博爾納病病毒感染對少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞中IL1β表達(dá)量的影響

1、博爾納病病毒感染對少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞中IL-1表達(dá)量的影響【摘要】 目的 探討博爾納病病毒（Borna disease virus,BDV）感染對少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞 (oligodendrocyte,OL)中白細(xì)胞介素1（interleukin 1，IL-1）蛋白表達(dá)的影響。方法 首先將OL和BDV感染的OL煮沸裂解，分別提取蛋白混合液，測定蛋白的濃度后，將二者的蛋白混合液濃度均調(diào)至10 g/L，分別取蛋白混合液及其經(jīng)10000 r/min離心5 min后的上清，沉淀后分別進(jìn)行斑點免疫印跡試驗（dot-blot hybridization），檢測OL和BDV感染的OL中IL-1的存在；同時，對提取的O

2、L和BDV感染的OL中的蛋白混合液進(jìn)行2倍系列稀釋后進(jìn)行斑點免疫印跡試驗，檢測細(xì)胞中的IL-1的表達(dá)量的變化。結(jié)果 斑點免疫印跡試驗表明，OL和BDV感染的OL中提取的蛋白混合液及收集的沉淀均出現(xiàn)雜交陽性信號，而蛋白混合液離心后的上清未出現(xiàn)雜交陽性信號。等量的OL和BDV感染的OL的蛋白混合液經(jīng)2倍系列稀釋后進(jìn)行斑點免疫印跡試驗,OL的蛋白混合液在32倍的稀釋度范圍內(nèi)有雜交陽性信號，BDV感染的OL的蛋白混合液在8倍的稀釋度范圍內(nèi)有雜交陽性信號。結(jié)論 IL-1在OL和BDV感染的OL中均存在,且存在于本實驗獲得的蛋白混合液和沉淀中。BDV感染使OL中的IL-1的表達(dá)量降低，提示IL-1的表達(dá)量

3、下降，有可能使其參與的腦內(nèi)的免疫生理及病理反應(yīng)發(fā)生變化，這可能是BDV感染致病的機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】 博爾納病病毒；少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞；白細(xì)胞介素-1；斑點免疫印跡試驗 Abstract: Objective To investigate the effects of Borna disease virus (BDV) infection on the expression of interleukin 1 (IL-1) protein of oligodendrocytes (OL). Methods Both OL and the BDV-infected OL were subjected

4、 to boiling lysis, and their protein mixture was respectively extracted. After concentration determination, the protein mixtures were adjusted to 10 g/L and centrifuged at 10000 r/min for 5 min to extract protein mixtures and supernatant, which were precipitated to have dot-blot hybridization, respe

5、ctively for determination of IL-1 in OL and BDV-infected OL. Meanwhile, the protein mixtures extracted from OL and BDV-infected OL were tested by dot-blot hybridization after 12 serial dilution to determine the variations of the expression levels of IL-1 in the cells. Results Dot-blot hybridization

6、showed that positive hybrid signals were present in both the protein mixtures and precipitates extracted from OL and BDV-infected OL, while no positive hybrid signals were detected in the supernatant obtained from centrifuged protein mixtures. Equal amount of protein mixtures of the OL and the BDV-i

7、nfected OL were tested by dot-blot hybridization after 12 serial dilution. Positive hybrid signals were detectable in protein mixtures of OL within the range 132 serial dilution, while in the protein mixtures of BDV-infected OL positive hybrid signals were detectable within the range 18. Conclusion

8、IL-1 are present in both OL and BDV-infected OL, and in this experiment, present in the protein mixtures and precipitates. BDV infection leads to the decreased expression of IL-1, suggesting that the decrease in the level of IL-1 expression might be involved in the changes of immunological, physiolo

9、gical and pathological reactions within the brain and might be one of the pathogenic mechanisms of BDV infection. Key words: Borna disease virus; oligodendrocyte; interleukin 1; dot-blot白細(xì)胞介素（IL-1）在周圍血中主要由單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生，中樞IL-1主要來源于星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞。此外活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和外周入侵的巨噬細(xì)胞也是腦損傷和血腦屏障受損后 IL-1的主

10、要來源。IL-1作為體內(nèi)作用最強的炎性介質(zhì)之一，生物學(xué)作用非常廣泛，如誘導(dǎo)細(xì)胞黏附分子表達(dá)、吸引中性粒細(xì)胞聚集、激活免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)及分泌、促進(jìn)神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放等。博爾納病(Borna disease，BD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病,表現(xiàn)為明顯的行為、情感異常，炎癥細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)浸潤及特異性的病毒蛋白在邊緣系統(tǒng)中積聚。目前，關(guān)于博爾納病病毒(Borna disease virus，BDV) 的致病機(jī)制尚不完全清楚。一般認(rèn)為，BDV主要通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病理性免疫應(yīng)答而致病。通過基因芯片技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在BDV感染的少突膠質(zhì)細(xì)胞（oli

11、godendrocyte，OL）中，編碼IL-1的mRNA 發(fā)生下調(diào)，可導(dǎo)致IL-1的表達(dá)量下降，可能使得IL-1對神經(jīng)系統(tǒng)的作用發(fā)生改變，使其參與的腦內(nèi)的免疫生理及病理反應(yīng)發(fā)生變化，而這可能也是BDV感染致病的機(jī)制之一1；通過本研究觀察BDV感染對OL中IL-1表達(dá)量的影響，進(jìn)一步解釋BDV感染致病的機(jī)制。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 細(xì)胞 OL和BDV感染的OL均由天本大阪大學(xué)生田和良教授惠贈，HeLa細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供。1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)試劑 0.02%EDTA和含10%胎牛血清(FCS)、1×105 U/L青霉素,100 mg/L鏈霉素的DMEM

12、。1.1.3 總蛋白提取試劑 雙蒸餾水和PBS洗液。1.1.4 斑點免疫印跡試驗試劑 三氨基甲烷緩沖鹽溶液，TBS洗液,3%的封閉液（3 g脫脂奶粉溶于100 ml的TBS）,一抗(兔抗人IgG)、二抗(羊抗兔IgG)及DAB顯色試劑均為博士德公司產(chǎn)品。1.1.5 主要儀器 離心機(jī)(TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠)，搖床(TY-80A/S，金壇市榮華儀器制造廠)，恒溫金屬浴(BIOER,杭州博天科技有限公司)，微量蛋白核酸檢測儀(Eppendorf AG 2233)。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將培養(yǎng)至對數(shù)期的細(xì)胞用含0.02% EDTA的消化液37消化5 min，棄消化液，加入無菌

13、的培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞，按13比例常規(guī)傳代培養(yǎng)，每3天傳代1次。1.2.2 蛋白提取 將培養(yǎng)至對數(shù)期的細(xì)胞常規(guī)消化后，用PBS液吹打混勻，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一個無菌微量離心管中4 2500 r/min離心3 min，棄上清，每管中加入50 l的雙蒸餾水，用微量加樣器將細(xì)胞沉淀混勻，放入金屬浴中100裂解10 min，用水冷卻后放入到-20冰箱中保存。1.2.3 蛋白濃度的測定 消化，收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的OL和BDV感染的OL，經(jīng)水煮法提取蛋白，用微量蛋白核酸檢測儀測定蛋白濃度，每個樣本重復(fù)3次取平均值。1.2.4 斑點免疫印跡試驗檢測目的蛋白的存在與分布 將提取的OL及BDV感染的OL中的

14、蛋白混合液用微量蛋白核酸檢測儀測定后，將二者蛋白濃度均調(diào)至10 g/L，用同樣的方法提取等濃度的HeLa細(xì)胞的蛋白混合液，將提取的蛋白混合液混勻后，用微量加樣器分別取3種蛋白混合液各5 l點在NC膜上作為第1個對照組。將OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液10000 r/min離心5 min，取上清液和蛋白混合液各5 l，沉淀用5 l水重懸作為樣本，均進(jìn)行斑點免疫印跡試驗，作為第2個對照組。用含有2×SDS上樣緩沖液的3種細(xì)胞的蛋白混合液分別點樣作為第3個對照組。另取一張NC膜加樣同第一對照組作為第4個對照組。待4組全部干燥后，放入盒中加入適量封閉液37封閉1 h，取出前3組的膜將膜

15、轉(zhuǎn)移至封閉盒中，加入用封閉液稀釋的第一抗體1100稀釋，于37孵育反應(yīng)1 h，打開封閉盒傾去第一抗體，用鑷子將膜移至培養(yǎng)皿中，放在搖床上加TBS洗2次，每次10 min，加入稀釋好的酶標(biāo)第二抗體11000稀釋，繼續(xù)在37孵育反應(yīng)1 h，打開封閉盒，傾去第二抗體，用鑷子將膜移至培養(yǎng)皿中放在搖床上加TBS洗3次，每次10 min，取一個培養(yǎng)皿加入雙蒸餾水后，加入DAB 顯色試劑顯色10 min即可，終止反應(yīng)，用大量雙蒸餾水沖洗，然后將膜放入雙層濾紙中或塑料袋中干燥保存。第4組的處理方法同前3組，只是不加一抗封閉，作為一個二抗的陰性對照。1.2.5 斑點免疫印跡試驗檢測OL及BDV感染的OL中IL-

16、1的差異 將提取的OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液用微量蛋白核酸檢測儀測定后，將二者蛋白濃度調(diào)至相同，將二者蛋白濃度均調(diào)至10 g/L，從BDV感染的OL的蛋白混合液中取10 l加4.5 l的雙蒸餾水混勻配平成10 g/L的等濃度點樣蛋白，在8個離心管中分別加5 l的雙蒸餾水，從配平的10 g/L的等濃度點樣蛋白中取10 l加入到第1管中， 再取5 l加入到第2管中，混勻后取5 l加入到第3管中，以此類推，進(jìn)行2倍系列稀釋，OL中的蛋白混合液的處理方法同上，蛋白混合液進(jìn)行2倍系列稀釋后進(jìn)行斑點免疫印跡試驗比較結(jié)果，HeLa細(xì)胞的總蛋白作為陰性對照。2 結(jié)果2.1 蛋白混合液濃度測定結(jié)果 O

17、L中的蛋白混合液濃度為10 g/L,BDV感染的OL中的蛋白混合液濃度為14.5 g/L。2.2 目的蛋白的存在與分布 斑點免疫印跡試驗檢測結(jié)果顯示，蛋白混合液和沉淀加樣區(qū)域有雜交陽性信號，而其他的區(qū)域均無雜交陽性信號。 對用去離子水加熱裂解的OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液，分別加入2×SDS上樣緩沖液做斑點免疫印跡試驗，并對等量的蛋白不加一抗做斑點免疫印跡試驗，HeLa細(xì)胞的蛋白混合液作為陰性對照。OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液均有雜交陽性信號，分別加入2×SDS上樣緩沖液的OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液均有雜交陽性信號，不加一抗作斑點免疫印跡試驗的蛋白

18、混合液無雜交陽性信號，HeLa細(xì)胞的蛋白混合液均無雜交陽性信號。2.3 OL及BDV感染的OL中IL-1的差異 在相同蛋白濃度的前提條件下，OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液進(jìn)行2倍系列稀釋后,OL在32倍的稀釋度范圍內(nèi)有雜交陽性信號，BDV感染的OL在8倍的稀釋度范圍內(nèi)有雜交陽性信號。3 討論 對OL及BDV感染的OL中的蛋白混合液進(jìn)行濃度測定的結(jié)果顯示，BDV感染的OL中的蛋白混合液濃度較高，其具體機(jī)制不明。以往認(rèn)為病毒感染會干擾細(xì)胞本身的蛋白合成，而本實驗得出了相反的結(jié)果，說明BDV感染對于宿主細(xì)胞的影響與已知的其他病毒不同。 IL-1被稱為前炎癥細(xì)胞因子（pro-inflammato

19、ry cytokine）,是啟動抗菌炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它能刺激單個核細(xì)胞吞噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞黏附分子，前炎癥細(xì)胞因子的這些活性有利于抑制和排除細(xì)菌，IL-1具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，并有致熱和介導(dǎo)炎癥的作用2。 本研究結(jié)果顯示，IL-1存在于提取的蛋白混合液和沉淀中，且OL及BDV感染的OL均含有這種細(xì)胞因子，這與文獻(xiàn)中報道的中樞 IL-1主要來源于星形膠質(zhì)細(xì)胞、OL、神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞的理論相吻合。IL-1是分泌型的細(xì)胞因子，但蛋白混合液的上清中卻沒有檢出，可能是IL-1的量較少；在沉淀中有IL-1檢出，但I(xiàn)L-1以什么形式存在沉淀中，尚不清楚1。

20、 斑點免疫印跡試驗檢測OL及BDV感染的OL中IL-1的差異顯示，OL在32倍的稀釋度范圍內(nèi)有雜交陽性信號，BDV感染的OL在8倍的稀釋度范圍內(nèi)有雜交陽性信號，說明BDV感染的OL中IL-1的表達(dá)量降低。IL-1是免疫應(yīng)答中的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)，其表達(dá)量的降低會使其介導(dǎo)的天然免疫能力降低，表現(xiàn)為抗病毒和抗細(xì)菌感染能力的下降，這可能為BDV擴(kuò)散和致病提供了前提條件。 IL-1的表達(dá)量下降會使IL-1對神經(jīng)系統(tǒng)的作用發(fā)生改變，有可能使其參與的腦內(nèi)的免疫生理及病理反應(yīng)發(fā)生變化，而這可能也是BDV感染致病的機(jī)制之一。本實驗由于時間限制只是對IL-1表達(dá)量的變化進(jìn)行了測定，至于其具體的變化量、作用機(jī)制以及與BDV感染致病的關(guān)系，尚有待進(jìn)一步研究。也有相關(guān)文獻(xiàn)報道的體內(nèi)BDV感染引起I