人凝血酶原復(fù)合物生產(chǎn)過(guò)程中凝血因子活化分析.docx

1、,論著.人凝血酶原復(fù)合物生產(chǎn)過(guò)程中凝血因子活化分析何彥林，劉曉，潘孟嬌，劉曉宇，張璘，張繼鵬，張安山，楊曉東蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公同H討省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730046摘要：目的通過(guò)比較以組分ID沉淀和血漿為原料制備人凝血醵原復(fù)合物(Prothrombincomplexconcentrates,PCC)過(guò)程中凝血因子活化情況，為選擇最適PCC制備原料提供數(shù)據(jù)支持。方法分別對(duì)以組分m沉淀和血漿為原料制備PCC過(guò)程中中間品的活化的凝血因子活性和人凝血酶活性?xún)蓚€(gè)項(xiàng)目進(jìn)行檢定,分析凝血因亍的活化情況。觀察以組分01沉淀為原料制備PCC過(guò)程中添加肝素能否抑制PCC中激血因子的活化。結(jié)果

2、以組分皿沉淀為原料制備的PCC中間品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性?xún)蓚€(gè)項(xiàng)目均不合格。以蛆分1U沉淀為原料制備PCC生產(chǎn)過(guò)程中添加肝素后,PCC中間品的活化的凝血因子活性和人凝血解活性均不合格。以血漿為原料制備的PCC中間品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性?xún)蓚€(gè)項(xiàng)日均合格。結(jié)論組分ni沉淀為原料制備PCC會(huì)增加凝血因子活化的風(fēng)險(xiǎn)，新鮮冰凍血漿可作為制備PCC的原料。關(guān)鍵詞：人凝血酶原復(fù)合物;凝血因子活化;人凝血醵活性中圖分類(lèi)號(hào)：R392-33文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A1X)1：10.13309/ki.pmi.2014.03.006Analysisofcoagulationfactoractivationin

3、producingprocessofhumanprothrombincomplexconcentratesHEYan-lin,LIUXiao,PANMeng-jiao,LIUXiao-yu,ZHANGLin,ZHAXGJi-peng,ZHANGAn-shan,YANGXiao-dongIjanzhouInstituteofbiologicalProductsCo.,Lld.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Ijanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor.UU-Xia

4、o,E-mailtboylxl006Abstract:ObjectiveToexplorecoagulationfactoractivatesoftheprothrombincomplexconcentrates(PCC)manufacturedusingFIIIprecipitateandplasmaasprimarymaterials.MethodsThePCCproductsweremanufacturedwithusingFIDprecipitateandplasmaasprimarymateriuls,respectively.Heparinwasaddedinthemanufact

5、uringprocessofPCCcreatedbyFIDprecipitate,andthendetectingtheactivityofcoagulationfactorandthromlwgenicily.ResultsIntheconditionofPCCmanufacturedbyusingFillprecipitateasmaterials,theactivatedcoagulationfactor*sactivityandthromlxigenicilyhavenotbeenachieved(hestandardrequirementswhereastheiractivities

6、wereaccordedwiththedemandsafteraddingheparininthemanufacturingprocess.Inthecaseofusingplasmaasprimarymaterialstheiractivitieswerealsoinkeepingwiththequalityrequirements.ConclusionsUsingtheFUIprecipitateasrawmaterialtakeariskofincreasingcoagulationfactoractivation.Theplasmaisagoodmaterialusedfortnani

7、ifacturingPCC.Keywords：Prothrombincomplexconcentrates;(Coagulationfactoractivation；Thn)mix)genicity人凝血酶原復(fù)合物(Prothrombincomplexconcentrates,pcc)是一種含有凝血因子n、ix、x四種維生素K依賴(lài)性凝血因子,能夠促進(jìn)血液凝固的血漿蛋白制劑。在臨床上，PCC主要用于治療乙型血友病和肝臟疾病以及維生素K缺乏引起的凝血因子含量低下引起的出血癥狀。另外，在治療因長(zhǎng)作者簡(jiǎn)介:何彥林，副研究員，主要從事血液制品科研和生產(chǎn)管理工作。通訊作者:劉曉.E-mai】：boylx1

8、006期輸注FVIII的甲型血友病患者產(chǎn)生FVI1I抑制劑而引起出血的癥狀也得到了肯定。在國(guó)外，PCC還被廣泛用于治療因過(guò)缺服用由維生素K拮抗劑作為抗凝藥物引起的出血癥狀。近年來(lái)，隨著臨床醫(yī)生的認(rèn)同,PCC的需求址逐年加大。自PCC制品問(wèn)世以來(lái)，有不少關(guān)于輸注PCC后導(dǎo)致血栓形成并發(fā)癥的報(bào)道，通常會(huì)引起心肌梗塞、彌漫性血管內(nèi)凝血、動(dòng)脈栓塞和深部血管凝血。PCC引起血栓的主要原齒是生產(chǎn)過(guò)程中活化的凝血因子和其中所含的促凝活性的磷脂等雜質(zhì)所致。因此，在PCC生產(chǎn)過(guò)程中，減少凝血因子的活化和提高PCC制品純度是減少輸注PCC后引起血栓的關(guān)鍵因素。通過(guò)檢測(cè)PCC過(guò)程中活化的凝血因子活性和人凝血酶活性，

9、可反映PCC制品中凝血因子的活化情況。組分in沉淀是血漿蛋白低溫乙醇生產(chǎn)工藝中的一種廢料,富含凝血因子ii、vii、ix、x等成分，因此采用組分ID沉淀為原料制備PCC能夠提高廢料的綜合利用。但是在生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常面臨PCC制品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性不合格的情況，如何改善這種局面是目前PCC生產(chǎn)的關(guān)鍵問(wèn)題。因此，實(shí)驗(yàn)分別采用組分m沉淀和血漿為原料制備PCC,比較兩種原料制備PCC過(guò)程中活化的凝血因子活性和人凝血酶活性，并在以組分in沉淀為原料制備PCC過(guò)程中添加肝素，初步探討添加肝素后生產(chǎn)的PCC凝血因子活化悄況，為選擇最適PCC制備原料提供數(shù)據(jù)支持。1材料和方法1.1材料和儀器組分I

10、II沉淀來(lái)自蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司血液制劑室低溫乙醇?jí)簽V工藝生產(chǎn)的廢料;新鮮冰凍血漿來(lái)自蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司血液制劑室；缺血小板血漿、腦磷脂、人凝血酶、纖維蛋白原等檢測(cè)試劑均購(gòu)自PacificHemostasis公司;硫酸魚(yú)精蛋白、肝素鈉均購(gòu)自Siga-ma公司；檸檬酸三鈉、氮化鈉、氯化鈣、Tris等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1.2 PCC的制備方法1.2.1組分III沉淀制備PCC的方法組分III沉淀PEG沉淀一>壓濾->DEAESephadexA-50吸附平衡、洗滌和洗脫超濾->S/D病毒滅活->DEAESephadexA-50吸附-平衡、洗

11、滌和洗脫-超濾-配制-除菌過(guò)濾和分裝一>凍干一>干熱病毒滅活。L2.2血漿制備PCC的方法血漿一離心去除冷沉淀->DEAESephadexA-50吸附-平衡、洗滌和洗脫一超濾->S/D病毒滅活一DEAESephadexA-50吸附-平衡、洗滌和洗脫一超濾一配制一>除菌過(guò)濾和分裝T凍干干熱病毒滅活1.3 組分III沉淀制備PCC生產(chǎn)過(guò)程的取樣點(diǎn)在組分III沉淀為原料制備PCC的關(guān)鍵工藝點(diǎn)取樣，組分m沉淀溶解液、有機(jī)溶劑/去污劑（s/d）處理法滅活病毒前和滅活病毒后、pcc干熱法滅活病毒前和滅活病毒后。分別檢測(cè)各樣品的人凝血麗活性和活化的凝血因子活性。1.4 組分II

12、I沉淀為原料添加肝素制備PCC過(guò)程的取樣點(diǎn)以組分ID為原料添加肝素制備PCC過(guò)程中，在關(guān)鍵工藝點(diǎn)取樣，對(duì)樣品進(jìn)行人凝血酶活性和活化的凝血因子活性的檢定。取樣點(diǎn)為組分m沉淀溶解液、S/D法滅活病毒前和滅活病毒后、PCC干熱法滅活病毒前和滅活病毒后。1.5 血漿為原料制備PCC生產(chǎn)過(guò)程的取樣點(diǎn)以血漿為原料制備PCC的取樣點(diǎn)為S/D法滅活病毒前和滅活病毒后、PCC干熱法滅活病毒前和滅活病毒后。1.6 凝血因子的活性16.1活化的凝血因子活性檢測(cè)依據(jù)中華人民共和國(guó)藥典（三部）2010年版附錄IX0活化的凝血因子活性檢查法進(jìn)行檢測(cè)。活化的凝血因子活性檢定的空白采用Tris緩沖液代替樣品，判定標(biāo)準(zhǔn)為空白對(duì)

13、照凝固時(shí)間不低于200秒，試驗(yàn)成立。10倍和100倍供試品稀釋液凝固時(shí)間均應(yīng)不低于150秒，判定合格。16.2人凝血酶活性檢測(cè)依據(jù)中華人民共和國(guó)藥典（三部）2010年版附錄IXN人凝血酶活性檢查法進(jìn)行檢測(cè)。人凝血酶活性的陰性對(duì)照采用生理鹽水替代供試品，陽(yáng)性對(duì)照采用0.5IU的凝血酶溶液替代供試品。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為陰性對(duì)照無(wú)任何凝塊或纖維蛋白原析出，陽(yáng)性對(duì)照有凝塊或纖維蛋白原析出，則試驗(yàn)成立。肉眼觀察供試品應(yīng)無(wú)凝塊或纖維蛋白原析出，判定合格。2結(jié)果組分m沉淀制備pcc各工藝點(diǎn)樣品裁血因子的活性檢測(cè)以組分m沉淀為原料制備pcc的各工藝點(diǎn)樣品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性檢查結(jié)果，見(jiàn)表1。Fii+i

14、n沉淀溶解液活化的凝血因子活性合格，但人凝血瓣活性檢查中發(fā)現(xiàn)有少量纖維蛋白原析出，說(shuō)明樣品中有少最凝血因子活化。PCC制備過(guò)程中S/D法滅活病毒前后和干熱法滅活病毒前后樣品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性均不合格，說(shuō)明樣品中大部分凝血因子已經(jīng)活化。2.1 組分III沉淀添加肝素制備PCC各工藝點(diǎn)樣品凝血因子的活性檢測(cè)除Fin沉淀溶解液工藝點(diǎn)樣品活化的凝血因子活性合格外，其他工藝點(diǎn)樣品活化的凝血因子活性和人凝血酶活性?xún)身?xiàng)檢測(cè)結(jié)果均不合格，見(jiàn)表2。表1組分HI沉淀制備PCC各工藝點(diǎn)樣品的檢測(cè)結(jié)果Tab.1Theresultsofcoagulationfactoractivationinprepar

15、ingprocessofPCCwithFIDprecipitate樣品活化的凝血因子活性（S）結(jié)果判定人凝血醯活性結(jié)果判定1:101:100Fin沉淀溶解液200220合格無(wú)凝塊，有少足纖維蛋白原析出不合格S/D法滅活前10198不合格有凝塊不合格S/D法滅活后7067不合格有凝塊不合格PCC干熱法滅活前10087不合格有凝塊不合格PCC干熱法滅活后4735不合格有凝塊不合格表2組分in沉淀制備pcc添加肝素后各工藝點(diǎn)樣品的檢測(cè)結(jié)果Tab.2Theresultsofcoagulationfactoractivationaddinghcrpinsodiuminthepreparingproces

16、sofPCCwithFillprecipitate樣品活化的凝血因子活性（S）結(jié)果判定人凝血酶活性結(jié)果判定1:101:100Fm沉淀溶解液300290合格無(wú)凝塊，有少量纖維蛋白原析出不合格S/D法滅活前130160不合格18h左右纖維蛋白原析出不合格S/D法滅活后133143不合格10h左右纖維蛋白原析出不合格PCC干熱法滅活前140169不合格6h后有凝塊不合格PCC干熱法滅活后7090不合格6h后有凝塊不合格2.3血漿為原料制備PCC各工藝點(diǎn)樣品凝血因子品的活化的凝血因子活性和人凝血酶活性檢測(cè)結(jié)果的活性檢測(cè)以血漿為原料制備PCC各工藝點(diǎn)樣均合格，見(jiàn)表3。表3血漿為原料制備PCC各工藝點(diǎn)樣品

17、的檢測(cè)結(jié)果Tab.3CoagulationfactoractivationofPCCusingplasmaastheprimarymaterials樣品活化的凝血因于活性（S）結(jié)果判定人凝血酶活性結(jié)果判定1:1()1:100S/D法滅活前210200合格無(wú)凝塊和纖維蛋白原析出合格S/D法滅活后220210合格無(wú)凝塊和纖維蛋白原析出合格PCC干熱法滅活前220210合格無(wú)凝塊和纖維蛋白原析出合格PCC干熱法滅活后200190合格無(wú)凝塊和纖維蛋白原析出合格3討論目前，PCC制備的原料主要有血漿、去除冷沉淀、凝血因子訓(xùn)的血漿，低溫乙醇工藝中的組分皿沉淀和組分I上清。對(duì)于PCC產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，降低其在臨床應(yīng)

18、用中的血栓性風(fēng)險(xiǎn)是非常關(guān)鍵的問(wèn)題。生產(chǎn)過(guò)程中活化的凝血因子是引起PCC血栓性的主要原因之一。近年來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)道，在PCC制品或PCC制備工藝過(guò)程中通過(guò)添加肝素鈉、肝素鈉和AT-m、優(yōu)化關(guān)鍵工藝參數(shù)等方式可以抑制PCC中凝血因子的活化。曹海軍等在制備PCC的過(guò)程中通過(guò)向血漿中加入0.2IU/mL肝素鈉來(lái)抑制凝血酶原的激活，最終獲得了合格的PCC濃縮物:，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以組分m沉淀為原料添加肝素和不添加肝素制備的pcc均不合格，這可能是因?yàn)榻M分m沉淀為血液制品低溫乙醇法生產(chǎn)工藝的中間品，乙醇會(huì)使血漿中抑制凝血因子活化的天然抑制劑滅活,所以采用組分m沉淀為原料制備pcc會(huì)增加凝血因子活化的風(fēng)險(xiǎn)。采

19、用血漿為原料制備pcc過(guò)程中的取樣兩個(gè)項(xiàng)目均合格。此外，門(mén)前蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司采用低溫乙醇?jí)簽V法進(jìn)行人血白蛋白和免疫球蛋白的生產(chǎn)，生產(chǎn)過(guò)程中加入了助濾劑，助濾劑含有激活凝血因子的物質(zhì)，所以，生產(chǎn)中不宜采用組分in沉淀而應(yīng)采用血漿為原料制備PCC。參考文獻(xiàn).1SorensenB.SpahnDR,InnerhoferP,etal.Clinicalreview:prothrombincomplexconcentrates-«va)uationofsafelyandthromboge-nicity.J.CrilCare,2011.15(1)：201.:2SamamaCM.Prothrombincomplexconcentrates:abriefreviewJJ.EurJAnarsthesiol.2008,25(10)：784-789.3包正琦.何彥林.人凝血酶原復(fù)合物制備工藝研究進(jìn)展J.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展.2013.41(4)：79-84.|4啻海軍，葉生亮，王宗奎.等.正交試驗(yàn)法優(yōu)化凝血酶原復(fù)合物的制備工藝J.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2012,25(11):1538-1542.收稿日期：2013-12-26修回日期;2