微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量

1、實 驗 報 告實驗課程：微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量學(xué)生姓名： xxx 學(xué) 號： xxx 專業(yè)班級： xxx 2017年 4月 11日實驗背景：凱氏定氮法：測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。該方法在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣餾出并為過量的酸液吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)堿滴定，就可計算出樣品中的氮量。由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由物質(zhì)含氮量計算其蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。一、 實驗?zāi)康?、掌握凱氏（Kjeldahl）定氮法測定蛋白質(zhì)含量的原理方法；2、學(xué)會使用凱式定氮儀。二、 實驗原理蛋白質(zhì)是含氮的化合物。凱氏定氮

2、法首先將含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱，經(jīng)一系列的分解、碳化和氧化還原反應(yīng)等復(fù)雜過程，最后有機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)氮硫酸銨，這一過程稱為有機(jī)物的消化。消化完成后，將消化液轉(zhuǎn)入凱氏定氮儀反應(yīng)室，加入過量的濃氫氧化鈉，將NH4+轉(zhuǎn)變成NH3，通過蒸餾把NH3驅(qū)入過量的硼酸溶液接收瓶內(nèi)，硼酸接收氨后，形成四硼酸銨，然后用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直到硼酸溶液恢復(fù)原來的氫離子濃度。滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸摩爾數(shù)即為NH3的摩爾數(shù)，通過計算即可得出總氮量。測定出的含氮量是樣品的總氮量，其中包括有機(jī)氮和無機(jī)氮。以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2+4H2O+NH3 （1） 2NH3 +H2

3、SO4 (NH4)2SO4 （2） (NH4)2SO4+2NaOH2H2O+Na2SO4+2NH3 （3）三、 實驗器材和試劑1、實驗器材：凱氏定氮蒸餾裝置、50ml錐形瓶3個、酸式滴定管、酒精燈2、實驗試劑：濃硫酸、30%氫氧化鈉溶液、2%硼酸指示劑0.2M HCL四、 實驗步驟1、定氮儀的洗滌（1）測定前定氮裝置如下法洗滌23次：從樣品進(jìn)口入加水適量（約占反應(yīng)管三分之一體積）通入蒸汽煮沸，產(chǎn)生的蒸汽沖洗冷凝管，數(shù)分鐘后關(guān)閉夾子P3，使反應(yīng)管中的廢液倒吸流到反應(yīng)室外層，打開夾子P1由橡皮管排出，如此數(shù)次。 （2）用蒸汽洗滌反應(yīng)室約10min后，在冷凝管末端小玻璃管的位置放上一個盛硼酸-指示劑

4、混合液的錐形瓶，將瓶傾斜，以保證冷凝管末端連接的小玻璃管完全浸于液體內(nèi)。繼續(xù)蒸餾12min。觀察錐形瓶內(nèi)溶液是否變色，如不變色，則證明反應(yīng)室內(nèi)部已洗滌干凈；如果混合液變綠，說明定氮儀內(nèi)有殘留氨，沒有洗滌干凈，需要進(jìn)一步用蒸汽洗滌。2、蒸餾（1）準(zhǔn)備工作：蒸餾器洗凈后，開放水龍頭P3，使水進(jìn)入A室，水放至A室球部2/3處即可。取3個50ml的錐形瓶，分別加入10ml硼酸（內(nèi)加有混合指示劑）。用表面皿復(fù)蓋備用。（2）加樣：用移液管吸取2ml消化液，小心地由漏斗D傾入B室，用少量蒸餾水沖洗漏斗D。取一個盛有硼酸的錐形瓶，置于M管下，使管口置于硼酸溶液液面以下，將P4夾緊, 向漏斗D加入30%氫氧化鈉

5、5ml，慢慢松開P4，使氫氧化鈉進(jìn)入B室，但漏斗中始終保持一部分液體封閉，往漏斗加入少量蒸餾水，重復(fù)以上過程，全程都要保持漏斗中的液體封閉。（3）蒸餾：用酒精燈加熱，維持火力恒定，沸騰不可高于Y管口以免A室溶液從Y管倒吸，待第一滴蒸餾液從冷凝柱F頂端滴下時起，繼續(xù)蒸餾5分鐘，然后將錐形瓶放低，使導(dǎo)管離開液面再蒸2分鐘，最后用蒸餾水洗導(dǎo)管外壁，蒸餾完畢，取下錐形瓶準(zhǔn)備滴定。（4）空白蒸餾：用移液管分別吸取2ml蒸餾水按上述操作步驟進(jìn)行蒸餾。3、滴定蒸餾完畢，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定錐瓶內(nèi)溶液，溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榈仙蚧疑礊榻K點。記錄所用鹽酸的量。五、 實驗結(jié)果

6、處理1、實驗數(shù)據(jù) 實驗次序?qū)嶒炘噭?空白2樣品13樣品2蒸餾水/ml100樣液/ml011NaOH/ml555消耗HCl/ml0.050.850.80平均值0.050.8252、計算：若測定的樣品含氮量部分只是蛋白質(zhì)則：樣品的總蛋白含量（%）= 式中：A為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)；B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)；C為稱量樣品的毫升數(shù)；0.2為鹽酸的當(dāng)量濃度（實際上，此項應(yīng)按實驗中使用鹽酸的實際濃度填寫）；14為氮的原子量；6.25為常數(shù);100是配出的100ml消化液；10是面粉質(zhì)量10g樣品的總蛋白含量（%）=由資料知面粉含量如圖該實驗數(shù)據(jù)測得的蛋白質(zhì)量略高出標(biāo)準(zhǔn)值六、 誤差分析與討論

7、1、誤差分析（1）通常情況下，蛋白質(zhì)含氮量在16% 左右，其F 值為6.25。但是，實際上不同來源的蛋白質(zhì)的氨基酸組成差別很大，含氮量的差別也很大，如乳制品、面粉、花生的蛋白質(zhì)含氮量分別為15.67%、17.54% 和 18.32%，則它們的F 值分別為6.38、5.70 和5.46。而計算中取F為6.25，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量值偏大。（2）樣品在空氣中易變質(zhì)；（3）實驗用于滴定的HCl濃度過高，導(dǎo)致空白對照組僅滴定一滴便達(dá)到滴定終點，易產(chǎn)生操作誤差；2、問題討論實驗中應(yīng)該注意些什么？本法適用于0.05-3.0mg氮，樣品中含氮量過高時，則應(yīng)減少取樣量或?qū)右合♂?。勿使樣品粘于燒瓶頸部。放置液體樣品時，需將吸管插至燒瓶底部再放樣：如固體樣品，可將樣品卷在紙內(nèi)，平插入燒瓶底部，然后再將燒瓶直起，紙卷內(nèi)的樣品即完全放在燒瓶底部。參考文獻(xiàn)：中國知網(wǎng)>百科,凱式定氮法GB/T 5009.5 2003 食