健中愈瘍片對(duì)胃潰瘍線粒體DNA修復(fù)酶調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)與臨床研究

1、健中愈瘍片對(duì)胃潰瘍線粒體DNA修復(fù)酶調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)與臨床研究         【摘要】  目的從分子水平探討健脾益氣方藥在胃潰瘍黏膜損傷修復(fù)過程中對(duì)線粒體DNA修復(fù)酶的調(diào)控機(jī)制及觀察愈合質(zhì)量，深入探討線粒體DNA修復(fù)酶對(duì)胃潰瘍的胃黏膜的修復(fù)逆轉(zhuǎn)作用及中藥的作用靶點(diǎn)。方法用臨床觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究健脾益氣方藥對(duì)胃潰瘍胃黏膜的保護(hù)與修復(fù)作用。比較健中愈瘍片、黏膜保護(hù)劑胃舒平以及H2受體拮抗劑法莫替丁對(duì)胃黏膜線粒體 8氧鳥嘌呤DNA糖基化酶、胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶、3甲基腺嘌呤DNA糖基化酶的影響，并進(jìn)行健

2、脾益氣方藥與黏膜保護(hù)劑胃舒平以及H2受體拮抗劑法莫替丁對(duì)胃潰瘍愈合質(zhì)量的比較和評(píng)價(jià)。結(jié)果正常組線粒體DNA修復(fù)酶含量很低，胃潰瘍組線粒體DNA修復(fù)酶含量很高，健中愈瘍片組線粒體DNA修復(fù)酶含量較正常組極顯著增高（P0.01），胃舒平組線粒體DNA修復(fù)酶含量與胃潰瘍組沒有差異(P0.05)，法莫替丁組線粒體DNA修復(fù)酶含量比胃潰瘍組減少(P0.05)。而潰瘍愈合質(zhì)量則健中愈瘍片組和法莫替丁組沒有差異(P0.05),二者均好于胃舒平組(P0.05)；在脾虛證的改善上, 健中愈瘍片組明顯優(yōu)于法莫替丁組和胃舒平組(P0.01)。結(jié)論 健中愈瘍片對(duì)胃潰瘍的治療機(jī)理之一是對(duì)線粒體DNA修復(fù)酶進(jìn)行了調(diào)控，提

3、高了修復(fù)因素，這是其作用靶點(diǎn)之一；而法莫替丁和胃舒平組治療機(jī)理分別是減少損害因素和進(jìn)行物理保護(hù)，其作用與線粒體DNA修復(fù)酶關(guān)系不甚密切；但對(duì)脾虛癥狀的改善上，健中愈瘍片的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于西藥組，顯示了中醫(yī)藥治療的優(yōu)越性。 【關(guān)鍵詞】  健中愈瘍片 胃潰瘍 線粒體DNA修復(fù)酶Abstract:ObjectiveClinical practice has proved that invigorating  spleen and benefiting vital energy Chinese  formulated products -Jian Zhong Yu Yang

4、Tablet(JZYYT) has  good curative effect on tough gastric ulcer. Our research is to reveal how the invigorating spleen and benefiting vital energy Chinese drugs regulate the mitochondrion DNA repair enzymes, to reveal how Chinese drugs cure gastric ulcer, and to find the target of Chinese drugs.

5、MethodsOur study was to treat gastric ulcer by invigorating spleen and benefiting vital energy Chinese drugs through clinical observation and experimental research, and compared with mucosa protectant -gastropine and H2 receptor antagonist -famotidine  about the mucosa mitochondrion 8-oxygen gu

6、anine DNA glycosylase, thymine glycol DNA glycosylase,3-methyl adenine DNA  glycosylase,  the effect of gastralgia, splenic asthenia and quality  of ulcer recovery.In clinical research, we observed  the rank of gastralgia, splenic asthenia and compositive therapeutic effects. In

7、animal experiment, we detected the body weight, frequency of twisting in unit time, suspending time, index number of gastric ulcer, and microcirculation of gastric mucosa such as the value of  B/(R+G+B) to clarify the regulation effect of invigorating spleen and benefiting vital energy Chinese

8、drugs on mitochondrion DNA repair enzymes, and the therapeutic effect  on gastric ulcer in molecular level.ResultsMitochondrion DNA repair enzymes were the lowest in the gastric mucosa of normal group, but they were very high in gastric ulcer group, there had significant difference between them

9、（P0.01）；Mitochondrion DNA repair enzymes had no difference between gastropine group and gastric ulcer group（P0.05）；Mitochondrion DNA repair enzymes in  famotidine  group  decreased  extremely compared with gastric ulcer group（P0.01）,but still extremely higher than normal group（P0

10、.01）；Mitochondrion DNA repair enzymes were the highest in JianZhongYuYang Tablet group, and had extreme differences compared with each of the other 4 groups（P0.01）. Grade of gastralgia：before treatment ,there had extreme differences  between normal group and the other 4 groups（P0.01），there had

11、no differences among the other 4 groups（P0.05）.After treatment, grades of gastralgia in JianZhongYuYang Tablet group and famotidine  group were the lowest, and had no difference between them（P0.05）；the grade of gastralgia in gastropine group was lower, there had extreme difference compared with

12、 gastric ulcer group（P0.01），but also had extreme differences compared with JianZhongYuYang Tablet  group and famotidine  group. In the difference of grade of gastralgia before and after treatment, JianZhongYuYang Tablet group had no difference compared with famotidine  group（P0.05），bu

13、t gastropine group had obvious difference compared with JianZhongYuYang Tablet group（P0.05），and had extreme differences compared with famotidine  group（P0.01）. Syndrome of splenic asthenia：before treatment ,the rank of splenic asthenia in each group was balanced except normal group. After treat

14、ment, the change of splenic asthenia in JianZhongYuYang Tablet group was the biggest, and had  extremely significant differences from the other 4 groups（P0.01），famotidine  group and gastropine group was extremely significant differences compared with gastric ulcer group（P0.01），but famotidi

15、ne  group had no difference with gastropine group（P0.05）.ConclusionTo treat gastric ulcer, JianZhongYuYang Tablet has excellent effect to relieve pain and to eliminate splenic asthenia.It has the same effect with famotidine to alleviate pain, but is better than western drugs in eliminating sple

16、nic asthenia and improving microcirculation of gastric mucosa. In mechanism of action, JianZhongYuYang Tablet can increase the mitochondrion DNA repair enzymes greatly to repair the damaged gastric mucosa, and promote the self-cure of gastric ulcer, this is the difference to western medicine. Wester

17、n medicine emphasize the counteraction against harmful factors, while JianZhongYuYang Tablet focuses on self-repair, it is  consistent with the theory of traditional Chinese medicine "supporting healthy energy to eliminate evils", "if healthy energy is inside, evil factors can no

18、t come in". So our research give the evidence to show the superiority of Chinese drugs. We know, the function of Chinese traditional patent drugs have  multiplicate  mechanisms to cure disease, our study proved one of the targets of Chinese traditional patent drugs how to cure gastric

19、 ulcer only, that is : Chinese traditional patent drugs can adjust mitochondrion DNA repair enzymes.With the development of molecular biology, we wish we can find more mechanisms of Chinese traditional patent drugs trough experiments in the future, and make greater contributions to the cause of inve

20、stigating, developing the precious wealth-traditional Chinese medicine.Key words:JianZhongYuYang Tablet；  Gastric ulcer；  Mitochondrion DNA repair enzymes   劉友章教授是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院大內(nèi)科主任，博士后導(dǎo)師，他首次提出了“脾主運(yùn)化與細(xì)胞線粒體具有相關(guān)性”的理論，胃潰瘍是針對(duì)胃黏膜的侵襲因素超過防御因素和修復(fù)能力的結(jié)果1。筆者從臨床觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩方面研究了健脾益氣方藥對(duì)胃潰瘍胃黏膜的保護(hù)與

21、修復(fù)作用。比較了健中愈瘍片、黏膜保護(hù)劑胃舒平以及H2受體拮抗劑法莫替丁對(duì)胃黏膜線粒體 8氧鳥嘌呤DNA糖基化酶、胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶，3甲基腺嘌呤DNA糖基化酶的影響，并進(jìn)行健脾益氣方藥與黏膜保護(hù)劑胃舒平以及H2受體拮抗劑法莫替丁對(duì)胃潰瘍愈合質(zhì)量的比較和評(píng)價(jià)?，F(xiàn)報(bào)道如下。1  臨床觀察部分1.1  方法病例收集在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病房、胃鏡室及內(nèi)科進(jìn)行。選擇10例胃鏡下沒有胃黏膜病變的健康人為健康人組，作為比照標(biāo)準(zhǔn)，其中男性5例，女性5例，最大年齡58歲，最小年齡22歲。選擇40例脾氣虛型胃潰瘍患者（納入標(biāo)準(zhǔn)均按照中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則），其中男性22例，

22、女性18例，最大年齡62歲，最小年齡20歲，病程最長(zhǎng)15年，最短3個(gè)月，隨機(jī)分為胃潰瘍組10例，健中愈瘍片組10例、胃舒平組10例和法莫替丁組10例，各組除用藥外，性別、年齡、病程等都均衡一致，沒有顯著差異。使用儀器為OLYMPUS CLV-u40電子胃鏡，奧林巴斯公司生產(chǎn)。取材地址為廣州中醫(yī)藥大學(xué)胃鏡室。用藥前1天晚上20時(shí)后禁食，第2天在胃鏡下看準(zhǔn)胃角，在大彎側(cè)體竇交界上10 cm，小彎側(cè)胃角上4 cm處各取組織2塊，冷凍于70的液氮罐中備用。   胃舒平組：用胃舒平片1.4 g/次（0.35 g/片×4片），4次/d口服，餐前1 h及睡前服用，壓碎或咀嚼服用

23、。   法莫替丁組：用法莫替丁膠囊，20 mg/次，2次/d，早晨及睡前口服。   實(shí)驗(yàn)藥品：健中愈瘍片由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備，批準(zhǔn)文號(hào)：粵藥制字Z03020828，批號(hào)：050203，組成為黨參、白術(shù)、黃芪、莪術(shù)、救必應(yīng)、延胡索、蒲公英、白及、烏賊骨、珍珠末等，制成素片，每片250 mg(含生藥7.45 g)。消炎痛（吲哚美辛）由廣東華南藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H44020701，產(chǎn)品批號(hào)：060101。胃舒平（復(fù)方氫氧化鋁片）由廣東三才醫(yī)藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H44021288，產(chǎn)品批號(hào)：20060520。

24、法莫替丁由廣州白云山僑光制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字：H44020955，產(chǎn)品批號(hào)：60090。3組均在服藥后30 d復(fù)診，按前述方法取材，并用PCR方法測(cè)定各組胃黏膜組織中胃黏膜線粒體 8氧鳥嘌呤DNA糖基化酶、胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶、3甲基腺嘌呤DNA糖基化酶的含量及進(jìn)行療效判定。   試劑盒均由著名生物工程公司如中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司、廣州市達(dá)輝生物技術(shù)有限公司提供，由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司及聯(lián)合生物集團(tuán)（中國）廣州分公司生產(chǎn)，包括上游引物F(2管)，下游引物R（2管），Dntp,逆轉(zhuǎn)錄RT-buffer，逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV），Taq酶，dd

25、H2O，陽性標(biāo)準(zhǔn)品（20管），5×定量buffe，批號(hào)：20060418。實(shí)驗(yàn)地址為廣州市達(dá)輝生物技術(shù)有限公司205實(shí)驗(yàn)室屬于中山大學(xué)達(dá)安科技園，所使用的實(shí)驗(yàn)室為衛(wèi)生部醫(yī)藥生物工程技術(shù)研究中心，為國家發(fā)展和改革委員會(huì)2005年頒發(fā)授予的國家高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程。使用儀器為ABI PRISM 7000 SDS熒光定量PCR儀，ABI prism公司生產(chǎn)。   胃痛分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：見表1。表1  胃痛分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（略）   脾虛輕重程度分級(jí)：見表2。表2  脾虛輕重程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（了）    療效判定標(biāo)準(zhǔn)

26、60;  臨床痊愈   全部癥狀消失；   受試對(duì)象所患西醫(yī)診斷的胃潰瘍，有相應(yīng)的客觀診斷指標(biāo)證實(shí)確有顯著改善；   脾虛參考指標(biāo)治療后有明顯改善。   具備項(xiàng)即可判斷，項(xiàng)作參考。   顯效   癥狀有明顯改善，即改善在2級(jí)以上（如變化為）；或個(gè)別主癥改變?cè)?級(jí)，而其它主要癥狀全部消失；   受試對(duì)象所患疾病的客觀診斷檢查指標(biāo)有所好轉(zhuǎn)；   脾虛參考指標(biāo)治療后有所好轉(zhuǎn)。   有效項(xiàng)為必備，項(xiàng)作參考。

27、0;  癥狀均有好轉(zhuǎn)，改善在1級(jí)以上者，或個(gè)別主癥有顯著改善（如由變?yōu)椋?#160;  受試對(duì)象所患疾病的客觀診斷檢查指標(biāo)穩(wěn)定；   脾虛參考指標(biāo)有相應(yīng)好轉(zhuǎn)。   無效   癥狀無改善；所患疾病的各項(xiàng)客觀檢查無變化；脾虛參考指標(biāo)亦無變化。         2  動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分2.1  脾虛模型的建立270日齡180220 g成熟Sprague Dawley大鼠雌雄各半隨機(jī)分為5組(n=10)。按常規(guī)煎法制備小承氣湯（

28、大黃厚樸枳實(shí)453），模型組：每日灌飼小承氣湯煎劑 60 g/kg（20 ml/kg），隔日半量進(jìn)食，自由飲水；正常對(duì)照組：常規(guī)飼養(yǎng)，共15 d。   實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明：NO0016901,質(zhì)量檢測(cè)單位：廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，檢測(cè)日期：20060330。許可證號(hào)：SCXK(號(hào))20030001號(hào)監(jiān)證字：2006A014，20060712。實(shí)驗(yàn)室為廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，為廣東省科委批準(zhǔn)的廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)培訓(xùn)中心，通過了“211工程”子項(xiàng)目的驗(yàn)收。所用單味中藥均一次性購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥房。2.2  消炎痛皮下注射法胃潰瘍?cè)炷?脾虛

29、造模15 d后，大鼠禁食不禁水24 h，取消炎痛先溶解在5%的碳酸氫鈉溶液中，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸鎦水稀釋成0.4%的濃度。以消炎痛20 mg/kg背部皮下注射消炎痛，造成胃潰瘍模型。2.3  分組與給藥A正常對(duì)照組：灌胃給予0.9%生理鹽水2ml/只，18 mg/（kg·d）；B脾虛型潰瘍模型組：灌胃給予生理鹽水18 mg/（kg·d）；C健中愈瘍片組：灌胃給予健中愈瘍片5%混懸液2 ml/只，110 mg/（kg·d）；D胃舒平組：灌胃給予3.5%胃舒平2 ml/只，205 m g/（kg·d）；E法莫替丁組：灌胃給予0.06%法莫替丁2 ml/只，

30、1.46 mg/（kg·d）。各組藥物灌胃前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制為混懸液使用。實(shí)驗(yàn)期間常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食,處死動(dòng)物前禁食24 h，但飲水自由。2.4  用Okabe改良法進(jìn)行胃黏膜損傷評(píng)分4將鼠胃固定于10%甲醛溶液中，20 min后沿胃大彎剪開沖洗，根據(jù)Okabe改良法測(cè)定出血病灶：先計(jì)算總潰瘍（黏膜缺損）數(shù)，將潰瘍最大徑1 mm 者按大潰瘍計(jì)，測(cè)量其長(zhǎng)寬徑，按（長(zhǎng)徑×寬徑）/2×公式計(jì)算潰瘍面積。最大徑小于1mm 者以小潰瘍計(jì)數(shù)，以兩者計(jì)分總和綜合評(píng)定潰瘍指數(shù)，作為潰瘍嚴(yán)重程度的指標(biāo)。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)無病變計(jì)0分，小潰瘍個(gè)數(shù)在15個(gè)計(jì)0.5分，個(gè)數(shù)

31、在620個(gè)或面積在15 mm2計(jì)1分，以后潰瘍個(gè)數(shù)每增加20個(gè)和面積增加5 mm2計(jì)1分，進(jìn)行胃黏膜損傷的定量化。2.5  大鼠體重、懸吊實(shí)驗(yàn)及扭動(dòng)次數(shù)5大鼠在實(shí)驗(yàn)前，脾虛造模后，健中愈瘍片、胃舒平、法莫替丁灌胃后均用電子天平秤體重及用秒表測(cè)量懸吊時(shí)間，做為脾虛癥狀加重和改善的指標(biāo)。用半小時(shí)肢體扭動(dòng)次數(shù)來做為胃潰瘍疼痛程度的指標(biāo)。2.6  大鼠胃黏膜微循環(huán)狀態(tài)測(cè)定用中性紅比色法，自尾靜脈注入0.1%中性紅（8 mg/kg），30 min后剪取胃黏膜，用三角架固定數(shù)碼照相機(jī)，固定參數(shù)進(jìn)行拍攝，然后并用Photoshop 7.0 軟件的RGB比色功能將紅色進(jìn)行定量，然后對(duì)微循環(huán)

32、狀態(tài)進(jìn)行比較，間接反應(yīng)出潰瘍愈合的質(zhì)量。2.7  數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5 for windows統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，屬于正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料及等級(jí)資料采用多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)。2.8  結(jié)果見表313。表3  8氧鳥嘌呤DNA糖基化酶含量(略)表4  8氧鳥嘌呤DNA糖基化酶各組P值比較(略)表5  胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶含量(略)表6  胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶各組P值比較(略)表7  3甲基腺嘌呤DNA糖基化酶含量(略)表8  3甲基腺

33、嘌呤DNA糖基化酶各組P值比較(略)   表38表明，正常組線粒體DNA修復(fù)酶系列的含量很低，而胃潰瘍組自我修復(fù)所以含量很高，法莫替丁由于減少了損害因素，所以反饋性地降低了修復(fù)酶含量，胃舒平只是物理保護(hù)作用，對(duì)修復(fù)酶影響不大，健中愈瘍片大大提高了修復(fù)酶含量，增加了自我修復(fù)因素。3  討論   胃黏膜的損傷常由諸多有害因素引起6，諸如酸、堿、乙醇、膽鹽、HP、急性失血、精神應(yīng)激等，藥物對(duì)胃黏膜的損害的作用也十分常見。胃潰瘍的黏膜修復(fù)，是指胃黏膜對(duì)有害因素如對(duì)食物、幽門螺桿菌感染、乙醇、酸、膽鹽、非固醇類抗炎藥、應(yīng)激及溫度（過冷、過熱）等造成黏膜損

34、傷的修復(fù)能力6。在Tarnawske 等第一次提出潰瘍修復(fù)質(zhì)量（Quality of ulcer healing，QUH）的概念后7，人們對(duì)潰瘍修復(fù)的認(rèn)識(shí)開始由研究外在修復(fù)因素轉(zhuǎn)向側(cè)重內(nèi)在修復(fù)因素。潰瘍修復(fù)的過程十分復(fù)雜，目前認(rèn)為影響胃黏膜修復(fù)質(zhì)量的因素主要有：胃黏膜微循環(huán)的血流量；生長(zhǎng)因子的調(diào)控；花生四烯酸的代謝產(chǎn)物的影響；氧自由基對(duì)潰瘍修復(fù)質(zhì)量的影響；老齡化對(duì)潰瘍修復(fù)質(zhì)量的影響；HP對(duì)潰瘍修復(fù)質(zhì)量的影響；抗?jié)兯幬锏挠绊?。但胃黏膜線粒體DNA修復(fù)酶在胃潰瘍修復(fù)過程中的機(jī)制以及中藥對(duì)其的調(diào)控研究還是一片空白。表9  胃痛評(píng)分(略)表10  胃痛定量P值比較(略)表11&#

35、160; 脾虛癥狀變化例(略)表12  大鼠胃黏膜損傷評(píng)分、體重、懸吊時(shí)間及扭動(dòng)次數(shù)(略)表13  大鼠胃黏膜微循環(huán)狀態(tài)變化(略)   線粒體DNA修復(fù)系統(tǒng)相關(guān)酶的研究現(xiàn)狀8：作為真核細(xì)胞能量中心的線粒體,擁有自己特異的遺傳物質(zhì)線粒體DNA(mtDNA) 。mtDNA編碼的每一個(gè)亞單位都是線粒體完成正常的氧化磷酸化過程所必需的,因此,線粒體基因組的完整性對(duì)于生物體的損傷修復(fù)十分重要。長(zhǎng)期以來,人們一直認(rèn)為線粒體中不存在DNA 的修復(fù)9，10 。但近年來在線粒體提取物中卻檢測(cè)到了修復(fù)因子,其中大多數(shù)是參與清除DNA 中單個(gè)突變堿基的堿基切除修復(fù)途徑(BER) 的酶,提示線粒體中存在DNA 修復(fù)。當(dāng)前,對(duì)線粒體DNA 修復(fù)過程的理解是一個(gè)具有重要意義的課題,因?yàn)樗鼘⒂兄谔矫骶€粒體DNA 的自我修復(fù)機(jī)制對(duì)潰瘍愈合的意義。已