乙型腦炎核酸疫苗的研究進展.docx

1、欄目協(xié)辦騰駿藥業(yè)wSS國索高齒技術企業(yè)乙型腦炎核酸疫苗的研究進展王鳳'.湯德元，曾智勇馬摩.李春燕'.劉U2徐健'(1責州大學動物科學學院.貴州貴陽550025,2.貴州省動物疫病預防控制中心.貴州貴陽550008)摘要：乙型腦炎是一種嚴重威脅人畜健康的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病,也是重要的人帝共患的蟲媒病毒病.被國際獸醫(yī)局(OIE)列為B類傳染病。該病對豬的致死率不高.但能引起懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎.公豬發(fā)生塞丸炎.育肥豬引起持續(xù)高熱.仔豬常呈腦炎癥狀.直接影響豬群數(shù)量的擴大，對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重危害.也影響人類的健康。目前本病尚無特效療法,主要依靠疫苗預防.世界衛(wèi)

2、生組織己把研究和開發(fā)防治乙型腦炎疫苗列為優(yōu)先研究和開發(fā)的項目之一.本文主要對乙型腦炎病毒核酸疫苗目前的研究現(xiàn)狀進行了綜述.為乙型腦炎核酸疫苗的深入研究提供參考。關鍵伺：乙型腦炎；核酸疫苗:研究進展:”06年黃州事商屆次人才科條件村*麟日曾助(Mt,TZJF-200«+0l號)會冊大乎JU,作會介，工盡dm-).*.義會從事功物停建病病廉分子生物手$Jt.it訊作耆,尚健九M.赦裁.命士生不希.1委從動物?；坎?位合赦學科研工作.E-aallItdyuan®I*3.co*乙型腦炎(Japaneseencephalitisvirus,JEV),足由乙型腦炎病嵌引起的傳染性疾病。

3、詼病對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴杭危害，尤其是近年來集約化養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家損失靖為嚴爪。雖然獸醫(yī)科研人員和養(yǎng)豬業(yè)者進行多方面的努力，采取包括種源控制、疫病凈化、消版隔離和早期斷奶等防治措施，但仍不能禁絕核病的發(fā)生和蔓延.目前預防乙型腦炎病業(yè)感染的技苗有滅活疫苗和德版活疫苗.但由于滅活疫苗存在注射削虻大，需多次注射.效果不槍定、免疫力不持久及副作用大等不足之處,我國研制的SA14-14-2株誠壽活疫苗航然保護性好.叮以很好地刺激機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫.但活疫苗畢竟是一種活的澈生物.有可能出現(xiàn)毒力反強、帝毒、排毒、弱直傳播、核酸敗組等現(xiàn)象，而旦通過常規(guī)的血清學方法一般與自然感染無法區(qū)分.因此，人們在設法利用

4、生物技術開發(fā)新型尊因工程疫苗即核酸疫苗以克服現(xiàn)有疫苗的缺點.是當前研究的熱點.現(xiàn)將其進行如下綜述。1乙型腦炎病毒的基因結(jié)構及其核酸疫苗候選基因的選擇1.1乙型腦炎病毒的基因結(jié)構JEV為單股正鏈RNA病每.全長約llkb,整個基因組由5,褊非編碼區(qū)(5,NCR)和1個幾平跨越整個基因組的單一開放閱讀框(ORF)和3'端非編碼區(qū)(3'-NCR)構成。編碼3個結(jié)構蛋白：C蛋白(衣殼蛋白)、PrM/M(膜前體金白/膜蛋白)和E賀白(世膜糟蛋白)以及7個非結(jié)構蛋白(NS1,NS2a,NS2b.NS3、NS4a.NS4b、NS5),各基因在基因組上的排列順序為：5'-CPrM/ME

5、NSlNS2aNS2bNS3NS4aNS4bNS53'.1.2乙型腦炎病毒核酸疫苗候選基因的選擇PrM蛋白姑未成熟病嵌體的一部分，在病嵌感染后期.它在被水解為M蛋白后而發(fā)育為成熟的病毒體。PrM蛋白存在感染細胞內(nèi)未成熟的病柢粒F中，在JEV感染的最后階段，水解成M蛋白.然而.在有些情況下.PrM的弈切叮能不完全,結(jié)果使PrM蛋白成為毒粒上能產(chǎn)生中和抗體的附加帕位,免疫含PrM/E的胞外顆?？僧a(chǎn)生中和抗體和保護性免疫.表達PrM蛋白或E蛋白的更組痕苗病催免疫小鼠和豬.可有效保護JEV的攻擊叫而且，JEV糟索門容易分泌和發(fā)達在細胞&而,這些是大作為有效免疫原的爪要決定因素。Mf|是

6、完全疏水的，簽與病母黃膜的構成.是病毒索膜主要結(jié)構成分之一，被包埋在賣膜的脂質(zhì)雙層中，它可能與插入脂雙層的E賀|*1完全疏水性C端相互作用，對維持E強白空間結(jié)構是必需的。Takegami等(1982)府共生物學功能進行r研究.認為M蛋白參與病毒的感染過程，PrM賀白足狀/誘發(fā)保護性免疫的戒要:協(xié)同成分,M/白能白生具有輕度中和作用的抗體.E蛋白全長由500個找破酸度基組成,分子質(zhì)虻約為53kD,富含Gly和Ala.Pro含量低，是破水性的.僅有一的糖基化位成在多數(shù)黃病嵌中JI有保守性.E蚩白含有病柩血萩泰和中和抗原決定箴，為黃病毒屬中的主要結(jié)構蛋白，是主要抗原成分.在i秀導機體產(chǎn)生有效的中和抗

7、體及保護性免疫中起敢要:作用.此外，E蚩白還與細胞膜受體相結(jié)合并與細胞膜融合而使病茬進入細胞.與病盤的吸附、穿入、致病性、組織嗜性、血畿反應、血清特異性和i秀導宿主的免疫應答等作用緊密相關ElKfl上相關位點的敏基酸變異.對JEV神經(jīng)母力及神經(jīng)侵鑒力有杵政要的影響。另外.JEVE蛋白還是引起冶主機體免疫及產(chǎn)生中和抗體的左要:抗原蛋白，由它形成表面抗原決定族,具有血凝活性和中和活性,能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，保護機體免受病毒攻擊.NS1蛋白是一種分泌型糟卷自.其分子質(zhì)吠為40kD,但由于在130位和207位存任N述接糖鏈.在感染細胞內(nèi)共:實際分子質(zhì)械為46kD左右.Mason等(1989)用E.c

8、oli來表達JEV抗原.證實在JEV感染的細胞中NS1蛋白以NS1和NSr2種形式存在.NS1和NSr在N末端具有相同的序列，NS1'在C末端還存在一段高度磴水的氛基酸序列，該段序列由基因組的NS2aU因編碼。NS】分子質(zhì)址約40kI),NS1*為58kD.由于NS1和NSH存在相同的N末端.故有相同的抗原性和生化特性，Nsr是主要的病毒產(chǎn)物，而不是在NS1產(chǎn)生過程中短暫存在的.在細胞培養(yǎng)液中NS1的ht大，可能是因為NS1比Nsr更有效地分泌到細胞外城Nsr在釋放過程中被降解為NSl.NS1蛋白特異性免疫探針與JEV感染細胞結(jié)合的結(jié)果說明，其分泌F感染細胞表面.另外，感染細胞還分泌可

9、溶性的NS】在NSl'C末端存在一段高度疏水的氛基酸序列，使NSI蛋白存在于細胞表面成為可能。Mason等在TritionX100存在的情況卜通過超速離心發(fā)現(xiàn)，NS1蛋白的沉降特征發(fā)生r改變，脫明NS1蛋白與膜相互作用結(jié)合在起.NS1在感染細胞的表面表達，細胞外分泌，不但在黃病毒的感染過程中可引起免疫性反應，而fl這種抗體在實驗動物體內(nèi)可起保護作用，這個保護作用依翰抗體的Fc部分，因為NS1季一性抗體通過補體依賴途徑殺傷感染的祀細胞(功NS1蛋白不組成荏粒，沒有中和活性和血凝抑制活性，但它JlYl4溶性補體結(jié)合活性，它可在不出現(xiàn)中和抗體的情況下誘生保護力,IL不產(chǎn)生抗體依賴性增強，加之

10、NS1的基因和表型具有高度同源性.有學者認為黃病勝NS1作為亞單位疫苗比滅活疫苗有優(yōu)勢叫2乙型腦炎病毒核酸疫苗研究進展2.1有關PrM、E基因核酸疫苗的研究AshokMS等151構建了編碼JEVE蛋白的DNA質(zhì)粒PCMXENV,經(jīng)鼻腔和肌肉途徑接種瑞士小鼠后，進行JEV腦內(nèi)接種攻擊試驗.結(jié)果顯示：該歌組質(zhì)粒對攻擊感染有一定的保護作用，免疫鼠血清中未能檢出抗JEV抗體，但產(chǎn)生了低水平的JEV特異性T細胞增殖。后來Jt乂將E蛋白的全長廟因序列和釵基端398個釵基嵌的基因序列分別克隆到表達載體發(fā)現(xiàn)：只有后者能產(chǎn)生分泌性表達»而且與其他DNA疫苗比較.后者可誘導Thl和Th2的增殖反應，在小

11、鼠能產(chǎn)生最高水平(71%)的抗攻擊保護.E基因全長DNA疫苗在小鼠體內(nèi)只能誘導低水平的中和抗體，認為保護作用可能上要與細胞免疫有關兇。Konishi等(1998)以pcDNA3.1為我體構建了含JEV中山株前膜信號肽(S)、PrM、E基因cDNA的壅組成粒PCDNA3.1JEME,將此質(zhì)粒IOOpg肌注小鼠，間隔2周再注lOOpg,2-3周之后采血溯定中和抗體，滴度為1:640.用P3株】01%腹腔攻擊，100%(5/5)存活，若用10pg成粒，中和抗體為1:320,存活率100%,免疫持久性至少為6個月。Chang等構件了表達PrM和E蛋白的質(zhì)粒DNA,由巨細胞病催正即早期基因啟動子控制，將

12、該質(zhì)粒導入COS1細胞，COS1細胞向培芥液中分泌細胞外病嵌樣顆粒，用這種DNA疫苗免疫雌性小鼠，產(chǎn)生中和抗體滴度在1：20到1：160之間，用5000PEU強卷株SA14腹腔注射攻毒，對買子代的保護率在40%到100%之間.免疫7周齡的成年小隊，3d后用5000PUF強曜株SA14攻毒，小鼠得到完全保護.Chang等的研究表明，所朽接種1次JEVDNA疫苗的小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生JEV特異性的抗體，R至少維持18個月,3周靛小鼠免疫后100%血清抗體陽轉(zhuǎn).中和抗體效價達】：201：160.狹得100%的動物保護.Chcn(1999)等利用M核發(fā)達栽體分別取組構建了JKVEJg白以及其他蛋白旌因片段，

13、通過比較上述收組質(zhì)粒在分別免疫動物后所產(chǎn)生的中和抗體效價與保護性免疫效果.發(fā)現(xiàn)含JEVE蛋白編碼基因的成粒DNA所致的中和抗體效價以及保護性免疫結(jié)果明顯優(yōu)共:他策白基因片段，用編碼JEVE蛋白的質(zhì)粒免疫小隊.與滅活疫苗比較，結(jié)果產(chǎn)生了更持久和更強的JEVE蛋白特異性抗體，且對JEV的致死攻擊R有高度保護作用.Konishi等四構建了2株基FPrM和E基因的DNA疫苗，并進行了免疫試駛.結(jié)果表明以100-450pgMtt間隔3周對豬進行二次免疫.免疫后第1周即產(chǎn)生HI抗體和中和抗體，井可維持245d的高滴度H1抗體水平.試驗還證明當以PrM/E質(zhì)粒DNA疫苗免疫小鼠后，取JI：脾細胞在體外刺激后

14、可檢測出CTL活性,而血清中未能檢測出中和抗體.但當小鼠接受JEV攻擊后，由于DNA免疫小取存在泥憶性B細胞和T輔助細胞,中和抗體的滴度迅速上升，并足以保護小鼠抵抗JEV的攻擊。他們認為這也許站免疫動物伏得保護的機制。Konishi等還發(fā)現(xiàn)含病版PrM與E蛋白編碼基因的爪組質(zhì)粒DNA在免疫動物后不僅i秀導出特耳性的CTL細胞參勺細胞免疫反應，而H可產(chǎn)生特異性B細胞參與體液免疫反應，進步研究還發(fā)現(xiàn)在免疫動物體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體的效價與所維持時間都明顯高于普通滅活疫苗的免疫結(jié)果，說明了DNA疫苗在預防JEV感染方面的試凝研究的可行性。據(jù)報道.基因槍免疫所需的DNA魅僅為肌注免疫所需址的1/1001/

15、200,就可獲得相近的抗體反應.Chen等的研究結(jié)果不但證實這一結(jié)論，而ILi人為不同的DNA免疫途徑產(chǎn)生的抗體亞型和親和力也不同.KaurR等回用合成分泌型或膜錨定型JEV的PrM和E蛋白的質(zhì)粒經(jīng)肌注或堆因槍接種小隊發(fā)現(xiàn):E蛋白的2種發(fā)達類型均能誘導較高的中和抗體滴度，而肌注較基因槍方法能i秀導更高水平的抗E抗體反應.認為肌注可能誘導以Thl為主的免疫反應，而基因槍接韓誘導Th2為主的免疫反應，在小恥而JEV腦內(nèi)接種的攻擊感染可提供60%的保護.Mohammad"0'等以小鼠作為模型，用抗原提呈細胞和巨細胞病也對JEVE炭自的麥達進行免疫調(diào)并采用免疫熒光法和Western印

16、跡檢測，結(jié)果抗原提呈細胞和巨細胞病能都能刺激小隊產(chǎn)生的抗體滴度增加，但是巨細胞病春刺激小鼠產(chǎn)生的抗體滴度更高。更誼要的是.由原提呈細胞啟動執(zhí)導的免疫反應偏向Thl型.prM幕因和E基因，分別在N15和N154的位置有一個潛在的N-械幕化位點，YuZhang等分別在prM基因和E基因的N-連接摘基化位點進行突變處理來構建DNA疫苗.該DNA疫苗免疫小鼠.的結(jié)果表明，E筆因N154精基化位點突變的DNA疫苗能使小鼠分泌1L4的水乎升高和產(chǎn)生更大滴度IgG.獲得完全保護.因此，EUfflN154概基化位點突變能增強誘導體液免疫應答，表明這種突變可作為針對乙腦潛在的DNA疫苗。2.2有關NS1基因核酸

17、疫苗的研究Lin等用編碼JEVPrM/E.NS1輯因的成粒DNA皮下接種小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn).編碼PrM/E蛋白的成粒DNA免疫小取攻擊強毒后有70%的小鼠受保護.而用編碼NS1的質(zhì)粒免疫小虬強卷攻擊后可獲得90%的保護。NS1質(zhì)粒免疫的小隊雖未檢測到中和抗體,但對乙粘病毒感染的細胞在補體參與條件卜有很強的溶解細胞作用。用C末遂幻H60個氛基酸的NS1核小酸序列(NS!*)的質(zhì)粒免疫小取卻經(jīng)不住強卷的攻擊.生化分析&明，NS1很容易分泌大St的同烈二聚體并表達于細胞發(fā)面，NSP卻不能，且NS2a會F調(diào)NS1基因疫苗的效果。不管站用抗NS1單抗被動免疫，或者是用NS1蛋自主動免疫，均證明黃病柩

18、NS1具有激發(fā)保護性免疫的友位，證實NS1足夠引發(fā)保護性免疫。然而.辛期件名學者以痕苗病毒、Sindbis病毒和桿狀病毒等R組病毒為載體的研究表明，JEV的NS1只能對宿主產(chǎn)生低水平的保護作用.這種差異可能由于使用不同的表達系統(tǒng)和不同的NS1序列.也有可能是在病是我體的存在下，NS1只能作為很弱的免疫原或多余的NS2A的些序列可能是導致NS1不能產(chǎn)生右效免疫保護的原因.這些結(jié)果與以往對雅華熱的研究結(jié)果相符，取組痘苗病魅含甘革熱NS1可完全保護登革熱病催的攻擊但在NS1加t15%的NS2a序列后，就不能獲得相似結(jié)果：.使用核酸疫苗進行免疫既能消除在活疫苗制備中存在的不必要抗原所致的免疫應答，又不

19、必顧虐感染因子所帶來的諸多問禽.而且.能曬誘導廣泛的體液與細胞免疫應答.有助于產(chǎn)生高水平保護性免疫叩。但核酸疫苗效力的好壞也取決F許多因素，如抗原自芽的特性、免疫途徑、是否使用佐劑或使用佐制的矣型等.所以現(xiàn)在人們對影響核酸疫苗效力的各種因素展開r研究心.如果核酸疫苗潛在的安全性和接種方法能夠得到解決和改進，將具有很大的開發(fā)潛力和應用前景。參考文獻II)湯嬉元.王機.馬萍.等.乙型腦炎病毒嵐州分高株E某因原核發(fā)達及其免疫原性的研究J1.俗牧件醫(yī)學報，2012.43(8):13301336.(21TangDY.LiuJ,WangF,etal.Isolationandmolecularcharact

20、erizationofJapaneseencephalitisvirusGZstrainfrompiglets,China|J|.AfricanJournalofMicrobiologyResearch,2013,7(2)：89-97.131王成，湯德元，李春燕.等.日本乙型M炎病毒NSI基因及共疫苗的研究進JKUI.中國動物保健，2012.14(12)>16-19.141李春燕，瀝德元，徐健，等.乙型腦炎的發(fā)制機理及冷力致祥機理的研充進展IJ1.中國件指雜志.2008(4),41-43,53.5AshokMS.RangarajanPN.mmunizationwithplasmidDNA

21、encodingtheenvelopeglycoproteinofJapaneseEncephalitisvirusconferssignificantprotectionagainstintracerebralviralchallengewithoutinducingdetectableantiviralantibodies|Jj.Vaccine,1999,Aug20(18(1-2):6875.|6AshokMS.RangarajanPN.ProtectiveefficacyofaplasmidDNAencodingJapaneseEncephalitisvimsenvelopeprotei

22、nfusedtotissueplasminogenactivatorsignalsequences：studiesinamurineintracerebralviruschallengemodc!(JVaccine,200220(1112)s!5631570.7ChangGJ.HuntAR,DavisB.AsingleintramuscularinjectionofrecombinantplasmidDNAinducesprotectiveimmunityandpreventsJapaneseencephalitisinmiceJ.Virol.2000.74(9),4244-4252.(8|KonoshiE,YamaokaM,Kuranc1.etal.Jap