默克密理博的Amicon離心超濾

1、默克密理博的Amicon離心超濾裝置是一種理想的工具，可以用來對(duì)鹽分、糖類、核酸、非水溶劑及其他一些低分子量物質(zhì)進(jìn)行去除和更換。他們還可以用來分離未結(jié)合上的游離標(biāo)記物。密理博離心超濾裝置具有快速、方便、回收率高的特點(diǎn)，可替代并優(yōu)于透析及乙醇沉淀。Amicon Ultra-4和Amicon Ultra-15具有高速度高回收的特點(diǎn)。他們使用低吸附性的Ultracel再生纖維素超濾膜，可用于蛋白質(zhì)、抗原、抗體、酶和微生物的濃縮純化。其快速和高回收的特點(diǎn)非常適合于脫鹽和緩沖液置換。Amicon Ultra離心超濾裝置經(jīng)常用于對(duì)蛋白質(zhì)色譜純化過程產(chǎn)生的色譜柱組分進(jìn)行濃縮和脫鹽。以下兩個(gè)例子展示了Amic

2、on Ultra離心超濾裝置對(duì)于蛋白質(zhì)和活性酶回收的應(yīng)用。方法1. 選擇具有合適NMWL和體積的離心超濾裝置；2. 把樣品置于過濾裝置的儲(chǔ)液管中；3. 如果樣品體積小于過濾裝置的最大體積，則可以把它稀釋到最大體積后再離心，這有助于更有效地除去鹽分；4. 在特定的離心力下和推薦的時(shí)間進(jìn)行離心；5. 將濾過液從濾管中取出，放置一旁；6. 加入水或緩沖液使樣品體積達(dá)到4ml(Amicon Ultra-4)或15ml(Amicon Ultra-15);7. 再次離心；8. 取出濾過液，放置一旁；9. 回收濃縮的已脫鹽樣品。注意：請(qǐng)將兩次的濾過液一直保留到濃縮的樣品分析測(cè)試完成。結(jié)果：鹽分通過濾膜的過程

3、不依賴樣品的濃度和體積，用超濾的方法來脫鹽并不改變緩沖液的組成，比如說，含有500mM鹽分的溶液在初次離心后它的鹽濃度并不發(fā)生改變。再往超濾管中剩余溶液中加入水或無鹽緩沖液，再次離心，則會(huì)降低溶液中的鹽濃度。這個(gè)過程我們將它稱為等體積超濾，反復(fù)多次地操作，可以使溶液鹽分降到最低。如果我們想將樣品用不同打分緩沖液溶解，則我們可以使用等體積超濾達(dá)到目的。樣品濃縮后，然后加入目的緩沖液，再進(jìn)行反復(fù)得稀釋和濃縮。如表中所示，使用默克密理博的離心超濾裝置，只需一次過濾，樣品中90%以上的鹽分都被去除。最后，只要再離心一次，可以使樣品中高達(dá)99%的鹽分都被去除，而且樣品的回收率高達(dá)90%以上。用色譜法進(jìn)行

4、蛋白質(zhì)純化，經(jīng)常得到許多的色譜組分，而其中只有一些組分中含有目標(biāo)蛋白質(zhì)。將這些組分合并后，我們就可能需要通過一步蛋白質(zhì)濃縮過程將蛋白質(zhì)儲(chǔ)存起來，或者需要通過緩沖液置換將樣品濃縮，以便下游的分離。經(jīng)過細(xì)胞破碎、分段富集、去除部分雜質(zhì)等一系列操作，樣本的體積不斷加大，蛋白質(zhì)濃度下降，有時(shí)已經(jīng)不適合后繼的蛋白質(zhì)樣本檢測(cè)或者上樣了。怎么辦？這個(gè)時(shí)候不外3類選擇：濃縮，沉淀，過柱。過柱既然是分離富集的常用方法，自然也有濃縮特定目標(biāo)蛋白的效果，生物通前文已有介紹。效果最好的自然是專一吸附富集和洗脫的親和柱，比如HisTag之類的。如果過柱后洗脫濃度還不夠，也要繼續(xù)用其他方法濃縮。親和沉淀或者免疫沉淀原理也

5、一樣-比如瓊脂糖偶聯(lián)抗體做親和沉淀-借助抗體吸附目標(biāo)蛋白，借助瓊脂糖重力離心沉淀，能有效的富集純化目標(biāo)蛋白，縮小體積，而且不影響目標(biāo)蛋白活性。但是多數(shù)情況下，無處可覓親和的“那一半”，又要繼續(xù)后繼實(shí)驗(yàn)，就只好采用濃縮或者沉淀。濃縮由于沉淀可能導(dǎo)致或多或少的樣本損失，不可逆沉淀等問題，原則上，能不用都盡量不用沉淀的方法。冷凍干燥相對(duì)能比較好的保持蛋白質(zhì)活性，非常有效的縮小溶液體積和提高濃度，而且沒有什么損耗和花費(fèi)。問題是你首先得有凍干機(jī)，而且凍干不能去除樣品溶液中的鹽等其他雜質(zhì)。超濾是濃縮樣品的更好的選擇。超濾是一種膜分離技術(shù)，它的特點(diǎn)是使用不對(duì)稱多孔膜，根據(jù)分子的大小來分離溶液中的大分子物質(zhì)與

6、小分子物質(zhì)，是一種溫和的、非變性的物理分離方法，尤其適用于蛋白質(zhì)等大分子溶液的濃縮，純化以及緩沖體系交換等。超濾操作最簡(jiǎn)單的工具莫過于離心超濾管-通過離心力，使溶液中的小分子溶液和溶劑透過超濾膜,被收集在濾過液收集瓶中，而大分子溶質(zhì)則被超濾膜截流在樣品濃縮管中。該方法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，只需要高速離心機(jī)，無需其他特殊設(shè)備，速度快，可以相當(dāng)?shù)赜行饪s樣本，而且可以部分去除樣本溶液中的鹽、去垢劑等可溶性小分子，有利于更換緩沖體系。操作：離心超濾管的使用非常簡(jiǎn)單，按照樣品量和目標(biāo)分子量選擇適當(dāng)?shù)碾x心超濾管，加入待濃縮的樣品溶液，按照超濾離心管指示離心速度和時(shí)間離心，最后回收濾管中截留的樣品溶液。回收率

7、：一般回收濃度大于0.1mg/ml的溶質(zhì)，回收率可達(dá)90%以上。通常樣品損失是由于濾膜表面和容器表面的非特異性吸附引起的。選擇口碑好、高品質(zhì)的離心超濾管非常重要，因?yàn)楦咂焚|(zhì)的離心超濾管選用低吸附材質(zhì)，精細(xì)拋光，可最大限度地降低了吸附性。濾膜表面樣品的吸附量與樣品和濾膜材質(zhì)有關(guān)，一般為2-10g/cm2。如果研究的對(duì)象是濾過液，由于其濾過時(shí)要穿過濾膜的整個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)，所以吸附量相對(duì)較大，為20-100g/cm2。通常截留分子量高的膜吸附較高，而截留分子量低的膜吸附較低。eBioTips1：為了得到最高的收率，所選濾膜的截留分子量MWCO建議選擇所需截留分子大小的1/3左右，不超過目標(biāo)分子量的一半。

8、因?yàn)槌瑸V膜上孔徑是平均孔徑，膜上的孔并非均勻，離心高壓下也可能滲漏，因此截留孔徑越小，流速越慢但截留比例更大。eBioTips2：如果樣本濃度低體積大，可選擇較小容積的離心超濾管多次重復(fù)加樣離心。如果同時(shí)需要脫鹽和去除可溶小分子雜質(zhì)，可將待濃縮樣品稀釋到離心超濾管最大容積再離心，重復(fù)2次可除去99%鹽。eBioTips3：避免過長(zhǎng)時(shí)間或者過速離心，雖然高品質(zhì)的產(chǎn)品都有防死端設(shè)計(jì)，可避免過度離心造成膜表面干而造成不可逆吸附。避免過度濃縮，最終體積越小，越容易因表面吸附而損失得率。離心后用Tips輕輕吹吸幾次濾膜截留的溶液，必要時(shí)補(bǔ)加一定體積的緩沖液沖洗膜表面，有助于減少膜表面吸附，能提高回收率。

9、盡量避免Tips接觸膜表面。eBioTips4：有些置于2ml離心管的那種Mini離心超濾管可以反向套入離心管中離心（管子上下一樣寬的那種一般都可以），以方便用離心法回收截留蛋白質(zhì)樣品，可使?jié)饪s液達(dá)到近乎完全回收，不用Tips，對(duì)于樣品體積小的就很好。賽多利斯的Vivaspin 2ml帶有一個(gè)回收帽，也可以反向離心后可加蓋保存回收樣品，但是那個(gè)管子很長(zhǎng)，要配15ml離心管的離心機(jī)，不過有幾種膜可以選擇。eBioTips5：離心超濾管通常也不能消毒（個(gè)別種類特別說明除外，如再生纖維素(RC)膜的離心超濾管可以121度消毒，但是注意那個(gè)pH范圍比較小，別因?yàn)橄揪瓦x錯(cuò)），一次性使用。由于單管價(jià)格并

10、不便宜（20-90元），不少人嘗試重復(fù)使用-經(jīng)驗(yàn)是用蒸餾水清洗膜表面多次，離心一次到兩次，那種可以反向離心的小管子可以加蒸餾水浸泡后反向多離心一次，會(huì)好些?？芍貜?fù)用于同一樣品，不用時(shí)可用蒸餾水浸泡，但是要防止細(xì)菌污染。不同樣品就不要混用了。有人說用20%酒精，還有人說用1N的NaOH洗滌，但也有人說會(huì)破壞膜結(jié)構(gòu)。反正廠家一般不支持重復(fù)用。多次重復(fù)使用會(huì)堵塞濾膜上的孔徑，甚至出現(xiàn)漏液現(xiàn)象，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。eBioTips5：離心超濾管通常不需要預(yù)處理即可使用（個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，用蒸餾水洗一次會(huì)好些），不過對(duì)于蛋白質(zhì)樣本處理，特別是較稀的蛋白質(zhì)溶液來說(<10ug/mL),用超濾膜濃縮回收率常常是不定

11、量的。雖然PES材料使非特異吸附最小化，但是,某些蛋白,特別是稀的時(shí)候,會(huì)有問題。非特異結(jié)合的程度隨著個(gè)別蛋白結(jié)構(gòu)的不同而不同。含有帶電的或者疏水結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)更易于不可逆結(jié)合到不同表面。對(duì)超濾離心管表面做鈍化預(yù)處理可降低蛋白質(zhì)在膜表面的吸附性損失，大多數(shù)情況下，在濃縮稀蛋白溶液之前預(yù)處理(鈍化)柱子可以提高回收率，因?yàn)殁g化溶液可填滿膜和表面暴露的空白蛋白吸附位點(diǎn)。鈍化的方法是預(yù)先用最高容積的鈍化溶液預(yù)浸泡柱子1小時(shí)以上，蒸餾水徹底沖洗柱子，再用蒸餾水離心一次以徹底除去可能殘留在膜上的鈍化溶液。注意鈍化處理后別讓膜干了。如果要留待以后使用，需要加無菌蒸餾水保持膜濕潤(rùn)。常用的鈍化溶液可選擇： a

12、. 1牛血清白蛋白磷酸緩沖液溶液 b. 5十二烷基磺酸鈉蒸餾水水溶液 c. 5Tween-20非離子活性劑蒸餾水溶液 d. 5Triton-X 蒸餾水溶液 e. 5聚乙二醇化合物蒸餾水溶液 f.1免疫球蛋白IgG磷酸緩沖液溶液eBioTips6：離心超濾管因?yàn)樾枰咚匐x心，某些對(duì)剪切力或壓力誘導(dǎo)下易變性的不穩(wěn)定樣品可能不太適合。另外超濾膜上孔徑是平均孔徑，膜容易堵，對(duì)于有微小顆?；蛘咚槠臉悠?，最好能先用較大孔徑的離心超濾管過濾一次，再進(jìn)行下一步濃縮。膜材質(zhì)：選擇超濾膜主要根據(jù)膜的材質(zhì)，截留分子量以及綜合性能等，但是超濾的效果取決于待超濾的樣品溶液的特性，有條件的可以試試不同材質(zhì)的膜。沒有條件

13、就隨大流。聚醚砜PES是超濾離心管中最常見的材質(zhì)，具有較高的化學(xué)和熱穩(wěn)定性，耐堿能力強(qiáng)(pH范圍1-14)，通量大，流速快。其他材料還有三醋酸纖維素(CTA)、再生纖維素(RC)和Hydrosart(HY)。三醋酸纖維素（Cellulose Triacetate，pH范圍3-11）親水性強(qiáng)，非特異性吸附極低，溶劑和小分子溶質(zhì)在過濾時(shí)不會(huì)因被膜吸附而產(chǎn)生損失，適合樣品洗滌、除蛋白以及其他需要回收濾液的操作。再生纖維素（Regenerated Cellulose，pH范圍4-8）也是一種高度親水的膜，對(duì)蛋白的吸附極低，可以高壓滅菌，容易清洗，耐酸堿性能及耐溶劑性能好。當(dāng)用于從低蛋白濃度的稀釋液中回收蛋白時(shí)，可以得到極高的收率。Hydrosart超濾膜（pH范圍3-11）是Sartorius公司的專利產(chǎn)品，