量折算成大鼠灌胃劑量，計算大鼠日灌胃劑量54.34 mg/kg。將大鼠隨機分為實驗組和對照組。實驗組每日予復方丹參滴丸含藥血清灌胃，對照組予等體積蒸餾水灌胃，均連灌7 d。每日一次。最后1

8、d灌胃30 min后無菌條件下股動脈取血，3 000 r/min離心15 min，分離血清，56水浴滅活30 min，過濾除菌，-20短期保存?zhèn)溆?，制備含藥血清和空白對照血清?.2.4 復方丹參滴丸含藥血清誘導MSCs 選生長狀態(tài)良好的P4細胞，每孔以2×104個細胞的濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細胞90%融合后分別誘導，加入含藥血清，體積終濃度為20%,作用72 h后去除培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，同時，設西藥組：加入終濃度為5 mol/L的5氮胞苷,預誘導24 h后去除培養(yǎng)基;中西藥組：加入終濃度為5 mol/L的5Aza,預誘導24 h后去除培養(yǎng)基，再與含藥血清作用72 h去除培養(yǎng)基，

9、繼續(xù)培養(yǎng);空白組：加入空白對照血清，體積終濃度為20%，72 h后去處培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察721 d細胞形態(tài)變化，進行免疫組化、電鏡檢測。1.2.5 免疫細胞化學染色 誘導后的細胞，用4%多聚甲醛室溫固定2 h，洗滌后，阻斷內源性過氧化物酶，分別滴加1抗Actinin、desmin，4過夜，加生物素化兔抗小鼠IgG1第二抗體，37 45 min，PBS 液沖洗3 次，DAB 顯色，自來水沖洗，蘇木素復染510 min。PBS洗滌藍化后，蒸餾水沖洗兩次后，37空干后，70%甘油封片。以不加一抗作為陰性對照。1.2.6 透射電鏡觀察 誘導后的細胞經2.5%戊二醛固定，制成電鏡標本，透射電鏡下觀察細胞形態(tài)結構。1.2.7 原位雜交組織化學 將誘導培養(yǎng)的細胞，PBS 沖洗3次，4%多