A群腦膜炎球菌莢膜多糖純化工藝的優(yōu)化.docx

1、.論著A群腦膜炎球菌莢膜多糖純化工藝的優(yōu)化陳作江，馮鵬，趙海平，馮佳麗，魏振洲，張宏蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730046摘要：目的對A群腦膜炎球菌莢膜多糖純化工藝的關(guān)鍵步驟進行分步研究,優(yōu)化每一步工藝參數(shù)。方法優(yōu)化十六烷基三甲基浪化鉉的加入濃度、復(fù)合多糖的解離濃度和解離時間、不同廠家的苯酚、超濾和透析等工藝過程對莢膜多糖的影響。結(jié)果十六烷基三甲基浪化鉉質(zhì)量體積終濃度0.10%(w/v)沉淀效果更好，純化獲得的英膜多糖產(chǎn)量更高相對分子質(zhì)量更大。復(fù)合多糖解離濃度越高,純化獲得的莢膜多糖相對分了質(zhì)墾越小。延K復(fù)合多糖解離時間有利于提高莢膜多糖產(chǎn)最。不同廠家的

2、苯酚、超波和透析等工藝對莢膜多糖的產(chǎn)量和分子大小沒有影響。結(jié)論現(xiàn)行A群腦膜炎球菌英膜多糖純化工藝復(fù)雜,優(yōu)化后的工藝提高了英膜多鐳產(chǎn)量，縮短了工藝用時，增加了工藝穩(wěn)定性。關(guān)鍵詞:腦膜炎球菌;莢膜多糖;純化工藝;優(yōu)化;穩(wěn)定性中圖分類號：R378.1+5文獻標志碼：ADOI：10.I3309/ki.pmi.2014.05.007OptimizationofpurificationprocessforcapsularpolysaccharidefromgroupAMeningococcusCHENZuo-jiang,FENGPeng,ZHAOHai-ping,FENGJia-ii,WEiZhen-zh

3、ou,ZHANGHongLanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Hd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Ixinzhou730046,GansuProvincetChinaCorrespondingauthor；CHENZuo-jiang,Enuiil：zjchenAbstract:ObjectiveKeyprocessesofpurificationtechnologyforcapsularpolysaccharidefromgroupAMeningococcuswerestudie

4、dstepbystepsoastooptimizeparametersinprocess.MethodsFinalconcentrationofCTAB,dissociationtimeandconcentrationofcompoundpolysaccharide,phenolofdifferentmanufacturesandtechniquesusedinultrafiltrationanddialysiswereoptimized.ResultsToobtainaminimumKbvalueandhigheryieldofpolysaccharide,thefinalconcentra

5、tionofCTABwitha0.1%(w/v)isselected.Higherconcentrationfordissociationofcompoundpolysaccharidemakesasmallermolecularsizeforcapsularpolysaccharide.Extendeddissociationtimeofcompoundpolysaccharideisbeneficialtoimprovetheyieldofcapsularpolysaccharide.Phenolfromdifferentmanufacturesandtechniquesusedinult

6、rafiltrationanddialysismakenodifferencestomolecularsizeandyieldofcapsularpolysaccharide.ConclusionTherearemanystepsintheconventionalpurificationprocessofcapsularpolysaccharidefromgroupAMeningococcus.ItisbyoptimizedparametersinprocessofpuriGcationthattheyieldofcapsularpolysaccharideisimproved,thetime

7、isshortenedandconsistenceofprocessisincreased.Keywords:Meningococcus；Capsularpolysaccharide；Purificationtechnology;Optimization；Stability腦膜炎球菌是流行性腦脊髓膜炎(流腦)的病原菌，莢膜多糖是其主要的保護性抗原和毒力因子,也是細菌性疫苗最重要的靶抗原之一，其分離純化是制備疫苗的首要步驟"。中華人民共和國藥典三部(2010版)對A群作者簡介：陳作江，學(xué)士，醫(yī)學(xué)生物學(xué)工程師，主要從辛細菌性疫苗的生產(chǎn)和科研工作。通訊作者：陳作江,Email:zjchen

8、Q腦膜炎球菌莢膜多糖的純化工藝做出了明確規(guī)定,主要包括菌體離心，加入十六烷基三甲基漠化鉉(Cetavlon,CTAB)沉淀獲得復(fù)合多糖,高鹽離子濃度解離復(fù)合多糖，乙醇分級沉淀,苯酚抽提去除蛋白質(zhì)等步驟按照A群腦膜炎球菌莢膜多糖純化工藝規(guī)程,采用分段分析研究的方法，優(yōu)化了各個步驟的純化參數(shù)對A群腦膜炎球菌莢膜多糖產(chǎn)量和分子大小的影響。1材料與方法11材料1.1.1 試劑瓊脂糖SepharoseCL-4B為GE公司產(chǎn)品。鹽酸羥胺、三麻化鐵、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、高氯酸、鑰酸鉉、抗壞血酸、氯化鈉均為分析純，均購自國藥化學(xué)試劑有限公司。十六烷基三甲基漠化鉉為分析純，購自上海試劑一廠。氯化鈣為藥用級，

9、購自中國醫(yī)藥集團化學(xué)試劑有限公司。苯酚為藥用級，購自中國醫(yī)藥集團化學(xué)試劑有限公司（國藥）和北京益利精細化學(xué)品有限公司（益利）。112儀器層析系統(tǒng)Purifier10購自GE公司。紫外分光光度計UV-1800購自SHIMADZU公司。碟片式分離機購自WESTFALIA公司。沙培分離機購自ALFALAVAL公司。Cryofuge6000i大容量離心機購自Thermo公司。1QK超濾膜購自MILL1PORE公司。MWC010000透析袋購自Spectrum公司。1.2方法A群腦膜炎球菌莢膜多糖的制備A群腦膜炎球菌發(fā)酵液經(jīng)過碟片式分離機17000xg離心去菌體，加入CTAB至質(zhì)量體積終濃度0.10%0

10、.15%（w/v）,冷庫靜置20h。沙培分離機21000xg離心獲得夏合多糖，復(fù)合多糖用1moI/L氯化鈣溶液解離1h,加入乙醇至終濃度25%,冷庫靜置20h,l500xg離心1h去核酸。加入乙醇至終濃度80%,1500xg離心30min離心獲得粗糖，粗糖經(jīng)過三次苯酚抽提去除蛋白質(zhì)，苯酚抽提上清液經(jīng)過透析或超濾去除殘余苯酚后獲得精糖。1.2.2分子大小的檢測A群腦膜炎球菌莢膜多糖粗糖按照4mg/mL溶解過夜,0.45jim膜過濾后進行SepharoseCL-4B凝膠柱層析,洗脫液0.2mol/L氯化鈉，pH7.0o流速0.35mL/min,于206nm、260nm.280nm三波長監(jiān)測，以3m

11、L/管分布收集，分別以4825和4地對每管的磷含量和氧乙酰基含量進行檢測，以必25或4洶為縱坐標,匕值為橫坐標作圖，得出粗糖的值。A群腦膜炎球菌莢膜多糖精糖按照4mg/mL溶解過夜,SepharoseCL-4B凝膠柱層析，洗脫液0.2mol/L氯化鈉，pH7.0。流速0.35ml/min,以206nm波長檢測，通過206nm的保留時間（第二峰保留時間）得出精糖的匕值。1.2.3不同濃度CTAB對莢膜多糖產(chǎn)量和分子大小的影響A群腦膜炎球菌莢膜多糖生產(chǎn)工藝規(guī)程中規(guī)定加入CTAB的質(zhì)量體積終濃度為0.10%0.15%,為了確定CTAB的最適濃度，將20I，發(fā)酵液平均分成4份，每份5L,分別加入CTA

12、B質(zhì)量體積終濃度為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%，分別純化獲得莢膜多糖，稱M并檢測、值。1.2.4復(fù)合多糖解離濃度對莢膜多糖產(chǎn)量和分子大小的影響復(fù)合多糖解離時需要高離子強度，一般是用1mol/L的氯化鈣溶液解離復(fù)合多糖，但沒有對解離時復(fù)合多糖本身的濃度做出規(guī)定，現(xiàn)行的A群腦膜炎球菌莢膜多糖工藝規(guī)程中僅僅是以發(fā)酵罐培養(yǎng)量的0.5%1.0%計算，由于每批復(fù)合多糖的產(chǎn)量不同，導(dǎo)致每批復(fù)合多糖的解離濃度差異很大。實驗以同批次的復(fù)合多糖為基礎(chǔ)，以1mol/L的氯化鈣為解離溶液，分別驗證50mg/mLJ00mg/mL、150mg/mL、200mg/mL、250mg/mL、300mg/mL共

13、6個解離質(zhì)量濃度,純化獲得莢膜多糖后，并稱量及檢測其值。1.2.5復(fù)合多糖解離時間對莢膜多糖產(chǎn)量和分于大小的影響復(fù)合多糖的解離需要一定的作用時間,現(xiàn)行的A群腦膜炎球菌莢膜多糖生產(chǎn)工藝規(guī)程中規(guī)定解離時間為1h。實驗以1mol/L的氯化鈣為解高溶液，以100mg/mL的復(fù)合多糖為解離質(zhì)量濃度,分別驗證解離1、6、2。h對莢膜多糖產(chǎn)量和分子大小的影響。12.6不同廠家的苯酚去除蛋白質(zhì)效果的對比在現(xiàn)行生產(chǎn)工藝中，A群腦膜炎球菌莢膜多糖精制時，使用苯酚抽提去除蛋白質(zhì)。為確認不同廠家的苯酚去除蛋白質(zhì)的效果，以及苯酚對莢膜多糖分子大小的影響程度，在莢膜多糖精制時分別使用國藥和益利兩個廠家生產(chǎn)的苯酚進行5次對

14、比試驗，每個樣品苯酚抽提3次后用0.5tn?的10K超濾膜超濾,0.5mol/L氯化鈣清洗4次。1.2.7超濾法與透析法去除殘余苯酚效果的對比中華人民共和國藥典三部（2010版）對A群腦膜炎球菌莢膜多糖純化去除殘余苯酚推薦使用超濾法和透析法,為了比較兩種方法的差異,分別對同一批樣品采用透析法和超濾法去除殘余苯酚的效果進行5次對比研究。超濾樣品苯酚抽提3次后用0.5m2的10K超濾膜超濾,0.5mol/L氯化鈣清洗4次。透析樣品苯酚抽提3次后用MWCO10000的透析膜透析4次,0.5mol/L氯化鈣作為透析液。1.2.8不同超濾鹽溶液去除殘余苯酚效果的比較超濾時提高鹽離子濃度有利于更快地去除殘

15、余苯酚和小分子蛋白質(zhì)。在現(xiàn)行生產(chǎn)工藝中，A群腦膜炎球菌莢膜多糖超濾時使用0.5mol/L的氯化鈣溶液。為了對比不同鹽溶液去除殘余苯酚的效果.實羚分別使用0.5mol/L的貌化鈣溶液和Imol/L的筑化鈉溶液對同一批的英膜多糖進行對比試臉。2.1不同濃度CTAB對美膜多糖產(chǎn)量和分子大小的影響*CTAB質(zhì)吶體積終濃度為0.10%時，所獲炎膜多慵粗糖產(chǎn)蠟最高，但CTAB的濃度并不是越高越好,高濃度的CTAB會沉淀更多的菌體碎片等物質(zhì)。試驗中，當CTAB質(zhì)此體枳終濃度為0.15%和0.20%時，出現(xiàn)CTAB沉淀復(fù)合多糖產(chǎn)置虛高的表象,從值來看，當CTAB質(zhì)ht體積終濃度為0.10%時，獲得的莢膜多糖匕

16、值小，峰型更好，見表1。表1CTAR加入終濃度對莢膜多情的影響2.2及合多糠解高濃度對莢膜多糖產(chǎn)量和分子大小的影響巾表2所列可見，隨著岌合多糖解離濃度的增高.英膜多糖產(chǎn)ht有逐漸降低的擋勢?？赡苓^高的岌合多糖解離質(zhì)吶濃度導(dǎo)致乙醇沉淀時損失r更多的莢膜多糖隨監(jiān)復(fù)含多儺解離質(zhì)林濃度的增高,值也有增大的趨勢，見圖1；其中復(fù)合名糖解離質(zhì)代濃度為KM)mg/niL時，解離后純化獲得的英膜多糖、值最小，虬=0.32?？梢?，在莢膜多糖解離時，莢膜多糖本身的濃度不能太高。Tab.1ofthefinalcoiurntrationof(7i'ABonthe<*a|>sular|M>lys

17、accliari(14*CTAB終濃度()復(fù)合多械產(chǎn)fit(g)粗慵產(chǎn)ft(g)K”0.0510.000.150.240.1017.003.250.240.1520.002.970.260.2020.0()3.040.29O.(M>(HIS».770.K50.130.21().20()370.450.S3<).6i0.69*2址合多艄解高質(zhì)缺濃度對英膜多慵產(chǎn)砒的唆響發(fā)合名惦解肉質(zhì)ht濃度(mg/ml.)50100150200250300岌合多糖擇)100.00100.00100.00100.00100.00100.00m«(g)16.3416.1016.()41

18、5.8415.0415.27Tab.2EffectofdisR>cialionmassconcentrationofcompoundpolyuccharideontheyieldofcapsularpolysaccharideI.HOI.(101.101.20W1.01)V<>.»()0.600.141().20<HX)圖1岌合多糖解肉質(zhì)址濃度對英膜多械分了大小的影響Fig.1Effectofdisscx-iationmassconcentrationofcompoundpolysaccharideonthemolecularsizeofcapsularpol

19、ysaccharide2.3復(fù)合多糖解離時間對莢膜多糖產(chǎn)量和分子大小的影響解離1、6、20h對純化獲得的莢膜多糖分子大小影響不大，但解離時間越長,純化獲得的莢膜多糖產(chǎn)量越高，見表3。2.4不同廠家的苯酚去除蛋白質(zhì)效果的比較試驗利用國藥和益利兩個廠家的苯酚純化獲得的同一批莢膜多糖的蛋白質(zhì)含量全部合格，檢測結(jié)果全部小于檢測限，沒有顯著差別，見表4。表3復(fù)合多糖解離時間對莢膜多糖的影響Tab.3Effectofdissociationtimeofcompoundpolysaccharideonthecapsularpolysaccharide復(fù)合多慵解離時間(h)莢膜多糖產(chǎn)量X(g)19.490.3

20、769.730.402010.860.40表4不同廠家苯酚對莢膜多糖的影響Tab.4Effectofthedifl'erentmanufacturesofphenolonthecapsularpolysaccharide試驗次數(shù)精提批號苯酚廠商4值蛋白質(zhì)含量第1次H精-20120703-1益利0.32合格H精-20120703-2國藥0.33合格第2次H精-20120801-1益利0.33合格H精-20120801-2國與0.34合格第3次H精-20121004-1益利0.30合格H-20121004-2國藥0.28合格第4次H精-20121006-1益利0.32合格H精-201210

21、06-2國藥0.31合格第5次H精-20121007-1益利0.28合格H精-20121007-2國菊0.29合格2.5超濾法與透析法去除殘余苯酚效果的比較超濾法和透析法二者去除殘余苯酚的效果相同,且均對莢膜多糖分子大小沒有影響，見表5。這表明超濾時的剪切力很小;透析法所需時間較K,需48h以上，操作不便；而超濾法操作方便，耗時較短僅需要4h°從工藝用時的角度考慮,超濾法比透析法更優(yōu)。2.6不同超濾鹽溶液去除殘余苯酚的效果及對莢膜多糖分子大小的影響試驗發(fā)現(xiàn)無論是使用1mol/L的氯化鈉溶液，還是使用0.5mol/L的氯化鈣溶液超濾，兩者去除殘余苯酚的效果無差異,且均對莢膜多糖的分子大

22、小沒有影響(見表6)。表5超濾法和透析法對莢膜多糖的影響Tab.5Effectofultrafiltrationanddialysisonthecapsularpolysaccharide透析法超濾法原液批號L殘留苯酚原液批號Kd殘留苯酚B-20101201-10.31合格B-20101201-20.31合格B-20110202-10.32合格B-20110202-20.32合格B-20110501-10.31合格B-20110501-20.32合格B-20110601-10.32合格B-2011060I-20.30合格B-20I10803-10.33合格B-20110803-20.29合格B

23、-20110901-10.32合格B-20110901-20.33合格B-20111102-10.34合格B-20111102-20.29合格B-20!11202-10.35合格B-20111202-20.32合格B-2O12O1O1-10.34合格B-20120101-20.35合格表6超濾鹽溶液對莢膜多糖的影響Tab.6Effectofthesaltsolutionforthetechniqueofultrafiltrationonthecapsularpolysaccharide精精批號超濾用鹽溶液殘留苯酚kH精-20120901-21mol/L氯化鈉合格0.320.5mol/L氯化鈣合

24、格0.32H精-201209021mol/L氯化鈉合格0.300.5mol/L氯化鈣合格0.32H精-20120904-11mol/L氯化鈉合格0.330.5mol/L氯化鈣合格0.31H精-201209061mol/L氯化鈉合格0.310.5mol/L氯化鈣合格0.303討論CTAB是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多糖的特性，已經(jīng)廣泛的用于從多種細菌培養(yǎng)上清液中沉淀莢膜多糖。它的沉淀作用與濃度、pH值、溫度等因素有關(guān)。有報道指出CTAB濃度越高，莢膜多糖沉淀效果越好;溫度越高，沉淀效果越差。試驗發(fā)現(xiàn),CTAB的濃度并不是越高越好，增加CTAB的濃度是否能增加莢膜多糖產(chǎn)

25、量不能以復(fù)合多糖的產(chǎn)量為準，而應(yīng)該以純化后抽干的莢膜多糖產(chǎn)量為準，過高的CTAB濃度并不能增加莢膜多糖產(chǎn)量，而且CTAB濃度過高會增加復(fù)合多糖解離的難度。以往復(fù)合多糖的解離大多只關(guān)注解離時的鹽濃度，但忽略了復(fù)合多糖本身的濃度和復(fù)合多糖解離的時間，其實這3個因素之間的關(guān)系是一致的。解離時的鹽濃度要以復(fù)合多糖的濃度和解離時間為基礎(chǔ)，不能單純以離子強度的大小來衡量。試驗發(fā)現(xiàn)解離時復(fù)合多糖本身的濃度不能太高，復(fù)合多糖濃度越高，莢膜多糖分子則有變小的趨勢，可能是因復(fù)合多糖濃度過高，而鹽濃度相對不足，導(dǎo)致高分子的莢膜多糖沒有解離。超濾是一種膜分離過程,利用膜表面孔徑機械篩分作用,在外界推動力（壓力）作用下截留溶液中相對分子質(zhì)量較高的物質(zhì)，而小分子的溶質(zhì)透過膜的分離過程：5-6Jo超濾技術(shù)的優(yōu)點是操作簡便，成本低廉，尤其是超濾技術(shù)的實驗條件溫和，不易引起溫度、pH的變化，因而可以防止生物大分子的降解。與透析法比較，超濾法簡化了A群腦膜炎球菌莢膜多糖去除殘余苯酚的工藝，同時縮短了工藝用時c歷來都認為超濾時機械剪切力會對莢膜多糖的分子大小造成影響，而試驗發(fā)現(xiàn)超濾時機械剪切力對A群腦膜炎球菌莢膜多糖的分子大小沒有影響。參考文獻趙精，章以浩,李河民.