EMSA原理流程

1、凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）可以：（1）研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。實(shí)驗(yàn)方法原理凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合

2、物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白時(shí)，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核甘酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。MA試劑、試劑盒丫-32PATPT4多聚核甘酸激酶Nucleas

3、e-FreeWaterT4多聚核甘酸激酶緩沖液醋酸錢TE無水乙醇TBEbuffer重蒸水甲叉雙丙烯酰胺丙烯酰胺甘油過硫酸錢TEMED四甲基乙二胺)EMSAGel-Shift結(jié)合緩沖液澳酚藍(lán)儀器、耗材|水浴鍋PCR離心機(jī)電泳儀電泳槽國(guó)僉步驟|一、探針的標(biāo)記下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：(1)待標(biāo)記探針(1.75pmol/微升)：2微升。(1) T4PolynucleotideKinaseBuffer(10X):1微升。(2) Nuclease-FreeWater：5微升。(3) -32PATP(3000Ci/mmolat10mCi/ml):1微升。(7)按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后

4、，Vortex混勻，再加入T4PolynucleotideKinase,混勻。2 ,使用水浴或PCR儀，37c反應(yīng)10分鐘。3 .加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。4 ,再加入89微升TE,混勻。此時(shí)可以取少量探針用于檢測(cè)標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo)記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見，通常不必測(cè)定探針的標(biāo)記效率。5 .標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20Co二、探針的純化通常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時(shí)候，純化后的探針會(huì)改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如下步驟操作：1,

5、對(duì)于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸錢，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。2 .在-70C至-80C沉淀1小時(shí)，或在-20C沉淀過夜。3 .在4C,12000g-16000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。4 .在4C,12000g-16000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。5,加入100微升TE,完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20C。三、EMSA膠的配制備好倒膠的模具。可以使用常規(guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞摺Ｗ詈眠x擇可以灌制較薄膠的模具，以便于

6、干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大EMSA膠的模具。2,按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對(duì)結(jié)果影響不大)。重蒸水16.2毫升。(1) 39:1acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v):2毫升。(2) 80%甘油：625微升。(3) 10%過硫酸俊(ammoniumpersulfate):150微升。(4) TEMED:10微升3.按照上述次序加入各個(gè)溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡，并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制

7、膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。四、EMSA結(jié)合反應(yīng)如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)陰性對(duì)照反應(yīng)：(1) Nuclease-FreeWater:7微升。(2) EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X):2微升。(3) 細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：0微升。(4) 標(biāo)記好的探針：1微升。(5) 總體積：10微升。樣品反應(yīng)：(6) Nuclease-FreeWater：5微升。(7) EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X):2微升。(8) 細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。(9) 標(biāo)記好的探針：1微升。(10) 體積：10微升。探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng):(11) Nuclease-FreeWater：4微升

8、。(12) EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X):2微升。(13) 胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。(14) 標(biāo)記的探針：1微升。(15) 記好的探針：1微升。(16) 體積：10微升。突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：(17) Nuclease-FreeWater：4微升。(18) EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X):2微升。(19) 胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。(20) 標(biāo)記的突變探針：1微升。(21) 記好的探針：1微升。(22) 積：10微升Super-shift反應(yīng)：(23) Nuclease-FreeWater：4微升。(24) EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩

9、沖液(5X):2微升。(25) 胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。(26) 的蛋白特異抗體：1微升。(27) 記好的探針：1微升。(28) 體積：10微升。2 .按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25C)放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(20-25C)放置20分鐘。3 .加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（無色，10X）,混勻后立即上樣。注意：有些時(shí)候澳酚藍(lán)會(huì)影響蛋白和DNA的結(jié)合，建議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對(duì)于使用無色上樣緩

10、沖液在上樣時(shí)感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能觀察到藍(lán)顏色即可。五、電泳分析.用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X的EMSA上樣緩沖液（藍(lán)色），以觀察電壓是否正常進(jìn)行。1 .把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（藍(lán)色），用于觀察電泳進(jìn)行的情況。2 .按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30C,如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液中的藍(lán)

11、色染料澳酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。3 .剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊（注:通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板），把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后（大約不足1分鐘），輕輕揭起濾紙，這時(shí)EMSA膠會(huì)被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。4 .干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測(cè)，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測(cè)。其他一、常見問答1 .什么是凝膠遷移

12、或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)？凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA復(fù)合物或RNA復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白時(shí)，依據(jù)目的RNA結(jié)

13、合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核甘酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。2 .實(shí)驗(yàn)中需要用到什么試劑？凝膠遷移實(shí)驗(yàn)需要的結(jié)合蛋白，可來源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必須制備同位素標(biāo)記的DNA或RNA。一般，DNA核甘酸探針用32P和T4多核甘酸激酶來作末端標(biāo)記，同位素標(biāo)記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標(biāo)記的核甘酸在體外合成。Promega公司的Riboprobe/s

14、up系統(tǒng)（a,b）可用于同位素標(biāo)記的RNA的體外合成，DNA5'末端標(biāo)記系統(tǒng)，用于制備DNA探針，結(jié)合反應(yīng)所需的組分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（Tris-HCl或HEPES）、還原劑（DTT）、甘油、非特異的競(jìng)爭(zhēng)DNA（poly（dI:dC）dI:dC）,也可能含非離子去污劑。在結(jié)合蛋白和同位素標(biāo)記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影，或用PhosphorImage/sup分析。3 .凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)提供了什么試劑？Promega公司提供一種凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白，系統(tǒng)可作為這類實(shí)驗(yàn)的一種陽性對(duì)照。系統(tǒng)包

15、括目的寡核甘酸，對(duì)照DNA結(jié)合蛋白，結(jié)合緩沖液，用于寡核甘酸探針末端標(biāo)記所需的試劑。Core系統(tǒng)包括含重組AP2蛋白（AP2抽提液）的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核甘酸。AP2抽提液是從表達(dá)AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。另外，Core系統(tǒng)還含SP1同源寡核甘酸，凝膠遷移結(jié)合緩沖液，和能作20次對(duì)照實(shí)驗(yàn)的HeLa核抽提液。Complete系統(tǒng)含另外5個(gè)雙鏈寡核甘酸，分別是AP1、OCT1、CREB、NF-kB、TFIID結(jié)合位點(diǎn)的同源序列。這些寡核甘酸可以在末端標(biāo)記后用作特異性探針，或在競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中用作非特異性探針。4 .成功進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化哪些因素？凝膠遷移實(shí)驗(yàn)在理論上很簡(jiǎn)單也很快速

16、，但要成功地進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化一些參數(shù)，這主要受結(jié)合蛋白的來源和探針結(jié)合位點(diǎn)特點(diǎn)的影響。以下是需要優(yōu)化的因素：抽提液的制備（核酸酶和磷酸酶污染會(huì)使探針降解），結(jié)合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH,聚丙烯凝膠電泳的特點(diǎn)和電泳條件，保溫時(shí)間和溫度，載體蛋白，是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素）?？傊?，反應(yīng)總體積應(yīng)最?。?0科。為滿足一般要求，結(jié)合緩沖液含4%甘油，1mMMgCl2,0.5mMEDTA,0.5mMDTT,50mMNaCl,10mMTris-HCl（pH7.5）,0.05mg/mlpolydI:dC,或10mMHEPES（pH7.9）,

17、50mMKCl,1mMDTT,1mMEDTA,10%甘油，0.05mg/mlpolydI:dC可作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的起始。5 .在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素？目的DNA的長(zhǎng)度應(yīng)小于300bp,以有利于非結(jié)合探針和蛋白DNA復(fù)合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核甘酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應(yīng)用短的寡核甘酸片段（約為25bp）,這樣結(jié)合位點(diǎn)可和其他因子的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)別開。長(zhǎng)的限制性酶切片段可用于對(duì)推定的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)定位。隨后可用DNaseI印跡對(duì)蛋白結(jié)合的特異區(qū)域在DNA序列水平上作出分析。6 .用以下一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和HeLa細(xì)胞核

18、抽提物可形成哪些復(fù)合物：API,AP2,CREB,NFkB,Octi,Sp1,TFIID,TFIIB。當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物作為結(jié)合蛋白的來源時(shí)，每1個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和它相關(guān)的DNA同源序列結(jié)合形成特征型的結(jié)合形態(tài)。以下的文字描述了每一個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括識(shí)別的同源序列，因子的大小，特定的結(jié)合條件，以及和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成的復(fù)合物的數(shù)目。1 .細(xì)胞核蛋白提取：取約8.8X106個(gè)HSC-T6細(xì)胞，5mlPBS/PhosphataseInhobitors沖洗，收集細(xì)胞。加入0.25ml1xHypotonicbuffer重懸，冰浴15min；力口入25glNP-40,震蕩10s；14000Xg離心，30s,4C；收集上清即胞漿蛋白，于-70c保存。將沉淀重懸于50glLysisbuffer(含DTT和ProteaseInhibitorCocktail)中，震蕩10s；置于搖床中冰浴30min,150次/min;再次震蕩30s,14000Xg離心，10min,4C;取上清即為核蛋白，于-70c保存，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。2 .寡核甘酸探針的標(biāo)記和純化：rat:NF-kB:5'AGTTGAGGGGACTTTC