生物分離工程

1、第六章第六章 凝膠層析凝膠層析凝膠層析的基本原理凝膠層析的基本原理凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)凝膠層析的基本操作凝膠層析的基本操作凝膠介質(zhì)的選用原則凝膠介質(zhì)的選用原則分子篩色譜（凝膠過濾）分子篩色譜（凝膠過濾） 層析法所用的凝膠顆粒大小要均一，顆粒內(nèi)外貫穿許多小孔徑的通路，分子量小的物質(zhì)，比較容易進(jìn)入顆粒中，因此被延滯流出。親水性高，表面惰性，即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不親水性高，表面惰性，即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用；發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用；穩(wěn)定性強(qiáng)，在較寬的穩(wěn)定性強(qiáng)，在較寬的pH和離子強(qiáng)度范圍以及和離子強(qiáng)度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長，化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定，使用壽

2、命長，具有一定的孔徑分布范圍；具有一定的孔徑分布范圍；機(jī)械強(qiáng)度高，允許較高的操作壓力（流速）。機(jī)械強(qiáng)度高，允許較高的操作壓力（流速）。 l凝膠特性參數(shù)l內(nèi)水體積內(nèi)水體積Vi：孔體積孔體積l外水體積外水體積Vo：顆粒間體積顆粒間體積l柱床體積柱床體積Vt Vt=Vo+Vi+ Vg Vt= Vi+Vol洗脫體積洗脫體積Ve Ve=Vo+KdVi lKd=(Ve-Vo)/ViA：“全排阻全排阻”， 流經(jīng)體積流經(jīng)體積Vo Kd=0C：“全滲入全滲入”， 流經(jīng)體積流經(jīng)體積Vo+Vi Kd=1B：“部分排阻部分排阻”或或 Ve=Vo+KdVi 0 Kd1Kd=(Ve-Vo)/Vi “排阻系數(shù)排阻系數(shù)” 或

3、或“分配系數(shù)分配系數(shù)”一定規(guī)格凝膠，一定規(guī)格凝膠， Kd特征常數(shù)特征常數(shù)Kd1 物質(zhì)分子與凝膠之間有吸附物質(zhì)分子與凝膠之間有吸附 Tyr=1.4 G-25小分子小分子Kd1 水合作用水合作用 NaCl 0.8 G 0.9整個(gè)凝膠作為固定相整個(gè)凝膠作為固定相 Vi+VgKav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)=KdVi/(Vt-Vo) 有效分配系數(shù)有效分配系數(shù)分子形狀不同分子形狀不同M相近也可分開相近也可分開牛血清白蛋白（球）、兔血紅蛋白（棍）牛血清白蛋白（球）、兔血紅蛋白（棍） 68000d排阻極限（排阻極限（exclusion limit）l是指不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的是指不能擴(kuò)散到

4、凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對(duì)分子質(zhì)量。例如相對(duì)分子質(zhì)量。例如Sephadex G50的排阻極的排阻極限是限是30 kD。分級(jí)范圍（分級(jí)范圍（fractionation range）l能被凝膠阻滯并且能被凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離相互之間可以得到分離的的溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍。溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍。Sephadex G50的的分級(jí)范圍為分級(jí)范圍為1.530 kD。 凝膠粒徑凝膠粒徑l凝膠一般為球形，其粒徑大小對(duì)分離度有重要凝膠一般為球形，其粒徑大小對(duì)分離度有重要影響。影響。粒徑越小，分離效率越高。粒徑越小，分離效率越高。凝膠粒徑多凝膠粒徑多用篩目或微米表示。軟凝膠粒徑較大，一般為用篩目或

5、微米表示。軟凝膠粒徑較大，一般為50150 m（100200目），例如，目），例如，Sepharose和和Sephadex凝膠粒徑分布為凝膠粒徑分布為45165 m 。l硬凝膠粒徑較小，一般為硬凝膠粒徑較小，一般為550 m 。床體積（床體積（bed volume）l即即1 g干燥凝膠溶脹后所占有的體積。干燥凝膠溶脹后所占有的體積。Sephadex G50的床體積為的床體積為911 cm3/g干膠。干膠?？障扼w積（空隙體積（void volume）l即即V0值。空隙體積可用相對(duì)分子質(zhì)量大于排阻值。空隙體積可用相對(duì)分子質(zhì)量大于排阻極限的溶質(zhì)測定，一般使用平均相對(duì)分子質(zhì)量極限的溶質(zhì)測定，一般使用平

6、均相對(duì)分子質(zhì)量為為2000 kD的水溶性藍(lán)色葡聚糖的水溶性藍(lán)色葡聚糖（blue dextran）。）。l對(duì)于商品化的凝膠過濾介質(zhì)，廠商的產(chǎn)品目錄對(duì)于商品化的凝膠過濾介質(zhì)，廠商的產(chǎn)品目錄中一般均給出其凝膠的各種性質(zhì)，如分級(jí)范圍、中一般均給出其凝膠的各種性質(zhì)，如分級(jí)范圍、粒徑、流速與壓力的關(guān)系等，可參考使用。粒徑、流速與壓力的關(guān)系等，可參考使用。溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，因此溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，因此可采用可采用恒定洗脫恒定洗脫法洗脫展開，操作法洗脫展開，操作條件溫和條件溫和，產(chǎn)品收率可接近產(chǎn)品收率可接近100；每批分離操作結(jié)束后每批分離操作結(jié)束后不需要不需要進(jìn)行介質(zhì)的進(jìn)行

7、介質(zhì)的再生再生，故容易實(shí)施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度；故容易實(shí)施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度；作為脫鹽手段，作為脫鹽手段，GFC比透析法速度快，精度比透析法速度快，精度高；與超濾法相比，剪切應(yīng)力小，蛋白質(zhì)活性高；與超濾法相比，剪切應(yīng)力小，蛋白質(zhì)活性收率高；收率高；分離機(jī)理簡單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大。分離機(jī)理簡單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大。僅根據(jù)溶質(zhì)之間分子量的差別進(jìn)行分離，分僅根據(jù)溶質(zhì)之間分子量的差別進(jìn)行分離，分離較慢、需嚴(yán)格離較慢、需嚴(yán)格控制流速控制流速；經(jīng)經(jīng)GFC洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋。因此需要在洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋。因此需要在具有濃縮作用的單元操作（如超濾、離子交具有濃縮作用的單元操作（如超濾、

8、離子交換和親和色譜等）后使用。換和親和色譜等）后使用。l葡聚糖系葡聚糖系l其中其中Sephadex G是最傳統(tǒng)的軟凝膠過濾介質(zhì)是最傳統(tǒng)的軟凝膠過濾介質(zhì)之一，目前仍被廣泛使用。之一，目前仍被廣泛使用。Sephadex G是利是利用葡聚糖（右旋糖酐）交聯(lián)制備的，交聯(lián)劑用葡聚糖（右旋糖酐）交聯(lián)制備的，交聯(lián)劑一般采用環(huán)氧氯丙烷一般采用環(huán)氧氯丙烷。Sephadex凝膠按交聯(lián)凝膠按交聯(lián)度大小，分度大小，分G 10G 200共八種型號(hào)。共八種型號(hào)。G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量吸水量（g/g干凝膠）干凝膠）1.01.52.55.07.510.015.020.0工

9、作范工作范圍（肽圍（肽與蛋白）與蛋白）D700150050001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000 性質(zhì)性質(zhì)1.對(duì)稀酸、稀堿、鹽溶液穩(wěn)定對(duì)稀酸、稀堿、鹽溶液穩(wěn)定2.2.濕態(tài)的葡聚糖可加熱到濕態(tài)的葡聚糖可加熱到110，干的則能耐受，干的則能耐受120高溫高溫3. 交聯(lián)度交聯(lián)度穩(wěn)定性穩(wěn)定性4. 凝膠含少量羧基，對(duì)陽離子輕微吸附，操作時(shí)使凝膠含少量羧基，對(duì)陽離子輕微吸附，操作時(shí)使I0.02mol/l5. 芳香族、雜環(huán)化合物有時(shí)芳香族、雜環(huán)化合物有時(shí)Kd1 6. 新凝膠柱非特異性吸附蛋白，先用廉價(jià)較惰性蛋新凝膠柱非特異性吸附蛋白，先

10、用廉價(jià)較惰性蛋白飽和吸附、洗滌白飽和吸附、洗滌l規(guī)格編號(hào)規(guī)格編號(hào) 間接反映凝膠孔徑、滲入限、排阻限間接反映凝膠孔徑、滲入限、排阻限 G-50 分離限分離限1500-30000 G-150：5000-400000 對(duì)蛋白、多糖分離范圍不同對(duì)蛋白、多糖分離范圍不同 （多糖分子體積比相同（多糖分子體積比相同M的蛋白大）的蛋白大） 粒度：直徑粒度：直徑100-300um粗粒粗粒 20-80um細(xì)粒細(xì)粒 40-120um中粒中粒l保存保存 濕法：懸浮于水、緩沖液中，濕法：懸浮于水、緩沖液中，0.02%NaN3，0-5 干法：乙醇分步處理（干法：乙醇分步處理（20%，40%，60%，80%） 脫水收縮，抽

11、濾，脫水收縮，抽濾，60-80 吹干，室溫吹干，室溫 半縮法：半縮法：60-70%乙醇懸液，封口，乙醇懸液，封口，4 修飾葡聚糖凝膠修飾葡聚糖凝膠l親脂性親脂性 引入有機(jī)基團(tuán)引入有機(jī)基團(tuán) Sephadex LH-20（羥丙基）（原羥丙基）（原Sephadex G-25） 流動(dòng)相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機(jī)溶劑流動(dòng)相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機(jī)溶劑氯仿、四氯仿、四氫呋喃氫呋喃，因此因此適用于非水溶性溶質(zhì)的凝膠過濾適用于非水溶性溶質(zhì)的凝膠過濾 交聯(lián)葡聚糖離子交換劑交聯(lián)葡聚糖離子交換劑 引入引入CM-，DEAE-，離子交換、離子交換、 分子篩分子篩 人工合成凝膠，控制凝膠總濃度和交聯(lián)

12、劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠，交聯(lián)劑越多，孔隙越小。商品名為Bio-Gel，型號(hào)從P-2至P-300共10種（ 數(shù)字X1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度） 特點(diǎn)：化學(xué)穩(wěn)定性好pH2-11， 無非特異性吸附， 不為微生物利用粒度：粗150-300um 中75-150um 細(xì)40-75um 極細(xì)40um聚丙烯酰胺凝膠 是由是由海藻多糖海藻多糖瓊脂中分離出來的天然凝膠，瓊脂中分離出來的天然凝膠， 常見的有常見的有Sepharose （ Sepharose 2B、4B、6B，數(shù)字代表數(shù)字代表 干膠的百分比干膠的百分比 ） Bio-Gel-A（美國）美國）等等 （Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5

13、M、15M、50M、150M， 數(shù)字?jǐn)?shù)字X106代表排代表排阻限度。阻限度。骨架各線性分子間以氫鍵相連，骨架各線性分子間以氫鍵相連，孔徑依賴于濃度孔徑依賴于濃度瓊脂糖凝膠 特點(diǎn)特點(diǎn)： 1.化學(xué)穩(wěn)定性差，化學(xué)穩(wěn)定性差，pH4-9 2.脫水、干燥、冷凍、有機(jī)溶劑、脫水、干燥、冷凍、有機(jī)溶劑、溫度高于溫度高于40便融化便融化 3.與硼酸形成配合物，孔徑變化，避免與硼酸形成配合物，孔徑變化，避免 4.強(qiáng)度低強(qiáng)度低，隨凝膠濃度，隨凝膠濃度而而，彈性小，調(diào)整柱壓，彈性小，調(diào)整柱壓 5.非特異性吸附力葡聚糖，非特異性吸附力葡聚糖，I0.01mol/l無明顯吸附無明顯吸附 6.分離的分離的M范圍大范圍大（10

14、8），隨凝膠濃度），隨凝膠濃度而而 l架橋瓊脂糖凝膠架橋瓊脂糖凝膠 Sepharose CL 1，3-二溴丙醇二溴丙醇交聯(lián)交聯(lián)，孔徑均勻，孔徑均勻，孔徑大小和分離范圍孔徑大小和分離范圍與普通與普通瓊脂糖瓊脂糖一樣，但一樣，但機(jī)械強(qiáng)度機(jī)械強(qiáng)度，熱穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性，化學(xué)，化學(xué)穩(wěn)定性穩(wěn)定性（pH3-14） l超膠（超膠（ultro-gel ACA) 瓊脂糖與聚丙烯酰胺的混合凝膠瓊脂糖與聚丙烯酰胺的混合凝膠 比比Sepharose 化學(xué)穩(wěn)定性好，強(qiáng)度高，化學(xué)穩(wěn)定性好，強(qiáng)度高，pH3-10，熱穩(wěn)定性不變熱穩(wěn)定性不變 ACA 34：丙烯酰胺丙烯酰胺3%，瓊脂糖，瓊脂糖4% 分離范圍：生物膠分離范圍：生物膠

15、P超膠瓊脂糖超膠瓊脂糖 Bio-Glas 500 孔徑孔徑500 將多孔硅酸鹽玻璃加工制得，粉末狀，可粘合將多孔硅酸鹽玻璃加工制得，粉末狀，可粘合 特點(diǎn)特點(diǎn)：化學(xué)穩(wěn)定性高，強(qiáng)度大，耐高壓，：化學(xué)穩(wěn)定性高，強(qiáng)度大，耐高壓， 對(duì)糖、蛋白有吸附，用聚乙烯二醇浸泡鈍對(duì)糖、蛋白有吸附，用聚乙烯二醇浸泡鈍化化實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作凝膠介質(zhì)的選擇凝膠介質(zhì)的選擇 將樣品中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開，其分離策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。類分離一般選用Sephadex G-25蛋白脫鹽（分子量范圍1000-5000）或選用G-50。對(duì)于小肽和低分子量的物質(zhì)的脫鹽可選用Sephadex G-1

16、0、G-15（分子量范圍 -1500）、Bio-Gel P-2或P-4類分離凝膠介質(zhì)的選擇凝膠介質(zhì)的選擇將樣品中一些分子量比較接近的物質(zhì)分開，該策略是使M盡量在分離范圍的兩側(cè) 3個(gè)組分： Kd 0 0.5 1在層析過程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，但由于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。分離血清蛋白可用G200 5000-800000 強(qiáng)度低 或G150 5000-400000分級(jí)分離l粒度的選擇粒度的選擇 細(xì)粒：流速低，洗脫峰窄，分辨率高，精制或分析細(xì)粒：流速低，洗脫峰窄，分辨率高，精制或分析 粗粒：粗粒： 用于粗制、脫鹽用于粗制、脫鹽 將干膠顆粒懸浮于將干膠顆粒懸浮于

17、10倍以上吸液量的蒸餾水或倍以上吸液量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹。加熱可使溶脹加速，即在洗脫液中充分溶脹。加熱可使溶脹加速，即在沸水浴沸水浴5小時(shí)即可達(dá)到凝膠的充分溶脹。小時(shí)即可達(dá)到凝膠的充分溶脹。 加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可排氣排氣、消毒。、消毒。 商品懸浮液去除保存液、抽濾、洗滌、平衡商品懸浮液去除保存液、抽濾、洗滌、平衡 不需溶脹不需溶脹l層析柱的選擇層析柱的選擇 柱比：長度柱比：長度/直徑、直徑、 體積體積 類分離：類分離： 柱床體積為樣品體積柱床體積為樣品體積5倍倍或略多或略多 柱比柱比5:1-10:1 分級(jí)分離：分級(jí)分離：25-100倍倍 柱比柱比25-100 大

18、柱、長柱流速慢、稀釋嚴(yán)重、分辨率高大柱、長柱流速慢、稀釋嚴(yán)重、分辨率高 實(shí)驗(yàn)室用的層析柱工業(yè)用的層析柱 裝柱裝柱 1.1.裝柱前，必須用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，裝柱前，必須用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將凝膠上面過多的溶液傾出。并將凝膠上面過多的溶液傾出。 2.2.先關(guān)閉層析柱出水口，向柱管內(nèi)加入約先關(guān)閉層析柱出水口，向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，將凝膠液連續(xù)傾入柱中，使柱容積的洗脫液，將凝膠液連續(xù)傾入柱中，使其自然沉降，等凝膠沉降約其自然沉降，等凝膠沉降約2-3cm后，打開柱后，打開柱的出口，使凝膠繼續(xù)沉集，裝柱完畢，關(guān)閉出的出口，使凝膠繼續(xù)沉集，裝柱完畢，關(guān)閉出水口。水口。 不能出

19、現(xiàn)分層、傾斜、氣泡不能出現(xiàn)分層、傾斜、氣泡 通過通過2-3倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，布，以防加樣時(shí)凝膠被沖起以防加樣時(shí)凝膠被沖起，并始終保，并始終保持凝膠上端有一段液體。持凝膠上端有一段液體。 上柱樣品溶液的體積根據(jù)分離要求來確定：進(jìn)樣體積進(jìn)行組別分離時(shí)，樣品溶液最大可為柱體積的10%進(jìn)行分級(jí)分離時(shí)，樣品溶液的體積要小，這樣洗脫出的峰形好，蛋白類濃度蛋白類濃度4%l洗脫洗脫 用水、緩沖液、水用水、緩沖液、水-甲醇、水甲醇、水-丙酮、氨水、醋酸丙酮、氨水、醋酸 溫度、流速、柱壓、阻力恒定溫度

20、、流速、柱壓、阻力恒定 防止非特異性吸附防止非特異性吸附 操作壓操作壓流速快，峰寬流速快，峰寬 相當(dāng)大柱壓范圍內(nèi)相當(dāng)大柱壓范圍內(nèi) v=KP/L 相同操作壓，編號(hào)小，交聯(lián)度大，顆粒粗，流速大相同操作壓，編號(hào)小，交聯(lián)度大，顆粒粗，流速大 部分收集器部分收集器返回自動(dòng)餾分收集儀（進(jìn)口）l再生再生 重復(fù)使用重復(fù)使用 流速下降、板結(jié)可反沖，取出漂洗流速下降、板結(jié)可反沖，取出漂洗l凝膠床的檢查和維護(hù)凝膠床的檢查和維護(hù)使用時(shí)間過長、流速過大、柱高過大，流速使用時(shí)間過長、流速過大、柱高過大，流速 控制操作壓：柱進(jìn)出口液位差控制操作壓：柱進(jìn)出口液位差凝膠的保存：凝膠的保存：0.02%疊氮鈉或疊氮鈉或0.002%

21、洗必泰洗必泰返回蠕動(dòng)泵返回返回國產(chǎn)柱層析系統(tǒng)伯樂公司（BIO-RAD）柱層析系統(tǒng)注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損。）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損。2）裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，最好在要求的）裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，最好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免壓緊凝膠。操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免壓緊凝膠。3）始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則凝膠混入大）始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)。量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)。l生物大分子溶液的脫鹽生物大分子溶液的脫鹽 用用 大粒度、高交聯(lián)度凝膠大粒度、

22、高交聯(lián)度凝膠 使蛋白使蛋白Kd=0，鹽類鹽類Kd=1 蛋白脫鹽后溶解度降低，吸附或沉淀，用稀鹽蛋白脫鹽后溶解度降低，吸附或沉淀，用稀鹽（易揮發(fā)鹽）洗脫，真空干燥（易揮發(fā)鹽）洗脫，真空干燥 樣品體積樣品體積Vi/3 l去熱原去熱原 Sephadex G-25 氨基酸氨基酸 Kd=1 熱原熱原Kd=0 樣品體積樣品體積 30%VtlGFC可用于相對(duì)分子質(zhì)量從幾百到可用于相對(duì)分子質(zhì)量從幾百到106 數(shù)量級(jí)的物質(zhì)的分離純化。數(shù)量級(jí)的物質(zhì)的分離純化。 G-50除去結(jié)晶胰島素中前胰島素、大分子抗原除去結(jié)晶胰島素中前胰島素、大分子抗原 G-25除去青霉素中抗原性雜質(zhì)、致敏、高分子除去青霉素中抗原性雜質(zhì)、致敏、高分子雜質(zhì)雜質(zhì) l右圖是一例利右圖是一例利 用高效用高效GFC分離骨髓分離骨髓 血清蛋白質(zhì)的結(jié)果。血清蛋白質(zhì)的結(jié)果。 色譜柱： 10300，Superose 6洗脫液：0.05molL磷酸鹽0.15molL NaCl（pH7.0）流量：0.2mlmin1.IgA高聚體 2. IgA二聚體 3.IgA單體 4.IgG 5.白蛋白l在凝膠過濾介質(zhì)的分級(jí)范圍內(nèi)在凝膠過濾介質(zhì)的分級(jí)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配蛋白質(zhì)的分配系數(shù)（或洗脫體積）與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)系數(shù)（或洗脫體積）與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成正比成正比，所以，所以GFC可用于未知物質(zhì)相對(duì)分子可用于未知物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測定。質(zhì)