金屬硫蛋白在心肌缺血再灌注損傷修復(fù)中的抗氧化作用

1、    金屬硫蛋白在心肌缺血再灌注損傷 修復(fù)中的抗氧化作用        摘要目的：探討金屬硫蛋白(MT)在心肌梗塞和缺血再灌注心肌損傷修復(fù)中與脂質(zhì)過(guò)氧化的關(guān)系。方法：采用大鼠心肌梗塞/缺血再灌注模型，測(cè)定手術(shù)后24 h和8周心肌組織的MT及脂質(zhì)過(guò)氧化的中間產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量。結(jié)果：心肌梗塞和缺血再灌注24 h后MDA含量均顯著高于對(duì)照組(P0.01)，8周后MDA顯著降低(P0.05)；而MT的含量在術(shù)后24 h即升高，8周MT繼續(xù)升高，缺血再灌注組MT達(dá)

2、(314.09±23.18) ng/mg蛋白。結(jié)論：MT對(duì)心肌梗塞和缺血再灌注所產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物可能具有清除作用，從而促進(jìn)損傷心肌的修復(fù)。主題詞金屬硫蛋白；脂質(zhì)過(guò)氧化；局部缺血；再灌注 The antioxidative effects of metallothionein on recovery ofmyocardial injury after ischemia and reperfusionJIN Hui-Ying, LI Fa-Qing, FANG De-Xing, TAN Wei-Guo, CHEN Hua-Biao, LI Su-QinInstitute of Mil

3、itary Medicine of Nanjing Command, PLA, Nanjing (210002)Abstract AIM:The relationship of metallothionein(MT) and lipid peroxidation on myocardial injury of myocardial infarction and ischemia-reperfusion was studied. METHODS：Contents of MT and malonyldialdehyde (MDA)-metabolism products of lipid pero

4、xidation of rat myocardial tissue were determined in 24 hours and 8 weeks after myocardial infarction and ischemia-reperfusion. RESULTS：After 24 hours myocardial infarction and ischemia-reperfusion, MDA contents were obviously higher than that of the control(P0.01), especially in ischemia-reperfusio

5、n group, MDA contents were 5.7 folds of the control. But 8 weeks after myocardial infarction and ischemia-reperfusion, MDA contents were decreased progressively(P0.05). After 24 hours of myocardial infarction and ischemia-reperfusion, MT contents were significantly higher than that of the control, t

6、hen increased gradually in 8 weeks. MT contents reached to (314.09±23.18) ng/mg protein in 8 weeks group after ischemia-reperfusion.CONCLUSION：MT might be able to eliminate effectively the lipid peroxidation products which was caused by ischemia and reperfusion, thus created a better protection

7、 on myocardial injury.MeSHMetallothionein; Lipid peroxides; Ischemia; Reperfusion大量研究證明自由基損傷是缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素。金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是小分子可誘導(dǎo)蛋白，多種生理及病理情況下均有MT的變化，特別是MT具有清除自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化的功能1，但MT與心肌梗塞急性期和恢復(fù)期脂質(zhì)過(guò)氧化的變化關(guān)系目前仍無(wú)明確結(jié)論，本研究旨在探討MT在心肌缺血再灌注損傷恢復(fù)中是否具有持續(xù)的抗氧化作用，為MT在缺血再灌注損傷中的治療研究提供依據(jù)。材料與方法(一)試劑和儀器：兔抗鼠MT抗體為本室自制，

8、MDA測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PG-3022酶標(biāo)儀(國(guó)營(yíng)華東電子管廠)，UV-160A紫外分光光度計(jì)(SHIMADZU，日本)。(二)標(biāo)本制備和指標(biāo)測(cè)定：參考文獻(xiàn)2方法，30只雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)分為5組，乙醚麻醉，仰臥固定，接微型人工呼吸機(jī)及心電機(jī)，行常壓口腔通氣并維持麻醉狀態(tài)；常規(guī)消毒開胸，暴露心臟，剪開心包，5-0絲線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈前降支部分，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，心肌梗塞組結(jié)扎，缺血再灌注組阻斷血流45 min后松開，實(shí)施再灌注，常規(guī)關(guān)胸，分籠飼養(yǎng)；分別于手術(shù)后24 h及8周處死。取心

9、室肌稱重，生理鹽水制成10%勻漿，部分勻漿測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化的中間產(chǎn)物MDA含量，部分勻漿15 000 r/min 1 h離心，取上清按文獻(xiàn)3測(cè)MT含量，蛋白定量采用染料法。(三)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，采用t檢驗(yàn)判定組間差異的顯著性。結(jié)果大鼠心肌梗塞和缺血再灌注處理24 h及8周后心肌組織MDA、MT的含量變化見表1。心肌梗塞和缺血再灌注后24 h MDA含量均顯著高于對(duì)照組(P0.01)，而在手術(shù)后8周發(fā)現(xiàn)心肌梗塞組MDA含量與對(duì)照相比已無(wú)明顯差異，缺血再灌注組MDA含量顯著低于24 h組(P0.01)。MT的含量在手術(shù)后24 h即明顯高于對(duì)照組(P0.01)，手術(shù)后8周又顯著高于24 h

10、組(P0.01)，特別是缺血再灌注組，8周時(shí)MT的含量是對(duì)照組的2.87倍，是24 h組的1.8倍，同時(shí)也顯著高于心肌梗塞組(P0.05)。表1大鼠心肌梗塞及缺血再灌注后不同時(shí)間組MT與MDA的含量Tab 1 Contents of MT and MDA of rat myocardial tissue in different time course after myocardial infarction and ischemia-reperfusion (,n=6)GroupMDA(nmol/mg pro)MT(ng/mg pro)Control2.454±0.430109.19

11、±14.18Mycardial infarction24 h5.346±0.650*141.92±21.25*8 weeks3.530±0.990173.80±17.61*Ischemia-reperfusion24 h13.909±1.440*160.51±16.16*8 weeks4.162±0.520*314.09±23.18* P0.05,*P0.01 vs control討論結(jié)果表明：大鼠急性心肌梗塞和缺血再灌注后心肌細(xì)胞均產(chǎn)生大量氧自由基，特別是缺血再灌注后，活化的中性粒細(xì)胞大量聚集在缺血區(qū)，

12、加速了自由基的生成，后者刺激生物膜中的不飽和脂肪酸啟動(dòng)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化，所以脂質(zhì)過(guò)氧化含量間接反映了自由基損傷的程度，脂質(zhì)過(guò)氧化造成膜結(jié)構(gòu)與功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞損傷4，因而在最初的24 h MDA含量均顯著增高。MT作為一種小分子可誘導(dǎo)蛋白，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的各種器官中，MT分子中有20個(gè)半胱氨酸殘基，具有清除自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化的功能，是重要的內(nèi)源性抗損傷物質(zhì)，在多種應(yīng)激及病理情況下均有MT的升高，因而MT可能參與心肌損傷的修復(fù)過(guò)程。Kang5采用轉(zhuǎn)基因小鼠研究證明高表達(dá)MT的小鼠缺血再灌注后心肌損傷程度明顯小于非轉(zhuǎn)基因鼠。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)心肌梗塞和缺血再灌注24 h后心肌MT含量明顯

13、升高，考慮這可能是應(yīng)激狀態(tài)下的一種代償反應(yīng)。在手術(shù)后8周，MT持續(xù)升高，可發(fā)揮清除自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化的功能，特別是在急性期脂質(zhì)過(guò)氧化嚴(yán)重升高的缺血再灌注組，心肌MT的含量顯著高于24 h組和心肌梗塞組，同時(shí)恢復(fù)期脂質(zhì)過(guò)氧化又顯著降低，推測(cè)MT對(duì)心肌缺血和缺血再灌注所至的脂質(zhì)過(guò)氧化有清除作用，并參與心肌細(xì)胞損傷的修復(fù)，在心肌修復(fù)中起著持續(xù)的抗氧化作用，這可能與MT富含巰基的結(jié)構(gòu)有關(guān)。至于MT是否還具有其他的保護(hù)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。作者單位:南京軍區(qū)聯(lián)勤部軍事醫(yī)學(xué)研究所(南京 210002)參考文獻(xiàn)1朱賡伯.金屬硫蛋白的生物學(xué)特性及生理作用.生命的化學(xué)， 1995，15(1)：23.2Sato

14、shi Y, Shozo K, Moritani H, et al. Reperfusion hastens appearance and extent of distribution of type 1 collagen in infart sone. Cardiovasc Res, 1995,307:763.3金慧英，魏堯梅，胡惠民，等.鎘-金屬硫蛋白的抗體制備及酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定.中國(guó)公共衛(wèi)生，1998，14(2)：103.4Zweior JL. Measurement of superoxide derived free radicals in the reperfused heart. Evidence for a free radical mechanism of reperfusion i