分子生物學(xué)復(fù)習(xí)

1、分子生物學(xué)與基因工程 復(fù)習(xí)中心法則 復(fù)制 1.半保留復(fù)制2.半不連續(xù)復(fù)制3.復(fù)制起點(diǎn)固定, 雙向, 等速?gòu)?fù)制. 4.復(fù)制中的信號(hào): (1)復(fù)制 起點(diǎn): 原核ori, 真核ARS (2) 復(fù)制終點(diǎn)原核和真核復(fù)制的主要差異: 復(fù)制起點(diǎn)( 原核1, 真核多);復(fù)制次數(shù)(原核多次, 真核1次)真核S期復(fù)制, 端粒的復(fù)制復(fù)制的幾種特殊形式環(huán)狀DNA復(fù)制: (1) 型 -雙向, 大腸桿菌(正常); (2) 滾環(huán)型-單向,切割, X174; (3) D-環(huán)型-單向, 線粒體.病毒中存在全保留復(fù)制方式, 逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制方式.復(fù)制中信號(hào)保真 (原核為例) 1. 復(fù)制中, 復(fù)制酶3à5外切酶的矯正功能;2.

2、 復(fù)制后的二次矯正( 母鏈甲基化). DNA的轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座: 染色體上可自主復(fù)制和移動(dòng)一段核酸序列.分類: (1) 復(fù)制性轉(zhuǎn)座( TnA)-拷貝(2) 非復(fù)制性轉(zhuǎn)座( IS )-整個(gè)移動(dòng) 1.很小,1kb 左右,編碼轉(zhuǎn)座酶; 2.末端有倒置重復(fù)序列,其外側(cè)還有一小段正置重復(fù)序列(轉(zhuǎn)座時(shí), 復(fù)制靶序列形成) 3.,特定IS,靶序列一樣; 不同IS,靶序列不一樣 轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄通論 一. RNA轉(zhuǎn)錄的一般過程 1.模板識(shí)別 à 2.轉(zhuǎn)錄起始 à 3.通過啟動(dòng)子à 4.轉(zhuǎn)錄的延伸à 5.終止二.轉(zhuǎn)錄的原料: 1.RNA聚合酶; 2.雙鏈DNA模板; 3. NTPs ;

3、 4.輔助因子三. 轉(zhuǎn)錄的方向: 5 à 3 (模板鏈 / 編碼鏈)四. 轉(zhuǎn)錄中模板上的信號(hào): (保守序列) 啟動(dòng)子( promotor), 終止子( terminator) 調(diào)控序列( 操縱子 operator, 增強(qiáng)子 enhancer )五.不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄一.原核生物轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)RNA聚合酶(a2bbw s): 全酶 = 核心酶 + s s 提高酶與啟動(dòng)子序列的親和力(103),降低與非特異序列的親和力(104), 啟動(dòng)子（promoter）n Pribnow box即 -10 boxn -10 box與-35 box的最佳距離為17 ± 1 bp n +1 一般為A (m

4、RNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn))n 越接近保守序列, 起動(dòng)子越強(qiáng).轉(zhuǎn)錄終止 (終止子)(1)不依賴于r因子的終止 強(qiáng)終止子 =“一段反向互補(bǔ)序列“ + “一段富含T的區(qū)域” (2)依賴于r因子的終止. 弱終止子 =“ 一段反向互補(bǔ)序列 “ 二.真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄1.RNA聚合酶II2.II類啟動(dòng)子增強(qiáng)子(沉默子)n 無方向, 位置, 距離的限制n 具有組織特異性n 有時(shí)兩者可相互轉(zhuǎn)換.n 不屬于啟動(dòng)子, n 能調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄.n 起動(dòng)子,增強(qiáng)子與沉默子都屬于順式作用元件.真核生物的轉(zhuǎn)錄因子n 起始,延伸, 終止都需要因子的幫助.(與原核轉(zhuǎn)錄的區(qū)別)n 分為: (1) 通用轉(zhuǎn)錄因子-都需要 (2) 基因特異

5、轉(zhuǎn)錄因子-調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止 1. 沒有明確的終止子,但有終止信號(hào)2.轉(zhuǎn)錄會(huì)在AATAAA下游0.5-2kb處終止(AATAAA下游15-30bp加PolyA)前體mRNA的加工(時(shí)序性) (1) 5加帽 (轉(zhuǎn)錄早期進(jìn)行30 nt)(2) 3加尾 (前體mRNA加polyA)(3) 切除內(nèi)含子(4) 編輯和修飾5 cap的特殊結(jié)構(gòu)和功能3 m7GpppNmNm-3 (G的方向與N的方向相反,通過5-5相連)功能: (1) 保護(hù)mRNA (2) 提高翻譯能力（效率） (3) 有利于mRNA在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸（運(yùn)出細(xì)胞核） (4) 使mRNA前體的能正確剪接 (第一個(gè)內(nèi)含子)poly(A)的功能(1) 保護(hù)

6、mRNA：延長(zhǎng)其壽命（半衰期）(2) 提高mRNA的翻譯能力：能與poly(A)結(jié)合蛋白 結(jié)合，促進(jìn)翻譯，促進(jìn)mRNA與核糖體結(jié)合(3) poly(A)能促進(jìn)最后一個(gè)內(nèi)含子的剪接n (3) RNA剪接（RNA splicing）n 剪接信號(hào)(屬于內(nèi)含子的邊界) 主要: GU-AG (剪切體) 次要: AU-AC 自我剪切的I, II內(nèi)含子n 剪接體: snRNAs (核小分子RNA)參與特殊剪接方式n 選擇性剪接: 一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄出來的RNA前體，通過不同的剪接方式（選擇不同的外顯子）而形成不同的成熟mRNA，產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)n 反式剪接: 參與剪接的外顯子并不在同一個(gè)基因中（即在不同的RNA分

7、子中） RNA編輯n 在特定位點(diǎn): 改變,插入,刪除核苷酸.n 在轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行，沿3 5方向進(jìn)行;n 由gRNA（guide RNA，向?qū)NA）指導(dǎo)進(jìn)行;n 因是RNARNA, 存在 G-U 配對(duì).翻譯 蛋白翻譯通論n 一.合成過程n 1. 翻譯的起始-2. 肽鏈的延伸-3. 肽鏈的終止及釋放n 二. 蛋白質(zhì)生物合成體系n 1、mRNA; 2、核糖體; 3、tRNA; 4、起始因子、延長(zhǎng)因子和終止因子; 5、氨基酰-tRNA 合成酶n 三.氨基酸的活化與搬運(yùn)n AA-tRNA n 四. 蛋白質(zhì)前體的加工, 折疊n 五. 蛋白的定向轉(zhuǎn)運(yùn)n 六. 蛋白的降解密碼子的特點(diǎn)n 遺傳密碼：三聯(lián)體密碼n

8、遺傳密碼的特點(diǎn)：連續(xù)性,有起始密碼(AUG, (原核中也用GUG)和終止密碼(UAA,UAG,UGA),簡(jiǎn)并性 ,擺動(dòng)性.通用性,偏好性tRNA：接合器n 一種tRNA只能與一種氨基酸結(jié)合，一種氨基酸可與幾種tRNA結(jié)合。(tRNA數(shù)目>20)n 結(jié)合位點(diǎn)為：3端CCA-OH。n Ala-tRNAala;n 起始tRNA fmet-tRNAfmet： (原核生物） Met-tRNAimet 起始tRNA (真核生物）n met-tRNAemet;攜帶延長(zhǎng)中的肽鏈上的蛋氨酸(真核生物）氨基酰-tRNA合成酶n 既能識(shí)別特定的氨基酸，又能識(shí)別轉(zhuǎn)運(yùn)該氨基酸的tRNA。n 氨酰tRNA合成酶的專

9、一性很高，共有20種，每一種只用于單一種氨基酸與相應(yīng)tRNA的結(jié)合 (氨基酸專一, tRNA有多個(gè)).n 氨基酸+ATP+tRNA 氨基酰-tRNA +AMP +PPi n 氨基酰-tRNA合成酶可發(fā)揮較對(duì)功能，使誤載的氨基酰-tRNA從tRNA上釋下，保證遺傳信息翻譯的準(zhǔn)確性。原核生物的蛋白翻譯n 1. tRNA裝載 在氨酰tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase）的作用下，使氨基酸連接到tRNA 3端的腺苷酸上，形成氨酰tRNA (fmet-tRNA) n 2. 核糖體解離n 翻譯起始復(fù)合物首先是在核糖體小亞基上組裝起來n 每一次翻譯后，核糖體的大小亞基必須解離，

10、以讓新的翻譯起始復(fù)合物形成n 核糖體解離需要起始因子（initiation factors，IF）的協(xié)助n 3. mRNA與小亞基結(jié)合。 AUG上游813個(gè)堿基處存在SD序列能與小亞基中16S rRNA 3端序列互補(bǔ)。 n 4、fmet-tRNA的結(jié)合： fMet-tRNA進(jìn)入小亞基的P位, 反密碼子與mRNA起始密碼子配對(duì); n 5、大亞基結(jié)合 n 6. 延伸Step 1：進(jìn)位 (注冊(cè)) (1) 一個(gè)新的氨酰tRNA結(jié)合到核糖體的A位 (2) 校對(duì)（proofreading）:如錯(cuò)誤的氨酰 tRNA進(jìn)入了A位 （反密碼子與密碼子不能很好配對(duì)），可進(jìn)行校正. Step 2：轉(zhuǎn)肽 大亞基的23S

11、 rRNA, 肽基轉(zhuǎn)移酶, 形成肽鍵Step 3：移位 n mRNA與肽基tRNA（peptidyl-tRNA）移動(dòng)1個(gè)密碼子的距離，使肽基tRNA進(jìn)入P位，而原在P位的tRNA離開核糖體n 7. 終止(1) 翻譯到達(dá)終止密碼子后，釋放因子及GTP結(jié)合到核糖體的相應(yīng)位點(diǎn)，促使肽鏈與tRNA的連結(jié)斷開(2) 接著釋放因子和tRNA從核糖體解離(3) 最后，核糖體與mRNA解離，核糖體大小亞基解離真核生物蛋白質(zhì)合成的特點(diǎn)n 起始階段（1）在核內(nèi)合成mRNA前體，加工并與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白顆粒，轉(zhuǎn)入胞漿。起始時(shí)其二級(jí)結(jié)構(gòu)需要松解，并放出多余的蛋白質(zhì)。（2）Met-tRNAiMet （3） 起始復(fù)

12、合物：40S-mRNA-Met-tRNAiMet（4）沒有SD序列。5cap 和3 ployA參與形成翻譯起始復(fù)合物.n 第一個(gè)AUG不一定是起始密碼n 與在其周圍，往往有共同序列Kozak 序列CCRCCAUGG (R,嘌呤)n 還與高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)肽鏈的翻譯后加工（1）N末端的甲酰甲硫氨酸（原核）或甲硫氨酸（真核）的切除; （2）二硫鍵的形成（3）修飾：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羥基化等（4）多聚蛋白前體的切割, 切除新生肽鏈中非功能片段, 信號(hào)肽的處理.（5）蛋白質(zhì)剪接：除去蛋白質(zhì)內(nèi)含子（intein） (6) 新生肽鏈的折疊 (7) 亞單位聚合基因表達(dá)調(diào)控n 基因表達(dá)的時(shí)間性及空間性

13、n 基因表達(dá)方式 （1）管家基因與奢侈基因 （2）誘導(dǎo)和阻遏表達(dá)n 基因表達(dá)的調(diào)控方式：多級(jí)調(diào)控， 轉(zhuǎn)錄調(diào)控最重要n 影響基因表達(dá)的因素： （1）原核: 營(yíng)養(yǎng)狀況, 環(huán)境因素; （2）真核: 激素水平, 發(fā)育階段.一. 原核生物基因表達(dá)的調(diào)控n 轉(zhuǎn)錄與翻譯相耦聯(lián)。n 分為：（1） 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：操縱子 （2）翻譯水平的調(diào)控n 啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響 （1）啟動(dòng)子決定轉(zhuǎn)錄方向及模板鏈 (2) 啟動(dòng)子決定轉(zhuǎn)錄效率 n 原核基因 轉(zhuǎn)錄水平 的調(diào)控操縱子 =啟動(dòng)子 + 操縱基因 + 結(jié)構(gòu)基因 轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制 (范例)n 乳糖操縱子調(diào)控的機(jī)制 (分解代謝)n 色氨酸操縱子的調(diào)控機(jī)制(合成代謝)二.真核生物

14、基因表達(dá)的調(diào)控n DNA水平的調(diào)控*n 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 n 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控*n 翻譯水平的調(diào)控n 翻譯后水平的調(diào)控* DNA水平的調(diào)控n 染色質(zhì)的丟失n 基因擴(kuò)增n 基因重排n DNA甲基化 (表達(dá)降低, X染色體失活中心)n 染色體結(jié)構(gòu) (常染色質(zhì) 和 異染色質(zhì))轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控-最重要n 轉(zhuǎn)錄起始n 順式作用元件 和 反式作用因子;n 以正調(diào)控為主反式作用因子特點(diǎn)n 三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域： (1) DNA識(shí)別結(jié)合域； (2) 轉(zhuǎn)錄活性域 (3) 結(jié)合其他蛋白的結(jié)合域n 能識(shí)別并結(jié)合順式作用元件 n 正調(diào)控與負(fù)調(diào)控反式作用因子結(jié)構(gòu)域的模式n DNA結(jié)合域n 轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域n (1) 酸性-螺旋結(jié)構(gòu)域n (2) 富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域 n (3) 富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域 轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控n 反式作用因子的活性調(diào)節(jié)n (1) 合成后即有活性：需要時(shí)合成，可迅速降解n (2) 共價(jià)修飾：磷酸化-去磷酸化，糖基化n (3) 配體結(jié)合：如激素與受體的結(jié)合n (4) 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用：二聚體n 反式作用因子與順式作用元件, 通過成環(huán)等方式調(diào)控n 反式作用因子間存在組合式調(diào)控. 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控n mRNA的選擇性剪接 mRNA 運(yùn)