實驗8 植物組織中可溶性蛋白質含量的測定

1、試驗8 植物組織中可溶性蛋白質含量的測定斐林-酚試劑法 原 理 斐林(Folin)-酚試劑法結合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質的反應， 其中包括兩步反應：第一步是在堿性條件下，與銅試劑作用生成蛋白質-銅絡合物；其次步是此絡合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原，生成磷鉬藍和磷鎢藍的深藍色混合物，顏色深淺與蛋白含量成正相關。在650nm時比色測定的靈敏度比雙縮脲法高100倍。由于膚鍵顯色效果增加，從而削減了因蛋白質種類引起的偏差。該法適于微量蛋白的測定(范圍為5l00g蛋白質)。 材料、儀器設備及試劑(一)材料 各種植物材料。 (二)儀器設備 722分光光度計，離心機，恒溫水浴，定量加樣器，冷凝回流裝置一套

2、，研缽，離心管，刻度移液管，微量滴定管，試管等。 (三)試劑 (1)05molL Na0H。 (2)斐林-酚試劑甲液：由A、B兩種溶液組成：A液：4碳酸鈉(Na2C03)溶液與0.2mol/L氫氧化鈉(Na0H)溶液等體積混合。B液：1硫酸銅(CuS045H20)溶液與2酒石酸鉀鈉溶液等體積混合。使用前將A與B按50:1的比例混合即成，此試劑只能在使用當天配制。 (3)斐林-酚試劑乙液：稱取鎢酸鈉(Na2W04。H20)100g，鉬酸鈉(Na2Mo042H20)25g，加蒸餾水700ml溶解于1500mL的圓底燒瓶中。之后加入85的H3PO450mL，濃Hcl 100 mL，安上回流裝置(使用

3、磨口接頭，若用軟木塞或橡皮塞時，就必需用錫鉑紙包起來)，使其漸漸沸騰10h。冷卻后加入硫酸鋰（Li2SO4.H2O）150g,蒸餾水50ml，溴水2-3滴，打開瓶口煮沸15min，以逐出過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（若仍綠色，須再滴加幾滴溴水，連續(xù)煮沸15min）。待冷卻后稀釋至1000ml，過濾入棕色瓶中保存。使用時大約加水1倍，使最終濃度相當于1mol/L酸度。因此在使用前應進行標定。標定方法：取5ml福林-酚試劑乙液放入錐形瓶內，用1mol/L標準氫氧化鈉溶液滴定，酚酞作指示劑，當溶液突然轉紅再轉灰綠時，即為滴定終點。計算其相當的酸度，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調至相當于1mol/L的酸度。 在

4、測定時要留意，由于酚試劑僅在酸性穩(wěn)定，但此試驗的瓜只在pH10的狀況下發(fā)生，所以當加酚試劑時，必需馬上混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應，否則會使顯色程度減弱。標準蛋白質溶液：稱取25mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸餾水中，使終濃度為250g/ml。試驗步驟 （一）標準曲線的繪制 （1） 取18mm200mm試管7支，1-7編號，分別加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL標準蛋白質溶液，用蒸餾水補足1mL，使每管含蛋白量分別為0mol/L、25mol/L、50mol/L、100mol/L、150mol/L、200mol/L、250

5、mol/L。 （2） 用定量加樣器給每支試管中加入5mL甲液，混勻，于30下放置10min。（3） 再向試管中噴射加入0.5mL乙液，馬上振蕩混勻，在30下精確保溫30min（4） 以不加標準蛋白的1號管為空白，在650nm下用1cm光徑的比色皿測定吸光度。以標準蛋白濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。(二)樣品的測定 樣品的提?。悍Q取鮮樣05g，用5mL蒸餾水或緩沖液研磨成勻漿后，10000 rmin離心10min，取上清液10mL（視蛋白質含量適當稀釋)于試管中，然后重復標準曲線繪制中的24步驟，以空白管調零，測定吸光度。依據吸光度查標準曲線，求出樣品中的蛋白質含量。結果計算 樣品

6、中蛋白的含量 (mgg) 式中：C為查標準曲線值，g；VT為提取液總體積，mL；WF為樣品鮮重，g；Vs為測定時加樣量，mL。 留意事項 還原物質，其他酚類物質及檸檬酸對此反應有干擾?？捡R斯亮藍G-250染色法原 理 考馬斯亮藍G-250(Coomassie brilliant blue G-250)測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。該染料在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中當它與蛋白質的疏水區(qū)結合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸取?65nm，后者在59511nm。在肯定蛋白質濃度范圍內(11000g)，蛋白質與色素結合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質含量成正比，故可用于蛋白質的定量測定。考馬斯亮

7、藍G-250與蛋白質結合反應格外快速，2min左右即達到平衡。其結合物在室溫下1h內保持穩(wěn)定。此法靈敏度高(比斐林-酚法還高4倍)，易于操作，干擾物質少，是一種比較好的定量法。其缺點是在蛋白質含量很高時線性偏低，且不同來源蛋白質與色素結合狀況有肯定差異。材料、儀器設備及試劑(一)材料 小麥葉片及其他植物材料。(二)儀器設備 722分光光度計，研缽，燒杯，量瓶，移液管，具塞刻度試管等。(三)試劑(1)標準蛋白質溶液：100gmL牛血清白蛋白：稱取牛血清蛋白25g，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸餾水稀釋至100mL即可。(2)考馬斯亮藍G-250溶液：稱取100mg考馬斯亮

8、藍G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入100mL 85(WV)的磷酸，再用蒸餾水定容到1L，貯于棕色瓶中。常溫下可保存一個月。試驗步驟(一)標準曲線的繪制 取6文具塞試管，按表2-29-1加入試劑(0100gmL的標準蛋白)?；旌暇鶆蚝螅蚋鞴苤屑尤?mL考馬斯亮藍G-250溶液，搖勻，并放置5min左右，用1cm光徑比色皿在595nm下比色測定吸光度。以蛋白質濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。(二)樣品測定 (1)樣品提取。方法與斐林-酚試劑法相同。(2)吸取樣品提取液10mI，放人具塞試管中(每個樣品重復2次)，加入5mL考馬斯亮藍G-250溶液，充分混合，放置2min后在

9、595nm下比色，測定吸光度，并通過標準曲線查得蛋白質含量。 結果計算 樣品中蛋白質的含量 (mgg) 式中：C、VT、WF、Vs的表示意義與斐林-酚法相同。紫外吸取法原 理 蛋白質分子中的酪氨酸、色氨酸等殘基在280nm波長下具有最大光吸取。由于各種蛋白質中都含有酪氨酸，因此280nm的光吸取度是蛋白質的一種普遍性質。在肯定程度下，蛋白質溶液在280nm吸光度與其濃度成正比，故可作定量測定。核酸在紫外區(qū)(260nm)也有吸取，可通過校正加以消退。材料、儀器設備及試劑 (一)材料 小麥葉片及其他植物材料。 (二)儀器設備 紫外分光光度計，離心機，刻度移液管。(三)試劑 0 1mol/L PH 70磷酸緩沖液。 試驗步驟 （一）樣品提取 與菲林-酚法相同。（二）測定 取適量的樣品提取液，依據蛋白質濃度，用0.1mol/L pH7.0磷酸緩沖液適當稀釋后，用紫外分光光度計分別在280nm和260nm波長下讀取吸光度，以pH7.0磷酸緩沖液為空白調零。結果計算 蛋白質濃度=1.45A280-0.744A260（mg/mL） 蛋白質含量= 式中：1.45和0.74為校正值：A280為蛋白質溶