PCR微流控芯片

1、PCR微流控芯片一. PCR技術(shù)簡介聚合酶鏈反應(yīng)(PCR polymerase chain reaction技術(shù)是一種完美的體外無限擴增核酸的技術(shù)。首先將DNA模板、引物(primer、Taq酶、緩沖液、dNTP(A、T、C、G四種堿基等混合均勻,加熱至一定溫度(94使模板失去活性,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這個過程稱之為DNA的變性(melting or denaturation;然后降溫至一定溫度(55,使引物和DNA模板復(fù)性,兩者發(fā)生特異性結(jié)合,此階段稱之為退火(annealing;最后再加熱到一定的溫度(72,使Taq酶活性達(dá)到最大,在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)

2、制的起點,合成新鏈,此過程稱之為延伸(extension。 這三個階段可概括為:高溫變性低溫退火中溫延伸。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍。將擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。擴增產(chǎn)物量由公式Y(jié)=A(1+Rn決定。其中A為模板拷貝數(shù),R為擴增效率,n為循環(huán)次數(shù),一般循環(huán)次數(shù)為2045次。二.PCR微流控芯片(PCR microfluidics第一代PCR是PE-Cetus公司的熱循環(huán)儀。第二代是靜態(tài)的微反應(yīng)槽PCR

3、芯片(micro chamber PCR chip。第三代PCR技術(shù)是PCR微流控芯片。下面我們從反應(yīng)體積大小,循環(huán)時間的長短等幾個方面對這三類PCR技術(shù)做個比較。 通過表1的對比,我們可以看出PCR微流控芯片較前兩種技術(shù)的優(yōu)勢是:在保證一定擴增效率的前提下,反應(yīng)體積可變,樣品的輸入和輸出是連續(xù)的,反應(yīng)從靜態(tài)變?yōu)閯討B(tài);反應(yīng)時間縮短。PCR微流控裝置主要可分為反應(yīng)池內(nèi)固定擴增式PCR(Chamber stationary PCR microfluidics,連續(xù)流動式PCR(Continuous-flow PCR microfluidics和熱對流驅(qū)動PCR(Thermal convection

4、-driven PCR microfluidics三種形式。1.反應(yīng)池內(nèi)固定擴增式PCR是傳統(tǒng)PCR擴增的微型化,其反應(yīng)速度仍然受PCR反應(yīng)體系的熱容、反應(yīng)池襯底材料的熱容、加熱器以及傳感器的熱容等因素制約,因此需要對PCR系統(tǒng)的熱容優(yōu)化以便縮短反應(yīng)時間和減少能量消耗。 一種反應(yīng)池內(nèi)固定擴增式PCR示意圖2.連續(xù)流動式PCRDNA樣品和反應(yīng)試劑連續(xù)流動經(jīng)過三個不同的恒溫帶,從而達(dá)到DNA片段熱循環(huán)擴增的目的,該方法由于不需要反復(fù)地加熱或冷卻PCR裝置,加熱-冷卻速度一般不受PCR裝置系統(tǒng)的熱容所限制,反應(yīng)速度較快。 一種連續(xù)流動式PCR示意圖3. 熱對流驅(qū)動PCR是基于Rayleigh-Be&

5、#180;nard 對流原理。這種裝置不需要借助外 熱對流驅(qū)動PCR 力只需要浮力就能驅(qū)動PCR 試劑流經(jīng)不同的溫度區(qū),跟前兩種相比,這種芯片制造簡單,價格低廉,而且具有更快的溫度傳導(dǎo)速度,更易于集成。 一種熱對流驅(qū)動PCR 示意圖三. 連續(xù)流PCR 微流控芯片連續(xù)流PCR 微流控芯片有許多的設(shè)計形式: 振蕩式(oscillatory devices,閉環(huán)式劑在微通道內(nèi)不停的往復(fù)運動,穿梭于不同的溫度加熱區(qū),所以循環(huán)數(shù)以(closed-loop devices和固定循環(huán)數(shù)式(fixed-loop devices。1. 振蕩式PCR 試是可調(diào)節(jié)的。下圖中,在注射泵的作用下,試劑先經(jīng)過退火區(qū)和延伸

6、區(qū)進(jìn)入變性區(qū),完成DNA 變性后穿過延伸區(qū)進(jìn)入退火區(qū)完成引物退火。最后再進(jìn)入延伸區(qū)延伸,至此完成一個循環(huán)。在不同溫度區(qū)的停留時間可以通過注射泵調(diào)節(jié),也可以通過微通道的結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計。 一種振蕩式PCR裝置示意圖2.閉環(huán)PCR 一種閉環(huán)PCR裝置俯視和剖面圖上圖中,PCR樣品經(jīng)過三個不同的通道,然后再外接泵的作用下由出口重新返回入口進(jìn)行循環(huán)。三段微通道對應(yīng)三個不同的溫度區(qū)。中間的空氣層阻隔了不同溫度區(qū)間的溫度傳導(dǎo)。與振蕩式PCR不同的是,循環(huán)式流動方向一直是不變的。由此可見,閉環(huán)PCR循環(huán)數(shù)也是可以調(diào)節(jié)的。3. 固定循環(huán)數(shù)式PCRPCR 的循環(huán)次數(shù)是固定的,但這種方式的控制比較簡單。 顧名思義,就

7、是一種固定循環(huán)式PCR 裝置示意圖上圖是一種輻射狀的固定循環(huán)式的PCR 置。這種裝置一共可以完成34個循環(huán)。四. 微液滴PCR 技術(shù)(PCR in droplets增的方式是單相的PCR ,單相PCR 有很的面積/體積比很大,通道內(nèi)壁會對試劑和樣品有吸收,所以會造橫截面的速度分布為拋物線形狀,中間速度最大而裝A 為油的入口,B1和B2是兩個試劑水溶液入口,這兩部分構(gòu)成了一個“T ”形連接C ,從而形成了液滴(droplet,第四部分提到。液滴經(jīng)過D 區(qū)完成變性,然后到外圍實現(xiàn)退火和延伸。當(dāng)液滴再返回中間的D 區(qū)完成DNA 變性后,一個新的循環(huán)又開始了。在完成34個循環(huán)以后,在F 處離開。將PC

8、R 樣品直接混合送入微通道進(jìn)行擴多的缺點:1.由于微通道內(nèi)成連續(xù)進(jìn)樣間的運送污染。2在壓力驅(qū)動條件下,微通道壁面速度為零,所以在橫截面不同位置的PCR 樣品將經(jīng)歷不同的反應(yīng)時間。3.擴增具有選擇性，更易于放大短的基因片段，會產(chǎn)生很多副產(chǎn)物。 液滴 PCR（PCR in droplets）技術(shù)解決了單相 PCR 的上述問題。 液滴 PCR 技術(shù)示意圖 在上圖中，PCR 混合物被包含在離散的液滴中，經(jīng)過微通道中的不同溫度 區(qū)。液滴 PCR 技術(shù)與單相 PCR 技術(shù)相比還有許多的優(yōu)勢，如消除了連續(xù)樣品間 的運送污染、通道內(nèi)壁的吸收和樣品的擴散稀釋，防止片段較短的、意想不到的 副產(chǎn)物合成，快速的熱響應(yīng)

9、，很少的試劑消耗等。另外，不同的液滴還可以攜帶 不同的 PCR 樣品，尤其適合于單細(xì)胞和單分子放大。 一種液滴產(chǎn)生的方式示意圖 液滴產(chǎn)生方式如上圖所示，PCR 混合液從中間噴嘴注入，攜帶液體油從 旁邊的噴嘴注入，由于水和油和不相溶性，所以在油中形成了水液滴。 雖然微液滴 PCR 技術(shù)才剛剛出現(xiàn)，但近年來的研究表明了這種技術(shù)的巨大 潛力。 五微閥，微泵和微混合器與 PCR 微流控芯片的關(guān)系 1. 微閥與PCR微流控芯片 微閥在PCR微流控芯片中的功能包括：流動調(diào)節(jié)，開/關(guān)切換及PCR樣品 的密封等。微閥對于PCR擴增與其他的DNA分析過程的結(jié)合至關(guān)重要。 2. 微泵與PCR微流控芯片 微泵一方面要使PCR樣品和試劑從入口進(jìn)入反應(yīng)腔/通道，并把PCR產(chǎn)物 排出反應(yīng)腔/通道以便于進(jìn)一步的檢測。另一方面，在連續(xù)流動流PCR微流控 芯片(continuous-flow PCR chips中， 微泵還要驅(qū)動PCR樣品流經(jīng)兩個或三個不 同的溫度區(qū)。另外，微閥和微泵的結(jié)合還