葉酸代謝能力基因檢測操作流程

1、MTHFR C677T , MTHFR A1298C, MTRR A66G基因檢測操作流程實驗流程一、操作步驟適用儀器：普通PCR儀樣本要求：EDTA抗凝劑的靜脈全血（100µl），室溫保存不超過7天， 28保存不超過1個月，-20保存不超過3個月，反復(fù)凍融次數(shù)不超過5次；DNA的濃度應(yīng)不低于5ng/l， A260/ A 280應(yīng)在1.62.0之間。有血塊的樣本需經(jīng)勻漿處理或用組織研磨儀研磨處理后再進(jìn)行全血DNA的提取。檢驗方法：（試劑盒中的檢本測卡、陽性/陰性對照卡上標(biāo)識解釋如下：M表示突變型，WT表示野生型，C表示質(zhì)控線，T表示檢測線。）A： 樣本DNA的制備試劑盒準(zhǔn)備工作：1、

2、清洗液BW-I：用50 ml量筒分別移取35 ml無水乙醇（分析純）和35 ml異丙醇加入至清洗液BW-I試劑瓶中，顛倒混合均勻，在試劑瓶上標(biāo)明“已加入醇”和日期，備用。2、清洗液BW-II：用50 ml量筒移取49 ml無水乙醇加入至清洗液BW-II試劑瓶中，顛倒混合均勻，在試劑瓶上標(biāo)明“已加入醇”和日期，備用。3、蛋白酶K準(zhǔn)備：取出蛋白酶K，室溫解凍，渦旋混勻后備用。4、磁性微粒準(zhǔn)備：將磁性微粒渦旋混勻，保證均一。實驗操作步驟：1. 將20 l蛋白酶K溶液加入2 ml 離心管的管底。依次加入100 l全血、200 l裂解液BL，用渦旋振蕩器混合15 sec(以下簡稱渦旋混勻)，56 水浴2

3、0 min。2. 向步驟1裂解處理的樣品中依次加入300 l結(jié)合液BI、25 l的磁性微粒（移取前必須充分渦旋混勻），渦旋混勻，室溫靜置5 min。磁性分離5 min，棄上清。3. 從磁性分離器上取出離心管，加入400 l清洗液BW-I，渦旋混勻，磁性分離至上清澄清（期間上下顛倒數(shù)次，以清洗離心管管壁），棄上清；重復(fù)本步操作，以400l清洗液BW-I重復(fù)清洗一次。4. 從磁性分離器上取出離心管，加入400 l清洗液BW-II，渦旋混勻，磁性分離至上清澄清（期間上下顛倒數(shù)次，以清洗離心管管壁），棄上清（盡可能棄去所有的清洗液BW-II）。5. 打開離心管蓋，將其室溫晾干5 min。6. 從磁性分

4、離器上取下離心管，向管中加入100 l 洗脫液ES，渦旋混勻，56水浴5 min。7. 將離心管置于磁性分離器上，磁性分離至上清澄清。將上清液（分離純化得到的DNA溶液）轉(zhuǎn)移到2 ml離心管中，直接用于下游實驗或于-20 保存?zhèn)溆?。B：PCR擴(kuò)增液準(zhǔn)備（1）每人份需做兩個反應(yīng)，取兩個無菌0.2ml PCR薄壁管，在PCR薄壁管管蓋上依次標(biāo)有M、WT。（2）將試劑從-20取出平衡至室溫，瞬時離心。在標(biāo)有M的管中加入29µl 擴(kuò)增液（M），在標(biāo)有WT的管中加入29 µl擴(kuò)增液（WT）。 （3）分別向以上M和WT各管中加入1µl反應(yīng)液。將管蓋蓋緊后，渦旋混勻，瞬時離心待

5、用。C：待檢測DNA樣本的配制在上述標(biāo)有M、WT管中分別加入3µl待測基因組DNA，分別再加入17µl ddH2O使終體積為50 µl。將管蓋蓋緊后，渦旋混勻，瞬時離心。D：PCR擴(kuò)增將PCR管放入PCR儀中，按如下程序擴(kuò)增：50 2min；95 5min； 94 30sec、60 30sec、 65 1min（26Cycles）；65 10min； 4 Hold。取出PCR產(chǎn)物，28保存。E： 檢測卡檢測實驗從密封袋中取出檢測卡，將待測樣本M與WT管中的PCR產(chǎn)物分別滴加在檢測卡對應(yīng)的樣品墊處，待25 min對結(jié)果進(jìn)行判讀，20min后結(jié)果不可靠。F：質(zhì)量控制（

6、1）檢測結(jié)果中陽性對照應(yīng)在陽性對照卡檢測線（T線）出條帶，陰性對照應(yīng)在陰性對照卡檢測線（T線）不出條帶。正常檢測時，應(yīng)定期進(jìn)行陽性對照品及陰性對照品實驗。（2）陽性對照品實驗：取兩個無菌0.2ml PCR薄壁管，在PCR薄壁管管蓋上依次標(biāo)有M、WT，將20µl M陽性對照液、20µl WT陽性對照液分別加入標(biāo)有M、WT的PCR薄壁管中，再依次分別加入M擴(kuò)增液29µl及1µl反應(yīng)液、WT擴(kuò)增液29µl及1µl反應(yīng)液，按照步驟中DF完成，檢測線（T線）及質(zhì)控線（C線）均應(yīng)出現(xiàn)條帶。（3）陰性對照品實驗：取兩個無菌0.2ml PCR薄壁管，

7、在PCR薄壁管管蓋上依次標(biāo)有M、WT，將M擴(kuò)增液29µl、1µl反應(yīng)液及WT擴(kuò)增液29µl、1µl反應(yīng)液分別加入標(biāo)有M、WT的PCR薄壁管中，再分別加入20µl陰性對照液，按照步驟中DF完成，質(zhì)控線（C線）應(yīng)出現(xiàn)條帶，檢測線（T線）應(yīng)無條帶出現(xiàn)。G：結(jié)果判讀（如下圖、下表）如上圖一所示，以陽性對照液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，檢測線（T線）有條帶出現(xiàn)，作為陽性對照；以陰性對照液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，檢測線（T線）無條帶出現(xiàn)，為陰性對照。若陰性樣本有條帶出現(xiàn)，有可能加樣時未及時更換吸頭，有DNA污染，建議在操

8、作過程中，先配制陰性對照管并及時閉合PCR管蓋。圖二顯示MTHFR 677CC表示正常野生型；圖三顯示MTHFR 677TT表示一對等位基因的第677位胞嘧啶（C）均變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），即純合突變；圖四顯示MTHFR 677CT表示其中一個等位基因的第677位胞嘧啶（C）變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），即雜合突變；圖五質(zhì)控線（C線）無條帶或質(zhì)控線（C線）與檢測線（T線）均無條帶，即為無效檢測。無效原因可能為操作不正確或試紙條已變質(zhì)損壞。應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說明書，并用新的檢測卡重新檢測。如果問題仍然存在，應(yīng)立即停止使用該批號產(chǎn)品，并與廠家或供應(yīng)商聯(lián)系。圖二 野生型圖三 純合突變圖一 陽性及陰性對照圖五 無效圖圖四 雜合突變 H：注意事項（1）實驗室應(yīng)該遵循PCR實驗規(guī)范的要求分區(qū)操作，各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用，加模板和引物的移液器不能混用，每次加樣后均需更換吸頭，推薦使用無核酶、帶濾芯的吸頭。各區(qū)的儀器、設(shè)備和工作服應(yīng)獨立使用。 （2）本試劑盒用于體外操作。用戶切勿吸入試劑或直接接觸皮膚。（3）使用本試劑盒前，請仔細(xì)閱讀說明書，嚴(yán)格按照說明書的要求操作。打開包裝后請盡快使用。（4）使用本試劑盒時，因PCR體系為50µl體系，應(yīng)使用200µl的PCR擴(kuò)增管進(jìn)行操作。（5）本試劑盒備有“PCR組分加入確認(rèn)單”，在【檢測方法】中的步驟B(PC