血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)骨缺損修復(fù)的影響

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)骨缺損修復(fù)的影響 【摘要】 探討血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）對(duì)肌肉骨膜瓣、松質(zhì)骨顆粒和骨髓聯(lián)合移植修復(fù)骨缺損中的影響.方法制作家兔橈骨骨缺損模型，在缺損區(qū)用肌肉骨膜瓣、松質(zhì)骨顆粒及骨髓進(jìn)行聯(lián)合移植，于術(shù)后第1、2、4、6、8周時(shí)利用光學(xué)顯微鏡和免疫組織化學(xué)等方法檢測(cè)VEGF在骨缺損修復(fù)不同階段中對(duì)各種細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況.結(jié)果VEGF在骨缺損修復(fù)過(guò)程中的不同階段的表達(dá)程度不同，在術(shù)后16周時(shí)(即軟骨內(nèi)化骨階段)，新生的骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)大量的VEGF，其高峰出現(xiàn)在第4周.結(jié)論VEGF是骨缺損修復(fù)過(guò)程中重要的生長(zhǎng)因子，聯(lián)合移植有利于骨缺損的快速修復(fù). 【關(guān)鍵

2、詞】 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類 骨缺損 骨移植 Effects of vascular endothelial growth factor for repairing bone defect ABSTRACT:OBJECTIVETo study the expression and effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) for combined transplanting the musculoperiosteal flap, bone marrow and spongy bone granules to repairing bon

3、e defect.METHODSSegmental bone defect was created in the mid upper of radial shaft of adult rabbits, and combination of musculoperiosteal flap, bone marrow and spongy bone granules was transplanted to the bone defect. VEGF expression in the different phase of repairing bone defect was defected by im

4、munohistochemistry at postoperative of 1, 2, 4, 6, 8 weeks.RESULTSExpression of VEGF was different in the different phase of repairing bone defect. VEGF was expressed in neoosteocytes, osteoblasts and chondrocytes in the bone defects sites from one to six weeks (phase of os endochondrale) after oper

5、ation, and the high expression of VEGF was detected at 4 weeks.CONCLUSIONVEGF is key factor in healing bone defects, and combined transplantation makes for repairing the bone defect. Key words:vascular endothelial growth factors;bone defect;bone transplantation 目前，車禍造成的開(kāi)放性骨折、骨壞死及骨缺損日益增多，而骨折不愈合及骨缺損是治

6、療難點(diǎn).雖然多種方法可用于修復(fù)骨缺損，包括自體骨移植、同種異體骨移植及人工骨移植等，但均有弊端.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)肌肉骨膜瓣、松質(zhì)骨顆粒及骨髓聯(lián)合移植修復(fù)了家兔橈骨骨缺損，并利用免疫組織化學(xué)方法觀察了修復(fù)效果，旨在為臨床治療骨缺損提供依據(jù). 1 材料與方法 取健康家兔30只，體重為2.53.0kg，雌雄不限，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供，分籠飼養(yǎng).實(shí)驗(yàn)前術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒，用5g/L利多卡因行局部浸潤(rùn)麻醉，取雙前肢前內(nèi)側(cè)縱行切口，經(jīng)肌間隙進(jìn)入，顯露橈骨干，截除橈骨中段15mm，制作骨缺損動(dòng)物模型，選擇右前肢為實(shí)驗(yàn)肢，左前肢為對(duì)照肢.取髂后上棘切口，長(zhǎng)度約為20mm，取出15mm10mm大小的髂骨，刮

7、取其松質(zhì)骨顆粒備用；于脛骨上段前內(nèi)側(cè)切開(kāi)皮膚約10mm,抽取骨髓2.0mL,自然狀態(tài)下凝固備用.將實(shí)驗(yàn)組旋前圓肌置入骨缺損模型家兔實(shí)驗(yàn)肢骨缺損區(qū)，并將松質(zhì)骨顆粒及骨髓植入旋前圓肌組織內(nèi)，用橈骨骨膜包裹，用50無(wú)損傷線仔細(xì)縫合骨膜，再逐層縫合切口；而對(duì)照肢則未給予任何處理，直接縫合.分別于術(shù)后1、2、4、6、8周時(shí)隨機(jī)選擇模型家兔5只處死，分別于實(shí)驗(yàn)肢及對(duì)照肢橈骨骨缺損處取材，置于100g/L甲醛溶液固定24h，EDTA脫鈣4周，每周換液1次，梯度酒精脫水，石蠟包埋，5m厚組織切片，行HE及免疫組織化學(xué)染色.方法為組織切片脫臘，水化，EDTA熱修復(fù)，過(guò)氧化氫封閉非特異性抗原，PBS沖洗3次，滴加

8、第一抗體，4過(guò)夜；沖洗3次，滴加第二抗體，室溫孵育10min；PBS沖洗3次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，室溫孵育10min；PBS沖洗3次，DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片. 2 結(jié)果 2.1 HE染色表現(xiàn) 術(shù)后第1周對(duì)照肢炎性細(xì)胞減少，有少量纖維組織形成；第24周，缺損組織中纖維組織大量形成，但排列紊亂，伴有少量軟骨細(xì)胞增生；第46周，缺損組織中纖維組織排列整齊，可見(jiàn)軟骨細(xì)胞及少量類骨樣組織，呈軟骨內(nèi)化骨；第8周，缺損組織中可見(jiàn)軟骨細(xì)胞，僅在骨折端可見(jiàn)骨痂形成，中間仍有纖維結(jié)締組織.術(shù)后第1周實(shí)驗(yàn)肢缺損組織中可見(jiàn)大量的間充質(zhì)細(xì)胞形成；第2周，可見(jiàn)大量間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，同時(shí)有

9、大量軟骨細(xì)胞團(tuán)形成；第4周，可見(jiàn)大量軟骨細(xì)胞與條索狀的新生骨細(xì)胞，仍有大量增殖的間充質(zhì)細(xì)胞；第68周，缺損組織中軟骨內(nèi)化骨已形成完整的骨組織. 2.2 VEGF的影響 術(shù)后第1周對(duì)照肢取材組織的炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量的VEGF；第24周，在骨折端成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及軟骨細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量的VEGF(圖1A)；第46周，在血管內(nèi)皮細(xì)胞及軟骨細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量的VEGF；第8周，在取材組織中未見(jiàn)VEGF.術(shù)后第1、2周時(shí)實(shí)驗(yàn)肢成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及軟骨細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量VEGF；第24周，骨折端組織血管內(nèi)皮細(xì)胞及軟骨細(xì)胞內(nèi)仍可見(jiàn)較多VEGF(圖1B)；術(shù)后第6周，大量的軟骨細(xì)胞

10、內(nèi)仍可見(jiàn)VEGF；術(shù)后第8周，在骨細(xì)胞中未見(jiàn)VEGF. 3 討論 目前，骨折后缺損骨修復(fù)的確切機(jī)制尚未十分清楚，而骨不連的預(yù)防與治療亦是骨科難題.骨折修復(fù)是由多種因素參與的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，而與成骨有關(guān)的血管形成和成骨細(xì)胞活性的保持有賴于成骨因子的刺激素1.VEGF糖蛋白，分子質(zhì)量為3445ku，可由多種哺乳類動(dòng)物及人類的胚胎和成年組織中產(chǎn)生，可通過(guò)旁分泌強(qiáng)烈地刺激體內(nèi)新生血管的生成，增加血管通透性，對(duì)維持血管的正常狀態(tài)和完整性具有重要意義2，3.VEGF是目前已知的眾多血管生長(zhǎng)因子中作用最強(qiáng)4，其他促血管生成因子的作用均直接或間接地通過(guò)增強(qiáng)VEGF表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn).本實(shí)驗(yàn)用肌肉骨膜瓣、松質(zhì)骨顆粒和

11、骨髓聯(lián)合移植修復(fù)長(zhǎng)段骨缺損，并用HE、免疫組織化學(xué)染色和原位雜交的方法觀察了骨缺損的修復(fù)時(shí)間與VEGF在細(xì)胞內(nèi)表記情況.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在早中期骨缺損模型家兔實(shí)驗(yàn)肢缺損處組織中可見(jiàn)大量的毛細(xì)血管形成，并伴有移植骨的吸收和軟骨細(xì)胞的形成，在中后期見(jiàn)大量的軟骨內(nèi)化骨形成，骨組織進(jìn)一步得到重建，一些軟骨細(xì)胞也經(jīng)鈣化，骨髓腔已初步形成；原位雜交結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)肢及對(duì)照肢家兔缺損處組織細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)大量的VEGF，但實(shí)驗(yàn)肢較對(duì)照肢多.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，VEGF在肌肉骨膜瓣、松質(zhì)骨顆粒和骨髓聯(lián)合移植修復(fù)長(zhǎng)段骨缺損修復(fù)過(guò)程中，具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化增殖及軟骨內(nèi)化骨作用，是骨缺損修復(fù)的重要生長(zhǎng)因子，聯(lián)合移植有利于骨缺

12、損的快速修復(fù).【參考文獻(xiàn)】 1 Frost HM.The biology of fracture healingJ.Clin Orthop,2002,248:283.2 Ferrara N, Henzel WT.Pituitary follicular cells secrete a novel heparinbinding growth factor specific for vascular endothelial cellsJ.Biochem Biophys Res Commun,2001,161(2):851.3 Shifren TL,Doldi N, Ferrara N, et al.In the human fetus vascular endothelial growth factor is expressed in epithelisl cells and myocytes, but not vascular endot