流式細(xì)胞儀原理

1、流式細(xì)胞儀原理（一）流式細(xì)胞儀概念流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry ，F(xiàn)CM）是一種對(duì)處在液流中的細(xì)胞或其它生物微粒（如細(xì)菌）逐個(gè)進(jìn)行多參數(shù)的快速定量分析和分選的技術(shù)。簡(jiǎn)言之，流式細(xì)胞儀是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀，是在單個(gè)細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)，如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等進(jìn)行快速測(cè)量并可分類收集的高技術(shù)，F(xiàn)CM以其快速、靈活、大量、靈敏和定量的特色，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐各個(gè)方面，包括細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢驗(yàn)學(xué)等，在各學(xué)科領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。（二）流式細(xì)胞儀分類FCM儀器分為二

2、大類。一類為臺(tái)式機(jī)，如B-D公司的FACSCalibur。其特點(diǎn)為：儀器的光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)便，易學(xué)易掌握。B-D公司的臨床型流式細(xì)胞儀FACScan也是最早獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)可用于臨床診斷的儀器。FACSCalibur: 世界上唯一的自動(dòng)化四色臺(tái)式分析和分選機(jī)。提供自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、分選濃縮系統(tǒng)、自動(dòng)免疫樣本制備儀和DNA樣本制備儀等選配功能。常規(guī)應(yīng)用包括免疫表型分析、DNA分析、多色分析等，可廣泛應(yīng)用于臨床和科研。另一類為大型機(jī)，如B-D公司的FACS Vantage SE其特點(diǎn)為可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來(lái)，并且可將單個(gè)或指定個(gè)數(shù)的細(xì)胞分選到特定的培養(yǎng)孔或板上，同時(shí)可選

3、配多種波長(zhǎng)和類型的激光器，適用于更廣泛更靈活的科學(xué)研究應(yīng)用。FACSVantage：具有最佳分析靈活性和高速度分選功能，可通過(guò)Autosort進(jìn)行自動(dòng)化分選。除常規(guī)應(yīng)用外，還可進(jìn)行高分辨率的染色體分析。第一部分 流式細(xì)胞儀工作原理（一）原理待測(cè)樣本的細(xì)胞懸液，在鞘液的包圍和約束下，細(xì)胞排成單列高速由流動(dòng)室噴嘴噴出，形成細(xì)胞液柱。當(dāng)液柱通過(guò)檢測(cè)區(qū)，在入射的激光束照射下產(chǎn)生前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC），它們分別反映細(xì)胞大小和顆粒度，根據(jù)這些特性可以將細(xì)胞分類。經(jīng)一種或幾種特殊熒光標(biāo)記的樣本，在激光束的激發(fā)下所產(chǎn)生的特定熒光，可被光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)并輸送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析，得到細(xì)胞相應(yīng)的各種特

4、性。（二）流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞特性細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面、胞漿、核特異性抗原粒度細(xì)胞活性DNA、RNA含量胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子、pH值、膜電位酶活性第二部分 流式細(xì)胞儀構(gòu)造FCM的結(jié)構(gòu)一般可分為五部分：(1)流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng); (2)激光光源及光束成形系統(tǒng); (3)光學(xué)系統(tǒng); (4)信號(hào)檢測(cè)與存貯、顯示、分析系統(tǒng)，(5)細(xì)胞分選系統(tǒng)。見圖一圖一：BD公司FACSCaliburFDA通過(guò)的世界唯一全自動(dòng)四色臺(tái)式分選機(jī)注：High Performance Side-Scatter and Fluoresence Photomultiplier:高性能側(cè)向角散射光及

5、熒光光電倍增管Argon Laser:氬離子激光Beam-Shaping Optics:光束成形鏡Red Diode Laser:紅色二極管激光Low-Angle, Light-Scatter Detector:前向角散射光檢測(cè)器（彩圖）(一)、流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室(Flow Chamber或 Flow Cell)是儀器核心部件，被測(cè)樣品在此與激光相交。流動(dòng)室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個(gè)孔徑為430×180um的長(zhǎng)方形孔，供細(xì)胞單個(gè)流過(guò)，檢測(cè)區(qū)在該孔的中心，這種流動(dòng)室的光學(xué)特性良好，流速較慢,因而細(xì)胞受照時(shí)間長(zhǎng)，可收集的細(xì)胞信號(hào)光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的

6、檢測(cè)靈敏度和測(cè)量精度。流動(dòng)室內(nèi)充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。鞘液流是一種穩(wěn)定流動(dòng)，操作人員無(wú)法隨意改變其流動(dòng)的速度,樣品流在鞘流的環(huán)包下形成流體動(dòng)力學(xué)聚焦，使樣品流不會(huì)脫離液流的軸線方向，并且保證每個(gè)細(xì)胞通過(guò)激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。細(xì)胞流和鞘液流的驅(qū)動(dòng)一般采用加正壓的方法，流速與壓力的關(guān)系服從 Bernoulli方程，即P = (½) pv2 (忽略高度的變化)，可見只要壓力恒定，就可得到恒定的鞘液流流速, 從而可確保每個(gè)細(xì)胞流經(jīng)激光照射區(qū)的速度不變。圖二：FACSCalibur液流系統(tǒng) 低速(Low) 高速(Hi)圖三：流動(dòng)池中，不同流速下的細(xì)胞流

7、動(dòng)情況從圖二可以知道,真空泵產(chǎn)生壓縮空氣,通過(guò)鞘流壓力調(diào)節(jié)器加在鞘液上一恒定的壓力(壓力的大小由工廠設(shè)定),這樣鞘液以勻速運(yùn)動(dòng)流過(guò)流動(dòng)室,在整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)行中流速是不變的。而改變樣本的進(jìn)樣速率開關(guān),可提高采樣分析的速度,但是,這并不是提高樣本流的速度,而是改變了細(xì)胞間的距離,從圖三可以看出,樣本流變寬,細(xì)胞間距離縮短,這樣單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)就增加。 這種情況應(yīng)在具體實(shí)驗(yàn)中引起注意,由于激光焦點(diǎn)處能量分布為正態(tài)分布(見圖四),中心處能量最高,因此當(dāng)樣本速率選擇高速(Hi)時(shí),處在樣本流不同位置的細(xì)胞或顆粒,受激光光照射的能量不一樣,從而被激發(fā)出的熒光強(qiáng)度也不相同，這就會(huì)造成測(cè)量誤差,當(dāng)

8、在檢測(cè)分辨率要求高的實(shí)驗(yàn)時(shí)(如 DNA analysis)應(yīng)選用低速(Low)。（二）、激光光源與光束成形系統(tǒng)目前臺(tái)式機(jī)FCM，大多采用氬離子氣體激光器，BD公司的FACSCallibur可增配小功率半導(dǎo)體激光器（波長(zhǎng)635nm)從而拓寬了其染料的應(yīng)用范圍。 激光 (Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一種相干光源，它能提供單波長(zhǎng)、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源，這是因?yàn)橛捎诩?xì)胞的快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)光照區(qū)的時(shí)間僅為微秒左右，每個(gè)細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被

9、照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。 激光光束在到達(dá)流動(dòng)室前，先經(jīng)過(guò)透鏡，將其聚焦，形成幾何尺寸約為22 × 66 um，即短軸稍大于細(xì)胞的直徑的光斑(見圖四)。這種橢園形光斑激光能量分布屬正態(tài)分布;為保證樣品中細(xì)胞是一個(gè)一個(gè)分別受到光照并且受照強(qiáng)度十分一致,須將樣本流與激光束正交且相交于激光能量分布峰值處,臺(tái)式機(jī)FCM的光路調(diào)節(jié)對(duì)用戶是封閉的，即安裝時(shí)由工程師調(diào)試完畢后, 無(wú)需用戶作任何調(diào)節(jié), 所以用戶操作十分方便。圖四：激光光斑示意圖（三）、光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)送入到不同的電子探測(cè)器。圖五

10、：FACSCalibur的光學(xué)系統(tǒng)在FCM的光學(xué)系統(tǒng)中主要光學(xué)原件是濾光片( Filter )，主要分為三類：長(zhǎng)通濾片（Long-Pass Filter，LP )、短通濾片( Short-Pass Filter,SP) 及帶通濾片( Band-Pass Filter, BP )。(1)長(zhǎng)通濾片：長(zhǎng)通濾片使特定波長(zhǎng)以上的光通過(guò)，特定波長(zhǎng)以下的不通過(guò)。如LP500濾片，將允許500 nm以上的光通過(guò)，而500 nm以下的光吸收或返回。圖六：長(zhǎng)通濾片(2)短通濾片：與長(zhǎng)通濾片相反，特定波長(zhǎng)以下的光通過(guò)，特定波長(zhǎng)以上的光吸收或返回。圖七：短通濾片(3)帶通濾片：帶通濾片可允許相當(dāng)窄的一波長(zhǎng)范圍內(nèi)光通過(guò)

11、，一般濾片上有兩個(gè)數(shù)，一個(gè)為允許通過(guò)波長(zhǎng)的中心值，另一為允許通過(guò)光波段的范圍。如BP 500 / 50表示其允許通過(guò)波長(zhǎng)范圍為475nm525nm。圖八：帶通濾片（四）、信號(hào)檢測(cè)與分析當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物，通過(guò)激光照射區(qū)時(shí)，受激光激發(fā)，產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào), 圖九是以激發(fā)光光源波長(zhǎng)488nm為例的示意圖：圖九：熒光信號(hào)的產(chǎn)生注：FITC為綠色熒光PE為橙紅色熒光PerCP為紅色熒光 1. 散射光信號(hào)：散射光分為前向角散射( FSC ，F(xiàn)orward Scatter ) 和側(cè)向角散射(SSC，Side

12、Scatter)，散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。(1) 前向角散射：前向角散射與被測(cè)細(xì)胞的大小有關(guān)，確切說(shuō)與細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)，通常在FCM應(yīng)用中，選取FSC作閾值，來(lái)排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對(duì)被測(cè)細(xì)胞的干擾。(2) 側(cè)向角散射：側(cè)向角散射是指與激光束正交900方向的散射光信號(hào)，側(cè)向散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。圖十：散射光信號(hào)注：Laser-激光FALS Sensor-前向角散射光檢測(cè)器90LS Sensor-側(cè)向角散射光檢測(cè)器上述兩種信號(hào)都是來(lái)自于激光原

13、光束，其波長(zhǎng)與激光相同，目前采用這兩個(gè)參數(shù)組合，可區(qū)分裂解紅細(xì)胞處理后外周血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞三個(gè)細(xì)胞群體，或在未進(jìn)行裂解紅細(xì)胞處理的全血樣品中找出血小板和紅細(xì)胞等細(xì)胞群體。圖十一：外周全血細(xì)胞散射光點(diǎn)圖（裂解紅細(xì)胞處理）2. 熒光信號(hào)：當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時(shí)，一般會(huì)產(chǎn)生兩種熒光信號(hào)。一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號(hào)，稱為細(xì)胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過(guò)特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)這類熒光信號(hào)的檢測(cè)和定量分析就能了解所研究細(xì)胞參數(shù)的存在與定量。圖十二：熒光信號(hào)注：Laser-激光FALS Sensor-前向角散射光檢測(cè)器Fluorescence

14、Detector-熒光檢測(cè)器熒光染料可選用的熒光素有多種多樣，由于它們分子結(jié)構(gòu)不同，其熒光激發(fā)譜與發(fā)射譜也各異。選擇染料或單抗所標(biāo)記的熒光素必須考慮儀器所配置光源的波長(zhǎng)，目前臺(tái)式機(jī)FCM常配置的激光器為488nm通?？捎萌玖嫌蠵I(propidium iodide)、PE(phycoreythrin)、FITC(fluorescein isothiocyanate)、PerCP(peridinin chlorophyll protein)、CY5等。另外，B-D公司推出的FACSCalibur還可配置半導(dǎo)體激光器（波長(zhǎng)為635nm），可激發(fā)APC、To-Pro3等染料，更拓寬了流式細(xì)胞儀的應(yīng)用

15、范圍。 （1）熒光信號(hào)線性測(cè)量和對(duì)數(shù)測(cè)量：熒光信號(hào)的線性測(cè)量與對(duì)數(shù)測(cè)量主要由電子線路完成。從圖一可知，當(dāng)攜帶熒光素的細(xì)胞與激光正交時(shí)，受激發(fā)出熒光，經(jīng)過(guò)濾光片分離不同波長(zhǎng)的光信號(hào)分別到達(dá)不同的光電倍增管(PMT)，PMT將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。有些廠家不采用光電倍增管(PMT)，而采用線性放大光電轉(zhuǎn)換器，其優(yōu)點(diǎn)是降低成本提高線性度，但其最大缺點(diǎn)是響應(yīng)速度慢，造成儀器分析細(xì)胞速度降低，最高不可能超過(guò)3300個(gè)/秒，如果樣本流速超過(guò)此速度會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)損失，因此高檔機(jī)器不采用此種方法。電信號(hào)輸入到放大器放大，放大器分兩類：線性放大和對(duì)數(shù)放大。線性放大器，即放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，細(xì)胞DNA含量、R

16、NA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測(cè)量一般選用線性放大測(cè)量。但在細(xì)胞膜表面抗原等的熒光檢測(cè)時(shí)通常使用對(duì)數(shù)放大器，如果原來(lái)輸出是1，當(dāng)輸入增大到原來(lái)十倍時(shí)，輸出為2；當(dāng)輸入增大到原來(lái)一百倍時(shí)輸出為3等。在免疫學(xué)樣品中，細(xì)胞膜表面抗原的分布有時(shí)要相差幾十倍甚至幾萬(wàn)倍。如用線性放大器，將無(wú)法在一張圖上清晰地將細(xì)胞陽(yáng)性群、陰性群同時(shí)顯示出來(lái)。（2）熒光信號(hào)的面積和寬度所謂熒光信號(hào)的面積是采用對(duì)熒光光通量進(jìn)行積分測(cè)量，一般對(duì)DNA倍體測(cè)量時(shí)采用面積（如FL2-A），這是因?yàn)闊晒饷}沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映DNA的含量，當(dāng)形狀差異較大，而DNA含量相等的二個(gè)細(xì)胞，得到的熒光脈沖高度是不等的，經(jīng)過(guò)對(duì)熒光信

17、號(hào)積分后，所得到的信號(hào)值就相等。圖十三：熒光信號(hào)的面積和寬度左側(cè)為G1期雙聯(lián)體細(xì)胞，右側(cè)為G2/M期單細(xì)胞寬度（如FL2-W）常用來(lái)區(qū)分雙聯(lián)體細(xì)胞(B-D公司的專利技術(shù))，由于DNA樣本極容易聚集，當(dāng)兩個(gè)G1期細(xì)胞粘連在一起時(shí)，其測(cè)量到的DNA熒光信號(hào)（FL2-A）與G2期細(xì)胞相等，這樣得到的測(cè)量數(shù)據(jù)G2期細(xì)胞比例會(huì)增高，影響測(cè)量準(zhǔn)確性，圖九是用小牛胸腺細(xì)胞測(cè)量得到的DNA分布曲線，圖十四b中G2形成了小峰，其中，有一部分是因?yàn)镚1期細(xì)胞粘連在一起，形成假G2期細(xì)胞，而圖十四a是通過(guò)設(shè)“門”（gate），將雙聯(lián)體細(xì)胞排除，其原理是雙聯(lián)體細(xì)胞所得到的熒光寬度信號(hào)（FL2-W）要比單個(gè)G2期細(xì)胞大

18、，因此設(shè)“門”后才能得到真正的DNA含量分布曲線和細(xì)胞周期（圖十四c）。圖十四：DDM檢查abc （3）光譜重疊的校正當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種熒光素如（PE和FITC）受激光激發(fā)而發(fā)射出兩種不同波長(zhǎng)的熒光時(shí)，理論上，可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測(cè)器檢測(cè)到，而不會(huì)檢測(cè)到另一種熒光。但由于目前所使用的各種熒染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊，從圖五上圖中可以看出，陰影為探測(cè)器檢測(cè)光譜的范圍，F(xiàn)ITC探測(cè)器會(huì)探測(cè)到少量的PE光譜，而PE探測(cè)器則檢測(cè)到較多的FITC光譜?？朔@種誤差的最有效方法是使用熒光補(bǔ)償電路，利用標(biāo)準(zhǔn)已知樣品或熒光小珠，可合理設(shè)置熒光信號(hào)的

19、補(bǔ)償值。圖十五給出補(bǔ)償前后模型圖。FITC(BF 530/30)PE(BF 575/26)（波長(zhǎng)nm）圖十五：補(bǔ)償模型圖注：FITC為綠色PE為橙紅色（五）、 FCM測(cè)量數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析 目前FCM數(shù)據(jù)的存貯的方式均采用列表排隊(duì)(List Mode)方式。因?yàn)槟壳癋CM所采用的都是多參數(shù)指標(biāo)，熒光參數(shù)標(biāo)記物已可多達(dá)4個(gè)，采用List Mode方式可大量地節(jié)約內(nèi)存和磁盤容量。當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被檢測(cè)4個(gè)測(cè)量參數(shù)，那么獲取一萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，所占容量為4×10000個(gè)(字或雙字)。同時(shí)當(dāng)只檢測(cè)細(xì)胞一個(gè)參數(shù)時(shí)（如DNA)，可靈活的關(guān)閉其他三個(gè)參數(shù)，節(jié)省四分之三的空間。 數(shù)據(jù)文件雖然有易于加工處理分析

20、的優(yōu)點(diǎn)，但缺乏直觀性，數(shù)據(jù)的顯示通常有一維直方圖、二維點(diǎn)圖、等高線圖、密度圖等幾種。1、單參數(shù)直方圖：細(xì)胞每一個(gè)單參數(shù)的測(cè)量數(shù)據(jù)可整理成統(tǒng)計(jì)分布，以直方圖(distribution histogram)來(lái)顯示。在圖中，橫坐標(biāo)表示熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度的值，其單位是道數(shù)，橫坐標(biāo)可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)的，縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)。圖十六：直方圖左上圖較低道數(shù)處為G1期細(xì)胞，道數(shù)為G1期細(xì)胞兩倍得是G2+M期細(xì)胞，二者之間是期細(xì)胞。右上圖100 101為陰性細(xì)胞，而101以上為陽(yáng)性細(xì)胞。2、雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示是用于表達(dá)來(lái)自同一細(xì)胞兩個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量間的關(guān)系, 常用的表示方法有二維點(diǎn)

21、圖(Dot Plot), 等高線圖(Contour Plot), 二維密度圖(Density Plot)。在二維圖中, X坐標(biāo)為該細(xì)胞一參數(shù)的相對(duì)含量, 而Y坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的含量, 從雙參數(shù)圖形中可以將各細(xì)胞亞群區(qū)分開, 同時(shí)可獲得細(xì)胞相關(guān)的重要信息, 左下圖為FSC和SSC組成的點(diǎn)圖, 從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細(xì)胞, 單核細(xì)胞及粒細(xì)胞區(qū)分開,從而可以分別分析各細(xì)胞亞群的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù), 右下圖是通過(guò)設(shè)“門”分析(Gating analysis)得到的FL1和 FL2點(diǎn)圖,設(shè)“門”可以是單參數(shù)設(shè)“門”,也可以是雙參數(shù)設(shè)“門”,通過(guò)設(shè)“門”可調(diào)出其他參數(shù)的相關(guān)信息,被調(diào)出的信息同樣也可以

22、是單參數(shù)和雙參數(shù)。圖十其就是通過(guò)細(xì)胞的前向和側(cè)向散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖,設(shè)“門”圈出標(biāo)本中的淋巴細(xì)胞群體,再調(diào)出免疫熒光的點(diǎn)圖。圖十七：點(diǎn)圖圖十八：等高線圖密度圖圖十九：流式細(xì)胞儀測(cè)定流程圖第三部分 流式細(xì)胞儀的主要技術(shù)指標(biāo)1. 熒光測(cè)量靈敏度靈敏度的高低是衡量?jī)x器檢測(cè)微弱熒光信號(hào)的重要指標(biāo)，一般以能檢測(cè)到單個(gè)微球上最少標(biāo)有FITC或PE熒光分子數(shù)目來(lái)表示,一般現(xiàn)在FCM均可達(dá)到<600個(gè)熒光分子。 2. 儀器的分辨率分辨率是衡量?jī)x器測(cè)量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)CV (Coefficient of Variation)值來(lái)表示： /µ×100% (是分布的標(biāo)準(zhǔn)誤差，

23、81; 是分布的平均值)如果一群含量完全相等樣本，用FCM來(lái)測(cè)量，理想的情況下，CV=0，用FCM測(cè)量曲線表示為圖二十a(chǎn)，但是在整個(gè)系統(tǒng)檢測(cè)中，會(huì)帶入許多誤差，其中樣本含量本身的誤差，樣本在流進(jìn)照射光的微量變化，再加上儀器本身的誤差等，實(shí)際得到的曲線為圖二十B。CV值越小則曲線分布越窄越集中，測(cè)量誤差就越小，一般的FCM在最佳狀態(tài)時(shí)CV值均<2%。AB圖二十CV值的計(jì)算除了采用以上的計(jì)算公式外,還可以用半高峰寬來(lái)計(jì)算，半高峰寬指在峰高一半的地方量得的峰寬，它與CV值有以下的關(guān)系：CV=半高峰寬/µ ×0.4236×100%上述公式是建立在正態(tài)分布的條件下，而

24、實(shí)際情況所得測(cè)量數(shù)據(jù)分布常常是非對(duì)稱圖形，故采用半高峰寬所計(jì)算得到的CV值要明顯小于前統(tǒng)計(jì)公式得到的CV，在實(shí)際情況中應(yīng)引起注意。3. 前向角散射光檢測(cè)靈敏度前向角散射光檢測(cè)靈敏度是指能夠檢測(cè)到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測(cè)量到0.2-0.5um左右。4. FCM分析速度分析速度以每秒可分析的細(xì)胞數(shù)來(lái)表示，當(dāng)細(xì)胞流過(guò)光束的速度超過(guò)FCM儀器響應(yīng)速度時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號(hào)就會(huì)被丟失，這段時(shí)間稱為儀器的死時(shí)間（Dead time）。死時(shí)間越短，我們就說(shuō)這臺(tái)儀器處理數(shù)據(jù)越快，一般可達(dá)到3000個(gè)/ 秒6000個(gè)/ 秒左右,FACSCalibur的分析速度為10000個(gè)/ 秒，大型機(jī)已達(dá)

25、到每秒幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。5. FCM分選指標(biāo) 分選指標(biāo)主要包括：分選速度、分選純度及分選收獲率。分選速度指每秒可提取所要細(xì)胞的個(gè)數(shù)，目前臺(tái)式帶分選的儀器只有BD公司生產(chǎn)的FACSCalibur產(chǎn)品，它的分選速度為300個(gè)/ 秒，BD大型機(jī)的流式細(xì)胞儀最高分選速度可達(dá)每秒上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。圖二十一：FACSCalibur的分選裝置注：To Collection-收集端To Waste-廢液端Catcher Tube in and out of stream-捕獲管Sample Injection-標(biāo)本進(jìn)樣針?lè)诌x純度指被分選出細(xì)胞所占的百分比，一般臺(tái)式機(jī)和大型機(jī)的分選純度均可達(dá)到99%左右。分選收獲率指被分出

26、細(xì)胞與原來(lái)溶液中該細(xì)胞的百分比。通常情況下，分選純度和收獲率是互相矛盾的，純度提高，收獲率降低，反之亦然。這是由于樣品在液流中并不是等距離一個(gè)接著一個(gè)有序地排著隊(duì)，而是隨機(jī)的，因此，一旦兩個(gè)不同細(xì)胞挨得很近時(shí)，在強(qiáng)調(diào)純度和收獲率不同條件下，儀器會(huì)作出取或舍的決定，因此，選擇不同模式要視具體實(shí)驗(yàn)要求而定。第四部分 流式細(xì)胞儀的簡(jiǎn)明操作步驟(一) FACSCalibur開機(jī)程序1 打開FACSCalibur主機(jī)開關(guān)。低流速按扭（LO）變綠，STANDBY按扭顯橙紅色。2 打開FACStation計(jì)算機(jī)開關(guān)。3 拉開液流抽屜，檢查鞘液桶，裝滿鞘液；檢查廢液桶，倒空并加入400ml漂白劑。4 將壓力開

27、關(guān)打開。5 排空管路氣泡。(二) 運(yùn)行FACSComp軟件，檢查儀器狀況，預(yù)設(shè)獲取條件FACSComp是BD公司自動(dòng)設(shè)置儀器的應(yīng)用軟件，它不僅可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)微球（CaliBRITE beads）來(lái)監(jiān)測(cè)儀器的工作狀態(tài)，還可以為人類外周血淋巴細(xì)胞免疫分群的應(yīng)用提供常規(guī)的、自動(dòng)化的儀器設(shè)置。流式細(xì)胞儀包含了一些靈敏的光電元件，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，最好每天用CaliBRITE beads來(lái)運(yùn)行FACSComp軟件。(三) 調(diào)出CELLQuest軟件，選擇Connect to Cytometer（1） 獲取標(biāo)本數(shù)據(jù)h 調(diào)出該試驗(yàn)的獲取窗口和試驗(yàn)獲取條件（Detector/Gain、Threshold、

28、Compensation）。h 為數(shù)據(jù)文件命名，并選擇數(shù)據(jù)文件的保存路徑。h 將流式細(xì)胞儀的功能鍵放在RUN位置，選定合適的流速，將含有單細(xì)胞懸液的樣品管放在支撐架上。h 在CELLQuest中點(diǎn)擊Aquire，儀器開始獲取數(shù)據(jù)，獲取數(shù)據(jù)結(jié)束后，儀器自動(dòng)保存文件到規(guī)定的目錄下。（2） 分析數(shù)據(jù)，打印報(bào)告h 調(diào)出該試驗(yàn)的報(bào)告窗口，在需要的數(shù)據(jù)圖中調(diào)出數(shù)據(jù)文件，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，得到相應(yīng)的數(shù)據(jù)分布圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果。h 調(diào)整報(bào)告格式和內(nèi)容，打印報(bào)告。(四) FACSCalibur關(guān)機(jī)程序1 清洗儀器管路。h 儀器置于RUN狀態(tài)，流速置于HI狀態(tài)，上樣管放3ml漂白劑（1:10稀釋），放在支撐架上，外管運(yùn)行

29、1分鐘，內(nèi)管運(yùn)行5分鐘。h 上樣管中換蒸餾水3ml，放在支撐架上，外管運(yùn)行1分鐘，內(nèi)管運(yùn)行5分鐘。h 儀器置于STANDBY狀態(tài)。2 上樣管內(nèi)加蒸餾水1ml，放在支撐架上，使加樣針浸泡在蒸餾水中。3 關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)流式細(xì)胞儀。第五部分 聯(lián)系BD公司（一） BD公司全球業(yè)務(wù)BD公司成立于1897年，總部設(shè)于美國(guó)的新澤西州。一百多年來(lái)，BD公司已發(fā)展成為機(jī)構(gòu)遍布全世界九十多個(gè)國(guó)家和地區(qū)、全球雇員近二萬(wàn)名的跨國(guó)公司，由最初發(fā)明世界上第一支塑料注射器的家族式企業(yè)發(fā)展為紐約交易所的上市公司，由產(chǎn)品單一發(fā)展成為業(yè)務(wù)涵蓋皮下注射、血液采集、微生物產(chǎn)品、流式細(xì)胞儀等諸多領(lǐng)域世界著名的醫(yī)療技術(shù)綜合公司，并且多次

30、榮幸地躋身于美國(guó)財(cái)富雜志五百?gòu)?qiáng)之列。在產(chǎn)品質(zhì)量方面，BD公司上市的所有產(chǎn)品均符合或高于同行業(yè)最高質(zhì)量要求并獲得ISO及CE質(zhì)量認(rèn)證。在1998年度公司全球銷售額為31億美元,用于研究開發(fā)新產(chǎn)品方面資金為2.18億美元。BD公司主要產(chǎn)品為：1、 BD生物科學(xué)系統(tǒng)（BD Biosciences，BDB） BDB是BD公司的高科技部分，致力于為生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供全方位強(qiáng)有力的支持 和幫助。BDB由以下世界著名的品牌組成： h BD Immunocytometry Systems（BDIS）h PharMingen （PMG）h Transduction Laboratories（TL）

31、h BD Labwareh BD Microbiology Systems （BDMS）h Biometric Imaging （BMI）h Clontech.。作為流式技術(shù)領(lǐng)域的先鋒企業(yè)，BDIS的使命是通過(guò)采用劃時(shí)代的技術(shù)為科學(xué)發(fā)展提供有診斷意義的解決方案和工具來(lái)擴(kuò)展我們的全球領(lǐng)導(dǎo)地位。目前BD品牌的流式細(xì)胞儀占全球同類產(chǎn)品總量的70%，占美國(guó)總量的80%,為腫瘤、白血病、愛滋病及其它免疫系統(tǒng)疾病的診斷作出了積極的貢獻(xiàn)。BD公司提供的流式細(xì)胞儀包括:· FACSCalibur: 世界上唯一的自動(dòng)化四色臺(tái)式分析和分選機(jī).。提供自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、分選濃縮系統(tǒng)、自動(dòng)免疫樣本制備儀和DNA樣

32、本制備儀等選配功能。常規(guī)應(yīng)用包括免疫表型分析、DNA分析、多色分析等，可廣泛應(yīng)用于臨床和科研。· FACSVantage：具有最佳分析靈活性和高速度分選功能，可通過(guò)Autosort進(jìn)行自動(dòng)化分選。除常規(guī)應(yīng)用外，還可進(jìn)行高分辨率的染色體分析。BD公司同時(shí)提供FDA批準(zhǔn)的體外診斷試劑和研究試劑。通過(guò)最優(yōu)良流式儀器、系統(tǒng)化軟件以及試劑的完美配合，BD公司力爭(zhēng)在科研和臨床，尤其在腫瘤和免疫系統(tǒng)疾病的控制（如HIV）方面竭盡所長(zhǎng)。BD公司始終遵循用戶至上，多方位滿足用戶的需要。幾年來(lái)BD公司不斷壯大，PharMingen、ClonTECH、Transduction Laboratories等高

33、科技公司的加盟無(wú)疑進(jìn)一步鞏固了BD公司在細(xì)胞生物和分子生物多學(xué)科領(lǐng)域的絕對(duì)領(lǐng)先地位。PMG建立在涵蓋免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、分子生物學(xué)/蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)、蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科多樣化的技術(shù)基礎(chǔ)上，提供3000多種具領(lǐng)先技術(shù)的高質(zhì)量產(chǎn)品，并繼續(xù)在細(xì)胞因子、信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、神經(jīng)科學(xué)等戰(zhàn)略性領(lǐng)域開發(fā)最新產(chǎn)品。具體分類如下：1. 抗體：· CD Antigens and Cell Surface Molecles· Adhesion Molecules · Cytokines, Chemokines and Cytokine Receptors·

34、No Azide/Low Endotoxin (NE/LE) Products for Functional Studies· Tumor Suppressor/Onco-Proteins· Signal Transduction Proteins· Cell Cycle Related Proteins· Apoptosis-Associated Proteins· Transcription Factors· Neuroscience· 2nd Step Reagents· Isotype Controls2.

35、 分子生物學(xué)產(chǎn)品：· BD BaculoGold Baculovirus Kits, Vectors and Expression Systems· GST/6x His Purification and Expression Systems· BD BioColors Green Fluorescent Protein Expression Vectors· BD RiboQuant Ribonuclease Protection Assay Systems· Luciferase Assay & Detection System&#

36、183; DNA Damage & Repair· Custom Molecular Biology Products3. 重組蛋白質(zhì)：· Signal Transduction Proteins· Cytokines And Chemokines· Cell Cycle ProteinsBD Transduction Laboratories 正是迅速發(fā)展的信號(hào)傳導(dǎo)研究領(lǐng)域提供高質(zhì)量的單克隆抗體。成立于1993年，1998年成為BD的有機(jī)組成，BD TL 已經(jīng)從最初的25個(gè)產(chǎn)品成長(zhǎng)為超過(guò)700個(gè)產(chǎn)品的專業(yè)公司。 產(chǎn)品包括：· Phos

37、phorylation & Dephosphorylation· Nitric Oxide· Calcium Signaling · Apoptosis· Cell Cycle· Gene Regulation · Cell Biology · Cancer Ressearch· Neuroscience · Immunology· GTPases & RegulatorsBD Labware作為BDB的一員，以多種多樣的高質(zhì)量試劑、培養(yǎng)基及其添加物、生物活性細(xì)胞外基質(zhì)等產(chǎn)品為防止和治愈疾病作出貢獻(xiàn)。BDL 產(chǎn)品包括：· BD Falcon: 實(shí)驗(yàn)室塑料用品的首選，包括細(xì)胞培養(yǎng)、液體操作及其他生命科學(xué)應(yīng)用；· BD BioCoat Cell Enviroments:全面提供細(xì)胞培養(yǎng)用品及細(xì)胞外生物活性基質(zhì)；· Collaborative Biomedical Products: 高質(zhì)量細(xì)胞培養(yǎng)試劑和培養(yǎng)基添加物的革新者和創(chuàng)造者。Clontech是功能性基因時(shí)代的科學(xué)家最忠實(shí)最有力的支持者。成立于1984年, CLONTECH 一直以迅猛的速度增長(zhǎng)CLONTECH的使命始終是