【指引與共識(shí)】高通量宏基因組測序技術(shù)檢測病原微生物的臨床應(yīng)用規(guī)范化專家共識(shí)

1、指南與共識(shí)】高通量宏基因組測序技術(shù)檢測病原微生物的臨床應(yīng)用規(guī)范化專家共識(shí)摘要：宏基因組下一代測序（mNGS）技術(shù)直接針對(duì)標(biāo)本中核酸無偏倚檢測病原微生物序列。但是，mNGS需經(jīng)標(biāo)本前處理、核酸提取、文庫制備、上機(jī)測序、數(shù)據(jù)庫比對(duì)、報(bào)告生成及結(jié)果解讀等一系列過程，對(duì)技術(shù)平臺(tái)及人員素質(zhì)要求較高。為規(guī)范mNGS技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用，提高危急重癥、疑難感染性疾病和新發(fā)突發(fā)傳染病的救治水平，在多項(xiàng)國家科技專項(xiàng)的支持下，本領(lǐng)域有關(guān)專家起草了本共識(shí)，以促進(jìn)mNGS技術(shù)的規(guī)范應(yīng)用和良性發(fā)展?？焖贉?zhǔn)確的微生物鑒定技術(shù)始終是臨床微生物關(guān)注的焦點(diǎn)。傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)，諸如形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)、抗原抗體及靶向核酸檢測等方法

2、在解決疑難及未知病原微生物上存在局限性,1,2°新型宏基因組下一代測序（metagenomicsnext-generationsequencing,mNGS）技術(shù)直接針對(duì)樣本中所有核酸進(jìn)行無偏性測序，結(jié)合病原微生物數(shù)據(jù)庫及特定算法，檢測樣本中含有的可能病原微生物序列。隨著該技術(shù)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本不斷降低和技術(shù)的不斷完善，已逐漸從科研走向臨床應(yīng)用，成為臨床疑難和未知病原微生物檢驗(yàn)的重要手段,3O利用mNGS技術(shù)進(jìn)行病原微生物檢測需經(jīng)樣本前處理、核酸提取、文庫制備、上機(jī)測序并滿足測試的質(zhì)量控制要求后，采用特定算法軟件與專用的病原微生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲及非經(jīng)典微生

3、物等的檢測“4,5mNGS技術(shù)不依賴培養(yǎng)，對(duì)常見病原微生物檢驗(yàn)陰性、經(jīng)驗(yàn)治療失敗、不明原因的危急重感染的病原學(xué)診斷以及新發(fā)突發(fā)傳染病的病原體發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特價(jià)值,6,7o為進(jìn)一步規(guī)范mNGS技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用，提高危急重癥和疑難感染性疾病的診療水平，在多項(xiàng)國家科技專項(xiàng)的支持下，參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)、共識(shí)與規(guī)范8,9,o11,12,13,14,15,特別借鑒了高通量測序技術(shù)臨床檢測規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識(shí)（第一版通用部分）,16:組織本領(lǐng)域有關(guān)專家起草了本共識(shí)，以促進(jìn)mNGS技術(shù)的規(guī)范應(yīng)用和良性發(fā)展。本共識(shí)中聲明的內(nèi)容為專家討論并推薦的要點(diǎn)。一、臨床應(yīng)用的基本要求(一)適應(yīng)證基于醫(yī)學(xué)決策的mN

4、GS病原微生物檢測申請，一般用于傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法未能給出明確病原學(xué)結(jié)果從而影響患者準(zhǔn)確診療的感染性疾病、新發(fā)突發(fā)傳染病、驗(yàn)證常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果或排除其他發(fā)熱疾病。推薦臨床通過擬診先行傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)檢測擬診疑似常見病原微生物，不盲目使用mNGS技術(shù)。在必要或緊急情況下，如危急重癥、疑難感染、群體性感染事件等，可考慮作為一線檢測方法。表1列出了mNGS臨床應(yīng)用適應(yīng)性說明。中醫(yī)尸尸：祖巧宸件總昕.LKUMIilASTTEHlTlflU)/w畫強(qiáng)eFCE，除了用曳密奇.胤PD.*1$M7)弓印巴工用廿制M.WM,HAM.*中旭山,再二后鼻里

5、在珀炎埼曲”1、工3RM).人周蛾史口=質(zhì)心.網(wǎng)圖值白用廣：由二七一br±*菱電收入*4寓青，*地車交«.方聯(lián)啟工匚代卜二厘他.圖“整iNiiKii：無M抱手*tie里二總種綻8伍增用.兇紀(jì)由±均*Hn+ilti-Ui.二#*$：=叼NMWL防虐位=.豉=電京也.帕f晅士*二.恐口£二斗=/_坐上比節(jié)內(nèi)餐.王=炎一生宜守格三抗注目在.吃=算修了三毛MEW屈二甫口！制.者帶烹:二*2巴/9C£?f*6S.Hi=FW不&書X*F審理IE用情事無2.靈噌*笆羊五.叁至尊應(yīng)£會(huì)蚤軍九二五五歸五=拈=干二療CI0F酶#年室.=“喉ijI

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7、檢測申t#表：mNG險(xiǎn)測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)提供適合臨床使用的申請表。除患者基本信息外,申請單應(yīng)包括標(biāo)本類型、擬診、現(xiàn)病史、既往史、流行病學(xué)史、關(guān)注的病原體、抗菌藥物使用史等。另外，申請表中應(yīng)列出不同測序項(xiàng)目及適用范圍供醫(yī)生選擇。.靶向基因測序：基于高通量測序技術(shù)的病原微生物檢測，除無偏倚的mNGS卜，還包括原核生物的16SrRNA基因、真菌（5SrRNA基因兩端的ITS1、ITS2及25-28SrRNA基因中的D1及D2區(qū)等）以及特定病原微生物靶基因等17,如懷疑沙眼衣原體可選momp主要外膜蛋白基因），懷疑結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB可選rpoB等靶向基因測

8、序”19,20,21，臨床醫(yī)生通過測序?qū)嶒?yàn)室提供的項(xiàng)目清單選擇適宜的項(xiàng)目，切忌大撒網(wǎng)式排查。.DNA測序與RNAM序的選擇：mNG鼓術(shù)理論上可檢測以核酸為遺傳物質(zhì)的所有病原微生物。若臨床上已排除病毒感染，可直接進(jìn)行DNA測序?？紤]到DNA測序受人源基因組影響較大，為避免因死亡微生物DNA殘留影響現(xiàn)癥感染判斷，可進(jìn)行RNA測序22,雙。當(dāng)懷疑病毒感染，尤其對(duì)呼吸道、腦脊液（cerebrospinalfluid,CSF）及血液標(biāo)本，或臨床表現(xiàn)復(fù)雜，無特定懷疑方向時(shí)，需要同時(shí)對(duì)樣本中的DN解口RNA進(jìn)行測序。mNGS術(shù)本身是一種核酸檢測技術(shù)，由于不同微生物類別本身結(jié)構(gòu)差別，其核酸釋放效率差異明顯，尤

9、其是真菌、分枝桿菌等核酸提取需要特定的破壁處理，對(duì)于疑似真菌或分枝桿菌感染時(shí)也應(yīng)特別提出，在檢測過程中增加必要的樣本處理過程。.mNG即術(shù)的局限性：受臨床mNG豉術(shù)本身、測序成本及數(shù)據(jù)庫等影響，常規(guī)mNG策略常無法獲得樣本中所有微生物的序列，臨床標(biāo)本中低濃度致病微生物可能會(huì)漏檢，同時(shí)針對(duì)特定的耐藥或毒力基因的分析亦較難實(shí)現(xiàn)如果需要對(duì)耐藥基因或毒力基因進(jìn)行分析，可以采用特定方法去除部分人源宿主核酸以提升微生物基因組比例，或者結(jié)合耐藥相關(guān)基因或毒力基因進(jìn)行靶向捕獲富集后進(jìn)行。申請者如有特殊要求應(yīng)加以注明。（二）標(biāo)本類型及采集規(guī)范理論上，凡存在于臨床標(biāo)本中的病原微生物均可通過mNGS僉出，但該技術(shù)的

10、準(zhǔn)確性依賴標(biāo)本中微生物的核酸質(zhì)量及含量，也依賴于不同類別微生物核酸的提取效率。.血液及高凝標(biāo)本：持針器肘靜脈采集35ml實(shí)驗(yàn)室提供專用采血管，即游離DNA羊本保存管，內(nèi)含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA抗凝劑和保護(hù)劑，可抑制血漿中核酸酶及有核細(xì)胞中DNA勺釋放。采血時(shí)皮膚需徹底消毒，采血至刻度，上下顛倒混勻510次，條碼標(biāo)記或編號(hào)。切忌在輸液處或?qū)Ч芴幉杉獦?biāo)本。此外，高凝狀態(tài)的關(guān)節(jié)液、胸腹腔積液，甚至CSF也可采用此方法。如果增加RNA測序應(yīng)同時(shí)采2管。.支氣管肺泡灌洗液及痰液：嚴(yán)格按操作規(guī)程采集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveol

11、arlavagefluid,BALF）,棄去前段可能污染的部分，回收10ml置無菌螺帽管（塑料或玻璃質(zhì)地均可）中，內(nèi)含支氣管末梢和肺泡中的分泌物?？忍禈?biāo)本需在醫(yī)護(hù)人員協(xié)助下，患者用生理鹽水漱口23次，彎腰90°,用力咳出深部痰35ml置無菌螺帽管中。若無法自行咳痰，可通過吸痰器從氣道采集。咽拭子只適用于呼吸道病毒檢測。檢查容器有無滲漏，緊蓋后封口膜密封，條碼標(biāo)記或編號(hào)。1 .CSF、房水及其他體液：經(jīng)?？漆t(yī)生標(biāo)準(zhǔn)化采集方法獲得，無菌螺帽管封口膜密封。CSF（留取第2管或第2管后標(biāo)本）、關(guān)節(jié)腔積液、膽汁等檢測病原微生物DN頌RNA!采集1ml,如同時(shí)進(jìn)行DNAMRNAIU序應(yīng)采集2ml

12、。房水至少采集200科l。骨髓單獨(dú)進(jìn)行DNARNA測序，0.5ml標(biāo)本即可，如果同時(shí)進(jìn)行DNAMRNA測序則至少采集1ml。這些臨床標(biāo)本采集困難，切記防污染，避免經(jīng)引流管采集。胸腹腔積液需富集后提核酸，至少采集10ml2L.膿腫及深部組織：（1）開放性膿腫需清創(chuàng)后采集深部傷口或潰瘍基底部分泌物拭子置無菌管中。（2）封閉的膿腫需對(duì)病灶局部的皮膚或黏膜表面徹底消毒，注射器抽取膿液，若少于3ml,應(yīng)采集最大標(biāo)本量送檢。（3）深部組織感染需手術(shù)取材，置于無菌螺帽瓶中。多數(shù)情況下組織中病原微生物含量低于膿液，盡可能取膿腫邊緣組織。2 .糞便標(biāo)本：至少黃豆粒大小的新鮮標(biāo)本，稀便35ml,置螺帽容器中。3

13、.標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)：若標(biāo)本在24h內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室并開始檢測，可考慮冰袋低溫運(yùn)輸；若運(yùn)輸時(shí)間在2472h內(nèi)，應(yīng)干冰運(yùn)輸，并立刻進(jìn)行標(biāo)本前處理和核酸提??；血液標(biāo)本4C冰箱保存不得超過7d（專用采血管），在運(yùn)輸過程中避免劇烈晃動(dòng)；其他臨床標(biāo)本如需長期保存，應(yīng)按如下原則執(zhí)行：（1）DNA測序：-20C保存不超過7do（2）RNA測序：應(yīng)置-80C。（3）避免標(biāo)本反復(fù)凍融，一般不得超過3次。（4）理論上-80C可長期保存。（5）若懷疑高致病性或新發(fā)突發(fā)傳染病，嚴(yán)格按照國內(nèi)傳染病法等相關(guān)法律要求包裝及轉(zhuǎn)運(yùn)。盡可能在醫(yī)院生物安全防護(hù)條件下抽提核酸后再送測序。建議1原則上，臨床懷疑病原微生物感染，常規(guī)方法未得到明確病原

14、學(xué)證據(jù)而影響臨床救治時(shí)，可利用mNG眥一步確認(rèn)。鼓勵(lì)臨床在排除常見病原微生物后有目的選擇mNGS申請單應(yīng)填寫臨床表現(xiàn)、癥狀體征、治療經(jīng)過、現(xiàn)病史、流行病學(xué)史及既往史等。測序?qū)嶒?yàn)室應(yīng)讓申請者知曉不同類型感染性疾病的標(biāo)本選擇、采集時(shí)機(jī)、采集方式、送檢量、轉(zhuǎn)運(yùn)及儲(chǔ)存條件、不同mNG崎測策略的適用范圍。疑為傳染病應(yīng)符合國家相關(guān)生物安全標(biāo)本采集及轉(zhuǎn)運(yùn)要求。申請者可提出重點(diǎn)關(guān)注的病原體，如呼吸道病毒、結(jié)核分枝桿菌、真菌及寄生蟲等。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)提供適宜臨床使用的申請單，內(nèi)容應(yīng)包括不同mNG瓢U序策略及對(duì)應(yīng)的適應(yīng)證。（三）報(bào)告解讀原則目前病原微生物的確認(rèn)依然遵循Koch法則，即：（1）該微生物存在于同類疾病患者中

15、，健康個(gè)體則無此微生物。（2）該微生物必須能夠被分離、培養(yǎng)、純化。（3）該微生物接種于易感動(dòng)物可引起相同疾病，并可從被接種的動(dòng)物體內(nèi)分離到此微生物。（4）該微生物可引起每一個(gè)個(gè)體發(fā)病,25二但是，作為一種臨床檢驗(yàn)方法，利用mNGSt認(rèn)的感染病例并不能夠完全滿足傳統(tǒng)Koch法則，作為該法則的補(bǔ)充，mNGSI有如下特征。.mNG骷果分析：理論上，凡存在于標(biāo)本中的微生物均可檢出，但因不同類型微生物基因組長度和測序平臺(tái)等差異，導(dǎo)致無法針對(duì)所有微生物建立統(tǒng)一的陰陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)7'26,27,28:實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途、標(biāo)本類型、檢測目標(biāo)和技術(shù)特點(diǎn)，建立并驗(yàn)證陽性閾值及判讀標(biāo)準(zhǔn)。原則上mNGS勺臨床

16、意義同核酸檢測。另外，決定一個(gè)序列是否來自于某種微生物，很大程度上取決于用于比較的參考微生物序列數(shù)據(jù)庫，如果數(shù)據(jù)庫中未包括該物種以及與其進(jìn)化距離較近物種的基因組序列可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。.mNG骷果確認(rèn)：如果檢出的微生物符合疾病特征則可能是引起感染的病原微生物，但不能只從序列數(shù)多少確認(rèn)，需考慮序列在基因組上的覆蓋度、特異性及保守性"”。該病原微生物可通過PCR等方法得到驗(yàn)證，如呼吸道標(biāo)本中的流感病毒、腺病毒及新冠病毒等；糞便標(biāo)本中的志賀菌、沙門菌及諾如病毒等；CSF中的腸病毒、單純皰疹病毒及西尼羅河病毒等；血液中的布魯菌、巴爾通體及人類免疫缺陷病毒等。如果檢出高序列數(shù)的某種未命名微生物

17、，應(yīng)高度警惕新物種的出現(xiàn)。.mNGS陽性閾值及判讀標(biāo)準(zhǔn)：報(bào)告單中的陽性閾值以百萬分子序列數(shù)確定。陽性閾值的確定不依賴某個(gè)單一的指標(biāo)，包括但不限于特定微生物的檢出序列數(shù)、歸一化每百萬序列（readspermillion,RPM）的比值、檢出物種的基因組覆蓋度等。病毒因極少存活于環(huán)境中，因此，少量的特異序列檢出即可判為陽性（如少于3條特異序列）26O避免報(bào)出與臨床不相關(guān)的環(huán)境菌、共生菌及條件致病菌等。一般序列數(shù)越高病原微生物的可能性越大（數(shù)十條特異性序列）。對(duì)于結(jié)核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌、布魯菌等臨床關(guān)注度高、且較難檢測的病原菌可采用獨(dú)立的判讀標(biāo)準(zhǔn)，即檢出1條特異序列即可判為陽性”。寄生蟲基因組因

18、較為復(fù)雜，且與人源基因組相似，應(yīng)在嚴(yán)格確認(rèn)序列特異性之后再行判讀14o如果檢出序列為新發(fā)物種，則可不受閾值限制，但需給出同源性比對(duì)結(jié)果。.微生物種群致?。簾o菌部位膿腫標(biāo)本可見多種病原微生物共檢出現(xiàn)象。如腦膿腫、頸間隙膿腫、咽旁膿腫、口腔膿腫等，所檢出的微生物序列數(shù)均可能達(dá)到陽性閾值，多數(shù)為嚴(yán)格厭氧菌與兼性厭氧菌共生。這種因微生物種群而致病的現(xiàn)象稱為一個(gè)種群或一個(gè)微生物生態(tài)系統(tǒng)引起一種疾病，而非Koch法則的一種病原菌引起一種疾病。盡管種群致病的理論還需進(jìn)行深入探討，但隨著深度測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，這種現(xiàn)象在臨床上將得到更多驗(yàn)證29o.不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)微生物的結(jié)果驗(yàn)證：mNGSt對(duì)標(biāo)本中所有病原微

19、生物核酸序列，不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)微生物不能通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法再現(xiàn)，且這類病原微生物同樣缺乏血清學(xué)或抗原檢測。除病毒、螺旋體、立克次體、寄生蟲外，這些微生物可通過核酸檢測驗(yàn)證，測序同樣是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。.致病菌、定植菌和污染菌：當(dāng)確定條件致病菌為病原菌時(shí)應(yīng)考慮患者免疫狀態(tài)、基礎(chǔ)疾病及標(biāo)本來源。若出現(xiàn)大量背景菌或雜菌序列而無主導(dǎo)微生物應(yīng)首先考慮污染，其次考慮條件致病菌。如果外科手術(shù)或其他有創(chuàng)操作后，無菌部位來源的標(biāo)本，表現(xiàn)為細(xì)菌單一，序列數(shù)可能不高，應(yīng)結(jié)合臨床考慮醫(yī)院感染，此時(shí)應(yīng)與背景菌區(qū)分，不可一味認(rèn)為污染。mNG加能區(qū)分微生物是定植還是感染。mNGS僉測陰性對(duì)排除感染有意義，但也應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)作出正

20、確的診斷14'28。.高度傳染性微生物：針對(duì)具有高度傳染性的特殊病原微生物，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)相關(guān)衛(wèi)生行政部門的規(guī)定制定特殊報(bào)告程序，標(biāo)本上傳疾病預(yù)防控制中心（CenterforDiseaseControlandPrevention,CDC,如當(dāng)出現(xiàn)像疑似O1群或O139群霍亂弧菌、鼠疫耶爾森菌、埃博拉病毒或新型病原微生物等，應(yīng)盡快采用其他方法驗(yàn)證，如PCR血清學(xué)等，如果支持測序結(jié)果應(yīng)迅速反饋臨床和CDC系統(tǒng)。.提高測序深度：mNGST規(guī)數(shù)據(jù)量對(duì)耐藥和毒力基因檢測有局限性8'30,因其得到的微生物序列數(shù)不足樣本總序列的5%特異性序列覆蓋度不到微生物基因組1%在這種情況下進(jìn)行耐藥基因、

21、毒力島基因、轉(zhuǎn)錄組及代謝通路分析幾乎不可能。目前，有以下幾種做法可提高測序深度：（1）在常規(guī)測序深度下已明確了病原微生物，再提高測序數(shù)據(jù)量至可覆蓋該物種基因組80%但花費(fèi)巨大不適合普及。（2）在宏基因組基礎(chǔ)上疊加固定的若干種耐藥基因進(jìn)行靶向測序。（3）研發(fā)降低人源核酸比例的創(chuàng)新方法，獲得更多微生物測序數(shù)據(jù)量""31o建議2mNGS乍為一種新型檢測方法，其臨床意義仍未超出核酸檢測范疇，它補(bǔ)充了傳統(tǒng)病原微生物確認(rèn)的Koch法則。mNGST檢測難培養(yǎng)、罕見或新發(fā)病原微生物，可同時(shí)給出多種病原微生物信息，因此，在一份無菌部位來源的臨床標(biāo)本（尤其膿腫）中檢出微生物種群（包括不同類別或

22、同類不同種屬）不應(yīng)輕易視為污染。如果這些微生物的存在符合臨床診斷，應(yīng)給予抗菌藥物全覆蓋，這恰好體現(xiàn)了該技術(shù)對(duì)全面認(rèn)識(shí)病原微生物的優(yōu)越性。mNGST規(guī)數(shù)據(jù)量對(duì)耐藥和毒力基因檢測有局限性，如需耐藥和致病信息需提高測序數(shù)據(jù)量。建議3如果檢出的病原微生物符合臨床預(yù)期，應(yīng)確認(rèn)序列結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性。為提高結(jié)果的特異性，降低錯(cuò)誤率，即使病原微生物也應(yīng)建立陽性閾值。陽性閾值建立在微生物特異序列數(shù)及其在基因組覆蓋度上。臨床醫(yī)生在解讀條件致病菌時(shí)，應(yīng)排除污染和背景微生物，考慮患者免疫狀態(tài)及與臨床表現(xiàn)的符合性。mNGS吉果不能作為臨床決策的唯一依據(jù)，結(jié)果陰性也需結(jié)合臨床排除感染。二、mNGS檢測病原微生物的實(shí)驗(yàn)

23、室要求mNGS是NGS技術(shù)的一種，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用邊合成邊測序方法32二該方法使單個(gè)DNA分子擴(kuò)增成大量相同的DNA,然后同步復(fù)制，以此增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度，從而讀出DNA序列。因此，mNGS具有通量高、讀長短、流程復(fù)雜、操作環(huán)節(jié)多、對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境及人員要求高的特點(diǎn)。因此，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)施要求高，需要嚴(yán)格遵守臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法的相關(guān)規(guī)定。（一）實(shí)驗(yàn)室分區(qū)及人員要求.基本原則：即各區(qū)獨(dú)立、注意風(fēng)向、因地制宜、方便工作，以達(dá)到工作有序、互不干擾、防止污染、報(bào)告及時(shí)16。mNGS僉測分“干、濕實(shí)驗(yàn)”，“濕實(shí)驗(yàn)”指從樣本處理到測序數(shù)據(jù)產(chǎn)生的整個(gè)測序過程，需要在標(biāo)準(zhǔn)的測序分區(qū)實(shí)驗(yàn)室完成。一般“測試分區(qū)

24、實(shí)驗(yàn)室”分試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理與核酸提取區(qū)、文庫構(gòu)建區(qū)及測序區(qū)?！案蓪?shí)驗(yàn)”指測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析。.單向工作流程：若實(shí)驗(yàn)室設(shè)有緩沖間，緩沖間統(tǒng)一為正壓或負(fù)壓。若未設(shè)緩沖間，從試劑準(zhǔn)備區(qū)到測序區(qū)壓力依次遞減。為避免相互干擾，DNARNAB作（核酸提?。?yīng)分開。如在同一實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分兩個(gè)區(qū)域，主要儀器耗材包括生物安全柜、核酸提取儀、移液槍、離心機(jī)、試劑及耗材等不可混用。如使用瓊脂糖凝膠電泳檢查核酸及文庫質(zhì)量，則需有單獨(dú)的電泳區(qū)。靶向測序PCRS在單獨(dú)的擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行3”。.污染防控：應(yīng)定期進(jìn)行環(huán)境評(píng)估，為了監(jiān)控污染需制定試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)室物表定期消毒的標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序（standardoperationp

25、rocedure,SOP。還應(yīng)對(duì)無模板參考品或陽性對(duì)照中可能出現(xiàn)的污染物進(jìn)行連續(xù)跟蹤，并使用保守的閾值標(biāo)準(zhǔn)（見第一章第三部分報(bào)告解讀原則3）,最大程度減少假陽性結(jié)果產(chǎn)生9o.實(shí)驗(yàn)室人員能力：實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)參加相關(guān)培訓(xùn)，并獲得國家要求的相應(yīng)資質(zhì)27'34。檢驗(yàn)人員應(yīng)具備mNG頷目制定和質(zhì)量控制能力。報(bào)告簽發(fā)人員應(yīng)具備臨床醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)和分子生物學(xué)背景，掌握相關(guān)臨床診療指南。疑難報(bào)告的簽發(fā)及結(jié)果解釋需咨詢相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜?。開展mNG氧驗(yàn)室自建檢測項(xiàng)目(laboratory-developedtests,LDT)的實(shí)驗(yàn)室同時(shí)還應(yīng)具備生物信息學(xué)分析的專業(yè)人員，生物信息學(xué)分析人員需熟練掌握mNG驗(yàn)測原

26、理及生物信息軟件，具備數(shù)據(jù)信息維護(hù)和管理、開發(fā)新算法及更新數(shù)據(jù)庫的能力。建議4微生物檢測非靶向mNG氧驗(yàn)室至少應(yīng)包括試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫制備區(qū)及測序區(qū)。實(shí)驗(yàn)室工作流程應(yīng)為單向。若實(shí)驗(yàn)室設(shè)有緩沖間，緩沖間統(tǒng)一為正壓或負(fù)壓。若未設(shè)緩沖間，壓力從試劑準(zhǔn)備區(qū)到測序區(qū)依次遞減。DN用口RNAK酸提取分區(qū)域進(jìn)行。若開展靶向擴(kuò)增NGS1序，應(yīng)額外增加擴(kuò)增區(qū)及電泳區(qū)。若同時(shí)開展遺傳及腫瘤NGS核酸提取及建庫過程不宜與之混用。報(bào)告簽發(fā)人員應(yīng)具備臨床醫(yī)學(xué)、病原微生物或分子生物學(xué)背景，罕見病原微生物結(jié)果解釋可咨詢相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜?。若配備有生物信息學(xué)分析人員，需掌握mNGS微生物檢測軟件應(yīng)用，具備數(shù)據(jù)信息維護(hù)和管

27、理、開發(fā)新算法及更新數(shù)據(jù)庫的能力。1 (二)檢測平臺(tái).建立標(biāo)本前處理及核酸提取方法：標(biāo)本預(yù)處理方法和核酸提取技術(shù)在使用前需經(jīng)過驗(yàn)證。.測序平臺(tái)的選擇：包括儀器設(shè)備的選擇、測序平臺(tái)質(zhì)量的評(píng)價(jià)及主流測序平臺(tái)類型3個(gè)方面。配備開展高通量測序檢測項(xiàng)目所需的所有儀器設(shè)備：優(yōu)先選擇國家藥品監(jiān)督管理局(NationalMedicalProductsAdministration,NMPA批準(zhǔn)的測序平臺(tái)和配套試劑。測序平臺(tái)應(yīng)達(dá)到臨床預(yù)期：除開展?jié)M足臨床需求的項(xiàng)目外，測序通量、序列的準(zhǔn)確率、支持讀長、儀器性能驗(yàn)證、內(nèi)部質(zhì)控、測序周期及批量檢測能力等也是評(píng)價(jià)測序平臺(tái)質(zhì)量的重要指標(biāo)。主流測序平臺(tái)：目前，mNGS主流測

28、序方法有邊合成邊測序、DNA納米球測序及半導(dǎo)體測序。實(shí)驗(yàn)室根據(jù)需要選擇適宜的檢測平臺(tái)，使用模擬樣本或臨床已知微生物樣本驗(yàn)證測序全流程。表2列出了不同類型測序平臺(tái)的技術(shù)特點(diǎn)及環(huán)境要求。.自動(dòng)化測序平臺(tái)：mNGSi：生物檢測的靈敏度與標(biāo)本背景有關(guān)，如組織標(biāo)本中含有大量人源基因組，導(dǎo)致微生物序列數(shù)占比減少，通過高效自動(dòng)化測序平臺(tái)，增加測序深度可提高檢測靈敏度。自動(dòng)化過程降低人工操作、減低外源污染，實(shí)驗(yàn)室分區(qū)簡化。已有文獻(xiàn)報(bào)道實(shí)現(xiàn)了血液、CSR尿液等標(biāo)本，從文庫構(gòu)建到報(bào)告發(fā)放全自動(dòng)化過程,雙。自動(dòng)化平臺(tái)應(yīng)包括標(biāo)本前處理、核酸提取、文庫構(gòu)建、高通量測序、生物信息分析和報(bào)告發(fā)送。（三）生物信息平臺(tái)生物信息

29、學(xué)分析（也稱“干實(shí)驗(yàn)”）是mNGS僉測中的重要部分，是對(duì)測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，包括但不限于數(shù)據(jù)質(zhì)控、人源序列比對(duì)過濾、微生物物種檢測等過程35,36,37目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)分析程序及軟件。數(shù)據(jù)分析流程由多種分析軟件配套完成，包括數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件（如Fastp、Trimmomatic、FastQC等）、比對(duì)軟件（如Bowtie2、BWAMAQSOAP2Blast等）、物種分析軟件（如SURPITaxonomer、MegaBLAST?）38,39二人源基因組和微生物基因組檢測數(shù)據(jù)庫有美國國家生物技術(shù)信息中心、美國病原體系統(tǒng)資源整合中心,4“、真核生物病原體數(shù)據(jù)庫41及病毒病原數(shù)據(jù)分析

30、資源庫42,等，在構(gòu)建物種比對(duì)數(shù)據(jù)庫時(shí)可予以選擇，還有耐藥基因分析可考慮抗性基因數(shù)據(jù)庫43,44,3，毒力基因分析可使用毒力基因分析數(shù)據(jù)庫46,47等。隨著mNG彳品的體外診斷化發(fā)展，結(jié)合人工智能技術(shù)的自動(dòng)化的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)已經(jīng)能夠提供給臨床實(shí)驗(yàn)室。建議5實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建mNG皴術(shù)平臺(tái)以擬開展的檢測項(xiàng)目及科研工作為依據(jù)，充分論證不同檢測平臺(tái)的適用性，包括生物信息平臺(tái)。技術(shù)平臺(tái)的建設(shè)應(yīng)包含標(biāo)本處理、核酸提取、文庫構(gòu)建（DN解口RNA文庫）、高通量測序、核酸擴(kuò)增、產(chǎn)物分析、數(shù)據(jù)分析等全流程。采用模擬樣本或臨床已知病原體樣本對(duì)所有技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行驗(yàn)證，包括檢測靈敏性、測序通量、序列質(zhì)量、讀取準(zhǔn)確率、支持讀長、儀

31、器性能驗(yàn)證、內(nèi)部質(zhì)控、測序周期及生物學(xué)信息分析能力。比對(duì)數(shù)據(jù)庫應(yīng)滿足各類微生物檢測需求。三、mNGS微生物檢測方法的建立（一）標(biāo)本前處理標(biāo)本液化、濃縮及去除宿主核酸等前處理方法和設(shè)備使用應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。所有標(biāo)本應(yīng)具有唯一標(biāo)識(shí)，防止在信息錄入和標(biāo)本分揀過程中交叉污染。根據(jù)申請要求提前準(zhǔn)備被檢測微生物所需的文庫資料及生物信息分析軟件。建立臨床標(biāo)本的前處理程序，包括復(fù)雜標(biāo)本、微量標(biāo)本和組織標(biāo)本的前處理程序，針對(duì)真菌和/或分枝桿菌等特殊微生物的破壁處理程序。建立RNA病毒、微生物游離核酸測序的前處理方法。建立組織標(biāo)本研磨方法，具體方法見表3。（二）核酸提取.使用經(jīng)性能確認(rèn)的核酸提取試劑：臨床標(biāo)本中存在不同類

32、型的病原微生物，核酸提取方法的可重復(fù)性和提取效率對(duì)保證核酸的完整性及純度至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)臨床標(biāo)本類型和微生物種類建立針對(duì)性的標(biāo)準(zhǔn)化提取程序。建議使用經(jīng)性能驗(yàn)證的商品化提取試劑及設(shè)備。1 .核酸質(zhì)量驗(yàn)證：（1）高質(zhì)量的DNAA60/A80應(yīng)在1.71.9,A260/A230應(yīng)2,可用1面脂糖凝膠電泳驗(yàn)證DNA質(zhì)量（無雜帶、無拖尾、背景無蛋白污染）。（2）DNA完整性（如Agilent2100Bioanalyzer）檢測，如果大部分片段在200nt（血漿游離DN喉外，140nt）以下說明DNA降解嚴(yán)重，需重提。（3）高質(zhì)量的RNAAWA280應(yīng)在1.82.0,A260/A230應(yīng)2。（4）微

33、量的核酸采用Qubit熒光染料法進(jìn)行定量測定15o.核酸含量極低樣本的處理：如CSF房水等，應(yīng)在標(biāo)本中加50。ATL（DR研磨珠，低頻震蕩10min,離心后取150口。加入150口裂解?和8口蛋白酶K,渦旋震蕩混勻30s,56C恒溫震蕩15min（若無恒溫震蕩儀，可用金屬浴代替，期間每3min混勻1次）；取裂解后的樣本300小，加入磁珠240小，震蕩混勻，室溫靜置5min,上清提核酸。按照商品化的操作說明進(jìn)行。.去除人源DNA的方法：多數(shù)臨床標(biāo)本存在大量宿主細(xì)胞和宿主游離核酸，微生物核酸豐度相對(duì)較低。因此，在核酸提取環(huán)節(jié)中可考慮建立高效去宿主DNA法，提高mNG激生物檢測的靈敏度4l48去除人

34、源核酸的方法選擇需要結(jié)合臨床檢測目的，舉例如下。去污劑處理：因人源細(xì)胞的細(xì)胞膜較微生物外壁脆弱，在核酸提取前用溫和去污劑（如皂甘）裂解宿主細(xì)胞釋放DNA再用脫氧核糖核酸酶I降解人源DNA通常可使微生物富集效率提高1000倍49。DNA8,低滲溶液破壞宿主細(xì)胞：使用細(xì)胞膜不透性的疊氮碘化丙錠結(jié)合暴露在溶液中的宿主DNA使抗甲基化DNAf珠：因人源DNA甲基化程度高，大多數(shù)微生物基因組中缺乏甲基化用抗甲基化DNA磁珠可有效去除人源DNA可實(shí)現(xiàn)35倍富集雙。2 使用CRISPR-Cas9（基因編輯技術(shù)）剝離目標(biāo)序列：此法對(duì)構(gòu)建RNA文庫較為有利，可提高非編碼rRNA序列含量，但對(duì)DN成庫構(gòu)建意義不大

35、，不推薦花費(fèi)更大財(cái)力去除全部人源DNA.qPCR預(yù)估人源核酸的去除效率：去除宿主DNA后，對(duì)宿主及微生物常用的標(biāo)志基因，如3肌動(dòng)蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因和16SrRNA基因等，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitativereal-timePCRqPCR定量檢測，通過經(jīng)驗(yàn)積累大概預(yù)估宿主殘余比例及有效數(shù)據(jù)比例，必要時(shí)可提高測序數(shù)據(jù)量。（三）文庫制備文庫制備是將基因組DNA片段化并在片段末端連接寡核甘酸接頭的過程，文庫質(zhì)量直接影響測序數(shù)據(jù)質(zhì)量。目前常用的建庫方法有超聲波打斷建庫、酶切建庫及轉(zhuǎn)座酶建庫等，選用操作簡單的方法對(duì)降低污染有利。.明確核酸質(zhì)量及文庫產(chǎn)出標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)室根據(jù)文庫制

36、備方法及測序平臺(tái)明確起始核酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（純度、濃度）及文庫產(chǎn)出標(biāo)準(zhǔn)（文庫濃度、片段大小等）。.建議使用配套試劑：若起始DNA10ng以上，可采用普通建庫試劑盒；若DNAa100pg10ng之間，則采用超微量DNA建庫試劑盒；若DNA量低于下限，應(yīng)先行全基因組擴(kuò)增，再進(jìn)行建庫。.構(gòu)建RN成庫：逆轉(zhuǎn)錄前需在冰上操作，防止RNA條解。應(yīng)添加RNAB抑制劑，必要時(shí)在建庫前采用雜交捕獲法或核糖體分離法去除rRNA。.文庫質(zhì)量：可采用Qubit熒光染料法檢測文庫濃度，qPCR檢測文庫中有效連接接頭的核酸濃度。上機(jī)前需根據(jù)不同的測序平臺(tái)對(duì)文庫濃度的要求進(jìn)行。高質(zhì)量的文庫DNA其A60/A280通常在1.752

37、.00。此外，還應(yīng)采用生物分析設(shè)備檢測文庫片段大小及峰型，文庫片段大小為插入片段和接頭序列的總長度，合格文庫插入片段長度大于100bp,文庫應(yīng)主峰明顯、無雜峰、無接頭、無引物二聚體15o建議6實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備針對(duì)不同類型臨床標(biāo)本的前處理方法，尤其針對(duì)復(fù)雜和極微量標(biāo)本應(yīng)具備經(jīng)驗(yàn)證的靈敏的手段。無論DNA還是RNA核酸提取質(zhì)量應(yīng)滿足測序要求。在核酸提取的過程中應(yīng)引入經(jīng)驗(yàn)證的降低人源核酸處理方法。推薦使用配套試劑構(gòu)建文庫，根據(jù)初始核酸濃度選擇文庫建庫試劑盒，若DNA量低于下限應(yīng)先行全基因組擴(kuò)增再進(jìn)行建庫，文庫核酸濃度、純度及長度應(yīng)達(dá)到測序（包括靶向測序和宏基因組測序）要求。文庫制備方法需用已知臨床標(biāo)本或

38、模擬樣品或質(zhì)控品進(jìn)行驗(yàn)證或開展實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，合格后方可用于臨床。（四）上機(jī)測序測序數(shù)據(jù)量指每個(gè)樣本測序所得的序列數(shù)或堿基數(shù)（nt）,二者可相互轉(zhuǎn)換，一般宏基因組測序用序列數(shù)表示。測序數(shù)據(jù)量與預(yù)期用途（如微生物檢測、耐藥基因檢測、微生物組學(xué)分析、宏基因組學(xué)分析等）、樣本中微生物與人源核酸占比、測序靈敏度以及測序成本等因素相關(guān)。mNGSi：生物檢測的靈敏度與標(biāo)本人源核酸含量有關(guān)，不同類型臨床樣本人源核酸平均含量不一樣，為保證結(jié)果可靠性，在相同樣本處理和核酸提取方法時(shí)，通常不同類型臨床標(biāo)本推薦不同測序數(shù)據(jù)量，原則上背景簡單的標(biāo)本如CSR血漿等（人源核酸含量低）較低的測序數(shù)據(jù)量即可滿足病原微生物檢出。

39、在條件允許的情況下可增加測序數(shù)據(jù)量以提高檢測靈敏度?？赏ㄟ^數(shù)據(jù)抽樣，即從下機(jī)數(shù)據(jù)中（如20M）隨機(jī)抽取15M組成一個(gè)模擬的15M測序數(shù)據(jù)集模擬分析不同測序數(shù)據(jù)量、不同物種的檢測限，從而最終確定不同標(biāo)本類型的最佳測序數(shù)據(jù)量。通常靶向測序的數(shù)據(jù)量應(yīng)A3萬條序列，宏基因組測序鳥槍法測序數(shù)據(jù)量應(yīng)R2000萬（20million,20M）高質(zhì)量序列，準(zhǔn)確度Q30比例R85%也有文獻(xiàn)推薦CSF600萬條（6M）序列26一、血液游離DNA2400萬條序列（24M）皿、咽拭子病毒檢測1000萬條（10M序列等。測序數(shù)據(jù)量提升可顯著提高靈敏度，以血流感染為例，每個(gè)標(biāo)本平均20M序列時(shí)，總體靈敏度為31%,每個(gè)標(biāo)

40、本平均24M序列時(shí)，總體靈敏度達(dá)到48%雙，當(dāng)每個(gè)標(biāo)本平均數(shù)據(jù)量達(dá)到33M序列時(shí)，總體靈敏度達(dá)到71%53。（五）生物信息學(xué)分析生物信息分析是對(duì)測序得到的原始序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理的過程，以預(yù)定程序執(zhí)行。該流程由多個(gè)軟件組成，包括去除人源序列、處理微生物序列及相關(guān)元數(shù)據(jù)、檢測候選目標(biāo)微生物，實(shí)現(xiàn)檢測與數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)分析中應(yīng)考慮預(yù)期用途、軟硬件功能、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)位置、版本號(hào)及信息備份等。同時(shí)應(yīng)確?；颊咝畔踩?，設(shè)置讀取規(guī)則、人員權(quán)限、數(shù)據(jù)異常提取的警報(bào)。目前已經(jīng)具有商業(yè)化的自動(dòng)分析系統(tǒng)可以選擇，實(shí)驗(yàn)室也可選擇與國際同步的算法和軟件，搭建實(shí)驗(yàn)室自己的分析流程，搭建過程中應(yīng)選已知陰陽性樣本或質(zhì)控品進(jìn)行

41、生物信息學(xué)分析能力模擬測試。.序列質(zhì)量：堿基質(zhì)量值是衡量測序質(zhì)量的重要指標(biāo)，用于評(píng)估下機(jī)序列數(shù)的準(zhǔn)確度。質(zhì)量值（Q越高代表堿基被測錯(cuò)的概率（P）越低，兩者關(guān)系為Q=-10lgP。Q20對(duì)應(yīng)的測序錯(cuò)誤概率為1%準(zhǔn)確率99%Q30對(duì)應(yīng)的測序錯(cuò)誤概率為1%o、準(zhǔn)確率99.9%。常用Q20和Q30分別代表質(zhì)量值R20或30的堿基所占百分比。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)要求保證Q30至少達(dá)到85%在對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析之前，應(yīng)首先進(jìn)行質(zhì)量控制，去除讀長過短（如<50bp）和低質(zhì)量的序列，獲得的高質(zhì)量序列再與人源基因組比對(duì)去除，剩余序列進(jìn)入后續(xù)的微生物檢測分析11,14,151O.判讀標(biāo)準(zhǔn)：判讀標(biāo)準(zhǔn)與測序數(shù)據(jù)量密切相關(guān)，

42、在生物信息學(xué)分析流程搭建和優(yōu)化過程中，應(yīng)確定判讀標(biāo)準(zhǔn)，以區(qū)分陰陽性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)不同類型的臨床標(biāo)本和不同類型微生物建立不同的判讀標(biāo)準(zhǔn)。判讀標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括但不限于檢出序列數(shù)、基因組覆蓋度、微生物豐度、測序深度、離散度、RPM匕值等技術(shù)指標(biāo)雙。高通量測序得到的是大量短序列（通常在100bp以內(nèi)），因此，當(dāng)序列比對(duì)到參考序列時(shí)，如同時(shí)出現(xiàn)人源和某種微生物，則優(yōu)先判為宿主序列。判讀為某微生物屬水平的序列數(shù)應(yīng)大于種水平。當(dāng)種水平序列數(shù)越接近屬水平，則該物種的可能性越高。比對(duì)到微生物的序列數(shù)與基因組測序覆蓋度呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)基因組覆蓋度、序列特異性等參數(shù)計(jì)算出病原微生物檢測可信度（%,便于臨床判斷。其

43、他判讀方法：有文獻(xiàn)通過自建參考品先設(shè)定判讀標(biāo)準(zhǔn)，再采用臨床標(biāo)本進(jìn)行判讀標(biāo)準(zhǔn)的確認(rèn)。也有文獻(xiàn)通過檢測一定數(shù)量的已知陰陽性樣本，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，如受試者工作特征曲線或準(zhǔn)確率-召回率（precision-recall,PR）曲線來確定合理的判讀標(biāo)準(zhǔn)皿。.陽性閾值：判讀為陽性的界值即為陽性閾值。閾值的設(shè)置與檢出序列數(shù)、檢出序列的特異性、特異序列的基因覆蓋度、該物種同源性復(fù)雜程度以及檢測靈敏度有關(guān)。即使病原微生物也應(yīng)制定陽性閾值。針對(duì)某些特殊傳染病病原微生物，在排除污染的前提下，即使檢出1條序列也應(yīng)視為陽性，如MTB鼠疫耶爾森菌及流行性出血熱病毒等“29。.數(shù)據(jù)庫：包含兩個(gè)部分，即微生物檢測數(shù)據(jù)庫和人源

44、數(shù)據(jù)庫。微生物檢測數(shù)據(jù)庫包含細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲基因組序列信息，其中支原體、衣原體、螺旋體、立克次體視情況可獨(dú)立也可并入細(xì)菌類別中。公共數(shù)據(jù)庫需經(jīng)驗(yàn)證方可使用。構(gòu)建微生物數(shù)據(jù)庫應(yīng)優(yōu)先選擇全長參考基因組以及測序質(zhì)量高、樣本來源、臨床信息完整的序列。臨床重要的病原微生物應(yīng)入選具有時(shí)間和地域代表性的毒菌株基因組。有條件應(yīng)構(gòu)建科研數(shù)據(jù)庫二級(jí)數(shù)據(jù)，以確保重要的病原微生物不錯(cuò)報(bào)、不漏報(bào)。人源數(shù)據(jù)庫是為去除人源序列干擾而設(shè)計(jì)，包含染色體基因組、線粒體基因組及轉(zhuǎn)錄組等序列信息。收錄的信息應(yīng)確保準(zhǔn)確、完整、有詳細(xì)注釋，不是越多越好。推薦采用模擬數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)據(jù)庫的有效性進(jìn)行驗(yàn)證（見本文第四章第三節(jié)分析性能確認(rèn)）5

45、6。1 .具備數(shù)據(jù)庫更新能力：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)持續(xù)跟蹤使用版本的數(shù)據(jù)庫。應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集對(duì)更新后的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。6,建立背景微生物數(shù)據(jù)庫：mNGST能含有多種微生物信息，其中不乏正常菌群、污染微生物及背景微生物。應(yīng)建立人體不同部位正常種群數(shù)據(jù)庫，并納入報(bào)告分析解讀流程。雖然有些微生物存在于標(biāo)本中，但與疾病無關(guān)，應(yīng)在報(bào)告中去除或說明。此外，mNGSf程中所用的各種試劑中也可能存在微生物個(gè)體或核酸，應(yīng)建立試劑背景微生物序列數(shù)據(jù)庫，在報(bào)告中予以去除。7.建立錯(cuò)誤數(shù)據(jù)彳正機(jī)制：mNG麗樣存在測序錯(cuò)誤的情況，因此需去除原始下機(jī)數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量序列，包括測序接頭污染的序列、質(zhì)量值低的

46、序列及短重復(fù)序列等。由于mNG的批量標(biāo)本平行上機(jī)測序，難以完全避免標(biāo)簽跳躍，應(yīng)通過技術(shù)手段與分析流程防止高拷貝微生物序列污染平行上機(jī)樣本。建議7實(shí)驗(yàn)室需通過已知標(biāo)本確立不同類型標(biāo)本個(gè)性化的測序數(shù)據(jù)量、驗(yàn)證序列質(zhì)量值、確定判讀標(biāo)準(zhǔn)及不同類型微生物陽性閾值。在進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)掌握如下原則：序列比對(duì)一致性相同優(yōu)先考慮人源序列，該序列與數(shù)據(jù)庫中微生物種屬匹配度高、屬水平序列數(shù)大于種水平、種序列數(shù)越接近屬水平則確認(rèn)該種的可能性越大、結(jié)果的可靠性與基因組覆蓋度成正比、低于陽性閾值的病原微生物不可輕易放過，需結(jié)合臨床或復(fù)檢或重留標(biāo)本再測。建議8實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用國際公認(rèn)或經(jīng)驗(yàn)證或文獻(xiàn)推薦的公共數(shù)據(jù)庫，包括人源數(shù)據(jù)庫

47、與微生物數(shù)據(jù)庫。實(shí)驗(yàn)室可在臨床用庫的基礎(chǔ)上建立二級(jí)科研數(shù)據(jù)庫，以便應(yīng)對(duì)罕見或新發(fā)微生物。建立生物信息學(xué)分析程序并進(jìn)行性能確認(rèn)，確定測序數(shù)據(jù)量與不同類型微生物的判讀標(biāo)準(zhǔn)。生物信息學(xué)分析程序滿足預(yù)期檢測性能參數(shù)，結(jié)果應(yīng)符合預(yù)期要求。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立監(jiān)測生物信息學(xué)分析程序，記錄分析流程中各組分改變或版本更新（如軟件升級(jí)、數(shù)據(jù)庫更新、腳本更改等），定義流程及數(shù)據(jù)庫的版本號(hào)，以保證報(bào)告的可溯源性。（六）檢驗(yàn)報(bào)告.基本要求：過濾后的序列才可用于微生物檢測報(bào)告，用于種屬檢測的短序列應(yīng)為特異序列，特異序列作為最后報(bào)告的陽性閾值。正式報(bào)告單應(yīng)包括測序總序列數(shù)、內(nèi)標(biāo)檢測數(shù)據(jù)量、檢測病原微生物列表、檢出病原特異序列數(shù)量

48、、檢測病原范圍、測序數(shù)據(jù)質(zhì)量、檢測方法及檢測技術(shù)說明。同時(shí)對(duì)相關(guān)專業(yè)術(shù)語進(jìn)行解釋說明，并注明檢測方法的局限性、檢測的靈敏度和特異性以及疑似背景微生物等。由于測序可檢出以往罕見的病原菌，需解釋物種來源、致病性、流行病學(xué)特點(diǎn)及最新研究結(jié)論等58二科研mNG版告應(yīng)滿足用戶要求。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保留所有檢出的微生物參數(shù)，包括但不限于比對(duì)序列數(shù)、相對(duì)豐度、基因組覆蓋度和測序深度等。.報(bào)告單的使用：從技術(shù)角度講，mNGS0性或陰性結(jié)果不能作為臨床診療決策的唯一依據(jù)，即使無菌部位標(biāo)本的mNGS吉果也需結(jié)合臨床表現(xiàn)或其他本查結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。mNG酸出或未檢出某物種的核酸片段，提示患者標(biāo)本中含有或不含有該物種核酸，但

49、不能明確該物種與感染的關(guān)系，即mNGS日性不一定是病原微生物。另一方面，受取樣及病程變化、測序策略本身的靈敏度局限、實(shí)驗(yàn)室檢測能力和生物信息學(xué)分析水平的影響，mNGS僉測陰性結(jié)果也需結(jié)合臨床進(jìn)行判定。從法律角度講，無認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室的檢測結(jié)果不能成為診斷依據(jù)，僅做研究所用。因此，目前國內(nèi)任何實(shí)驗(yàn)室出具的mNGSt生物檢測報(bào)告均不可直接用于臨床診斷，也不應(yīng)成為醫(yī)療文書59:建議9用于臨床輔助診斷的mNGS艮告應(yīng)包括測序總序列數(shù)、檢測病原微生物列表、檢出病原特異序列數(shù)量、檢測病原范圍、覆蓋度、測序深度、檢測方法及檢測技術(shù)說明。mNGS吉果的本質(zhì)與PCR相似，代表臨床標(biāo)本中檢出或未檢出某微生物的核酸片段，

50、不能明確該物種與感染的關(guān)系，即使陰性結(jié)果也需結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他檢查結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。四、性能確認(rèn)優(yōu)先選擇NMPA批準(zhǔn)的儀器與試劑，如果改變獲批試劑制定的預(yù)期用途、試劑組分、操作流程等，則按照LDT試劑要求進(jìn)行管理，在開展臨床服務(wù)之前所有與mNGS有關(guān)的儀器、試劑、檢測流程、數(shù)據(jù)庫及分析軟件均需進(jìn)行性能確認(rèn)。（一）測序平臺(tái)的性能確認(rèn)依據(jù)檢測項(xiàng)目及臨床預(yù)期用途，綜合考慮測序讀長和通量、測序準(zhǔn)確率、運(yùn)行時(shí)間、測序成本等選擇測序平臺(tái)。安裝時(shí)，由廠方工程師按照說明書所注明的儀器性能指標(biāo)逐項(xiàng)驗(yàn)證，達(dá)到廠方聲稱的指標(biāo)并滿足臨床預(yù)期用途為合格。（二）生物信息分析平臺(tái)的性能確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室可以選擇商業(yè)化的自動(dòng)分析系統(tǒng)

51、，也可需根據(jù)檢測項(xiàng)目和預(yù)期用途選擇合適的算法和軟件，搭建本實(shí)驗(yàn)室的生物信息學(xué)分析流程，并進(jìn)行必要的性能確認(rèn)，以保證對(duì)病原微生物檢測的準(zhǔn)確性。性能確認(rèn)包括但不限于最低測序數(shù)據(jù)量及堿基識(shí)別質(zhì)量值等，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)國際上本領(lǐng)域發(fā)展不斷優(yōu)化分析平臺(tái)。臨床標(biāo)本的測序數(shù)據(jù)是進(jìn)行性能確認(rèn)時(shí)最重要的數(shù)據(jù)，即臨床標(biāo)本mNG除流程檢測后得到的測序數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)模擬的測序數(shù)據(jù)可通過數(shù)據(jù)模擬軟件ART等軟件生成59,60,但是計(jì)算機(jī)模擬和參考物質(zhì)的測序數(shù)據(jù)只能作為補(bǔ)充數(shù)據(jù)，不能完全替代臨床標(biāo)本測序數(shù)據(jù)。（三）分析性能確認(rèn)分析性能確認(rèn)包括從臨床樣本前處理到生物信息學(xué)分析的全過程，觀察指標(biāo)至少應(yīng)包含精密度、準(zhǔn)確度、可報(bào)告范圍

52、、分析敏感性、分析特異性等。1 .精密度：指在規(guī)定條件下所獲得的多次獨(dú)立檢測結(jié)果的一致度，評(píng)價(jià)檢測方法的重復(fù)性。包括對(duì)同一批樣本在同一條件下（相同的環(huán)境、操作人員及儀器）至少進(jìn)行3次以上檢測,評(píng)價(jià)重復(fù)精密度，以及不同日間、不同人員、不同儀器（相同型號(hào)）至少進(jìn)行3次以上檢測，評(píng)價(jià)再現(xiàn)性精密度?？蛇x擇高、低2個(gè)不同梯度的參考品進(jìn)行驗(yàn)證，精密度應(yīng)>90%T。2 .準(zhǔn)確度：是指與真陽樣本、真陰樣本結(jié)果或金標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果的符合率。對(duì)準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià)可通過兩部分進(jìn)行。通過臨床樣本驗(yàn)證：選另一NMPAB獲批或被普遍接受白金標(biāo)準(zhǔn)方法與mNGS時(shí)檢測臨床樣本，比較mNGST金標(biāo)準(zhǔn)方法之間的差異，不一致的結(jié)果

53、再用第3種方法進(jìn)一步確認(rèn)，通過陽性符合率和陰性符合率評(píng)價(jià)定性測定的準(zhǔn)確度16135161,62。通過參考品驗(yàn)證：mNGSB前尚無國際或國家參考品，實(shí)驗(yàn)室可自制企業(yè)參考品進(jìn)行驗(yàn)證。細(xì)菌、真菌、寄如在明確陰性或健康人標(biāo)本中摻入不同類型病原體的標(biāo)準(zhǔn)參考品（如病毒、生蟲等）制備模擬陽性樣本，建議使用810種病原微生物（包括RNA病毒）驗(yàn)證檢測的準(zhǔn)確度。樣本數(shù)量不少于20例，濃度范圍應(yīng)覆蓋高、中、低，一致率應(yīng)大于90%26'62二.最低檢測限（limitofdetection,LoD）:用于描述測序方法的分析敏感性，它是指能夠通過測序獲得準(zhǔn)確目標(biāo)微生物的最低濃度，一般要求可信度R95%可根據(jù)預(yù)期

54、用途、標(biāo)本類型等，選擇含有代表物種的混合參考品，10倍梯度稀釋進(jìn)行檢測，每個(gè)梯度至少3個(gè)重復(fù)，計(jì)算出LoD值，并在該LoD濃度進(jìn)行20次以上重復(fù)，確保95%勺檢出。實(shí)驗(yàn)室需要建立不同樣本類型、不同代表物種的LoD63。.分析特異性：分析特異性主要評(píng)價(jià)樣本中潛在干擾物質(zhì)對(duì)檢測結(jié)果的影響。mNGSt大的干擾物是人源核酸，高濃度的宿主背景可嚴(yán)重降低檢測靈敏度。痰標(biāo)本需增加黏蛋白對(duì)結(jié)果干擾程度的評(píng)估。血液標(biāo)本需增加血紅蛋白干擾程度評(píng)估。應(yīng)使用接近臨床真值的干擾物濃度進(jìn)行驗(yàn)證，建議包含每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度?？蓪⒉煌康母蓴_物質(zhì)分別添加到陽性樣本中，以評(píng)估干擾物質(zhì)對(duì)檢測結(jié)果的干擾程度。mNG陰析特

55、異性還需考慮近源物種的交叉反應(yīng)，即鑒別不同亞種、亞型的能力4雙。.可報(bào)告范圍：mNGS的可報(bào)告范圍理論上應(yīng)為參考數(shù)據(jù)庫中包含的所有微生物，在對(duì)參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行更新升級(jí)時(shí)，可報(bào)告范圍也相應(yīng)發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在數(shù)據(jù)庫升級(jí)時(shí)對(duì)可報(bào)告范圍和上述各項(xiàng)性能指標(biāo)重新進(jìn)行確認(rèn)。在準(zhǔn)確度驗(yàn)證中，應(yīng)確認(rèn)可報(bào)告范圍，實(shí)驗(yàn)室在日常檢測中，應(yīng)對(duì)可報(bào)告范圍持續(xù)關(guān)注和確認(rèn)26二（四）性能確認(rèn)的樣本要求.代表性：涵蓋不同類型微生物的各類感染標(biāo)本是理想的性能驗(yàn)證樣本。未經(jīng)性能驗(yàn)證的標(biāo)本類型應(yīng)被視為無法準(zhǔn)確得到結(jié)果的樣本。如果缺少具有代表性的病原微生物，可使用模擬樣本代替。不同類型微生物應(yīng)特別強(qiáng)調(diào)結(jié)核分枝桿菌、絲狀真菌、RNA病毒

56、及寄生蟲。不同類型的臨床標(biāo)本特別強(qiáng)調(diào)血液、CSFBALE組織標(biāo)本和關(guān)節(jié)液及胸腔積液。.樣本量：進(jìn)行分析性能驗(yàn)證的樣本量需達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有文獻(xiàn)建議精密度確認(rèn)至少需3份樣本，準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)至少檢測59份樣本，進(jìn)彳TLoD評(píng)價(jià)時(shí)至少需要檢測20次。如果短時(shí)間內(nèi)無法獲得豐富的樣本類型及微生物種類，可選PCR已知微生物的人源DNA含量低（CSF及血漿）及高含人源DNA羊本（痰及BALF）各2份進(jìn)行驗(yàn)證，如果可準(zhǔn)確檢出，則認(rèn)為系統(tǒng)滿足mNGSt用。其他類型樣本可在實(shí)踐中逐步補(bǔ)充完善®64o（五）臨床性能確認(rèn)臨床性能確認(rèn)包括臨床敏感性和特異性。實(shí)驗(yàn)室需結(jié)合臨床信息對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行臨床性能確認(rèn)，如常規(guī)檢

57、查、影像學(xué)檢查、臨床表現(xiàn)及臨床醫(yī)生的判斷等。如果疾病種類、標(biāo)本類型及病原微生物的覆蓋度無法達(dá)到臨床性能確認(rèn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室可從無癥狀對(duì)照組獲得臨床特異性的指標(biāo)。此外，也可根據(jù)文獻(xiàn)建立臨床性能確認(rèn)指標(biāo)7'26'35o建議10使用NMPA比準(zhǔn)的mNG斌劑應(yīng)進(jìn)行分析性能驗(yàn)證，LDT試劑應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途進(jìn)行方法設(shè)計(jì)和優(yōu)化，并對(duì)檢測全流程進(jìn)行整體的性能確認(rèn)。分析性能確認(rèn)應(yīng)包含不同類型樣本及重要病原微生物，如果沒有足夠的臨床樣本可用模擬樣本代替。分析性能確認(rèn)包括但不限于精密度、準(zhǔn)確度、檢測限、分析特異性和可報(bào)告范圍等。在確認(rèn)分析性能后建立“濕實(shí)驗(yàn)”和“干實(shí)驗(yàn)”的SOP明確性能參數(shù)及檢測局限性。若實(shí)驗(yàn)室流程改變需進(jìn)行全面或部分性能再確認(rèn)。五、質(zhì)量保證（一）質(zhì)量要素質(zhì)量要素包括核酸提取的濃度和純度、文庫構(gòu)建所需的核酸量、文庫片段分布、文庫濃度、最低測序數(shù)據(jù)量、符合要求質(zhì)量值的堿基百分比（如Q30）以及檢測的局限性、檢測全過程SOP（采樣要求、樣本前處理、核酸提取、文庫制備、上機(jī)測序、生物信息學(xué)分析等）及其他參數(shù)（內(nèi)標(biāo)、質(zhì)控品、分析參數(shù)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)庫等）。若試