簡述核酸疫苗制備過程

1、簡述核酸疫苗制備過程核酸疫苗又稱基因疫苗，是指將編碼某種抗原蛋白的外源直接導入動物細胞，在宿主細胞中表達并合成抗原蛋白，并激起機體一系列類似于疫苗接種的免疫應答；起到預防和治療疾病的目的。自1990年Wolff等人意外發(fā)覺核酸疫苗后，其相關的爭辯得到了廣泛的重視，并得以快速進展，譽為“第三次疫苗革命”。本文就核酸疫苗的構建、特性、免疫機制、接種方式、影響因素、爭辯現狀和前景作一綜述。一 核酸疫苗的構建 核酸疫苗是由編碼病原體抗原的基因和作為真核細胞表達載體的質粒DNA組成。病原體抗原的編碼基因可以是一組相關基因或單一病原體免疫愛護性抗原基因，也可以是編碼抗原打算簇的一段DNA序列，其表達產物應

2、是病原體的有效成分，可以引發(fā)愛護性免疫。用于構建核酸疫苗的載體質粒多以pUC或pBR322質粒為基本骨架，主要包括啟動子、增加子和3端多聚A。巨細胞病毒（CMV）啟動子和ROUS肉瘤病毒（RSV）的啟動子都可在哺乳類細胞內表達。另外也有人接受來自哺乳動物和禽類的啟動子。Fynan等1993年將編碼流感病毒血凝素H或H7的CDNA片段插入CMV質粒的轉錄調控元件的下游，構建了抗流感病毒的核酸疫苗，另外，乙型肝炎病毒、人免疫缺陷綜合癥病毒、腦膜炎病毒等基因均被成功地克隆到含CMV啟動子的真核表達載體上，并表現了免疫活性。 用于構建核酸疫苗的病毒載體包括流感病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體、脊髓

3、灰質炎病毒等。1994年Castrucci-MR6把可以引起愛護性免疫反應的致死性淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV ）的表位基因片段克隆到流感病毒（H1N1）的基因組中制備核酸疫苗，免疫小鼠后，可使小鼠抵制致死性淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒的攻擊，其免疫效果可維持4個月以上。二 核酸疫苗的特點與傳統的滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗具有如下特點：（1）免疫效果好，基因疫苗能在宿主細胞中產生外源性蛋白，此種蛋白比原核生物表達系統中產生的蛋白更象自然分子，其抗原識別遞呈過程與自然感染格外相像，從而引起幾乎等同于感染這些病原體或弱毒疫苗免疫后所產生的免疫應答，并且避開了基因重組技術在體外

4、合成的蛋白質抗原表位丟失或轉變。（2）利用一種表達載體同時表達多種蛋白，誘導機體產生針對多種病原體的免疫應答，從而起到一次注射核酸疫苗同時預防和治療多種疾病的效果，并可抵制某些變異病原體的侵襲（3）核酸疫苗接種后，蛋白質抗原在宿主細胞內，可直接與MHC I類和MHC II類分子結合，引起廣泛的細胞免疫和體液免疫，但無毒力返祖的危急（4）平安性好，由于核酸疫苗一般接受表達載體在動物細胞體內進行抗原表達，不與宿主染色體DNA整合，但能在宿主體內表達，與病毒活疫苗相比，避開了病毒本身存在的復毒和病毒基因組整合到宿主染色體的危急（5）核酸疫苗具有共同的理化特性，可在同一載體上構建表達多種抗原，生產多價

5、疫苗或同時注射2種以上的核酸疫苗來進行聯合免疫（6）制備簡潔，利用成熟的基因重組技術，將克隆的目的基因DNA直接接種，避開了表達載體的構建，表達產物的提取等繁瑣過程（7）由于核酸疫苗作為重組質粒，能在工程菌內快速大量增殖，且提取方法簡便，可使生產成本降低，并能加工干燥，便于貯存和運輸。三 核酸疫苗免疫機理對核酸疫苗免疫機理說法不一，大多數學者認為，其致病機理在于他模擬了病毒的自然感染過程。DNA質粒在注射部位被肌細胞吸取攝取后，通過所含的啟動子和增加子系統調整合成所編碼的蛋白質，合成的蛋白質被細胞內蛋白酶復合體降解成含病毒抗原表位的肽段，進入內質網與合成MHCI類分子結合，然后被轉運系統遞呈到

6、細胞膜表面，此復合體共同激活CD8+CTL，部分被分泌或釋放入血的蛋白質，激活特異性B細胞，從而產生愛護性抗體；另外，分泌的蛋白質被巨噬細胞或樹突狀細胞等專職抗原遞呈細胞俘獲，被加工成肽段，進入溶酶體/內體區(qū)與MHC II類分子結合，激活受MHC II類分子限制的CD4+Th細胞，被激活的Th細胞分泌IFN、IL-2等細胞因子，進一步促進和強化體液免疫和細胞免疫。另外，試驗證明質粒上的氨芐青霉素抗性選擇基因中的回文結構5-AACGTT-3能夠使單核細胞產生白細胞介素-12，刺激細胞分泌干擾素，增加NK細胞的活性，稱為“單鏈免疫刺激DNA序列”起到佐劑的作用。四 核酸疫苗的接種方式核酸疫苗可以通

7、過多種方式、途徑接種到機體的適當部位，不同的接種方式或途徑可影響其免疫效果。接種途徑依啟動子的來源而有所區(qū)分，用動物病毒和一般哺乳動物啟動子構建的DNA疫苗一般用生理鹽水稀釋質粒DNA肌肉注射法，如股四頭肌和腓腸肌等骨骼肌由于其特殊結構如肌漿網、橫向微管系統，適合于攝取和表達DNA，兼之其注射便利，因而常被選為接種組織，也可選擇肌肉皮下、腹腔內、靜脈內接種。而用來自乳腺的乳清酸蛋白（WAP）啟動子構建的疫苗在乳腺和皮下脂肪接種效果更好；也有鼻腔內滴鼻法進行黏膜吸附免疫接種。其次種方法是用高速度來提高疫苗DNA對組織的轉染率和表達效率，一般用特殊工具-基因槍接種，基因槍能將包裹在金粒上的質粒DN

8、A直接注射進表皮細胞。用基因槍接種比直接注射核酸疫苗的免疫效果好60-600倍。用基因槍接種只需0.4-0.004µg純化DNA，而肌肉注射需100-200µg的核酸疫苗，才能獲得很明顯的免疫效果。Fynan2等人進行了不同方式接種流感病毒核酸疫苗免疫效力的爭辯證明上述二者的接種效果均高于靜脈、鼻腔、真皮、皮下等其它接種方式，但不同宿主細胞所產生的免疫接種效果并不完全全都。第三種方法是將組織預先用藥物如丁哌卡因、心肌毒素和高滲蔗糖等處理，增加組織細胞對疫苗DNA的攝取和表達力量，稱為“藥物幫忙法” 。另有人將疫苗DNA與粒細胞、巨噬集落刺激因子表達載體或一些細胞因子等一起或

9、分別注射均能明顯的提高疫苗免疫效率。還有用腺病毒介導或脂質體介導注射方法的報道，但存在潛在癌基因激活及缺乏細胞的導向性等缺點。五 核酸疫苗免疫效果的影響因素（1）表達載體對核酸疫苗的影響 表達載體對核酸疫苗的效力有很大的影響，表達載體主要以pUC和pBR322質粒為基本骨架，含DNA復制起始點、抗生素抗性基因、啟動子、增加子和3多聚A終止信號等結構，能在大腸桿菌中穩(wěn)定地復制，但不能在哺乳動物細胞中復制。其中把握外源基因表達的啟動子對載體的影響最大。啟動子因來源不同有組織特異性，并且在各種組織中起始mRNA合成的效能也不同。基因疫苗中常用的來自病毒的啟動子包括猴病毒40（SV40）早期啟動子、巨

10、細胞病毒（CMV）早期啟動子及羅斯肉瘤病毒（RSV）啟動子等，這些啟動子的組織特異性較廣，在很多組織細胞中能較好地表 達外源基因，且在肌肉組織中的表達效率最高。Davis等曾將HBSAG基因分別克隆到含CMV和RSV啟動子的質粒載體上，注射試驗動物后，發(fā)覺含CMV啟動子的質粒誘導的免疫反應明顯強于后者。現在大多接受CMV啟動子。也有人用來自哺乳動物和禽類的啟動子如人-肌動蛋白啟動子、乳清酸蛋白（WAP）啟動子、綿羊金屬硫蛋白啟動子和雞-肌動蛋白啟動子20-21等構建基因疫苗。這些啟動子在肌肉內都有較好的轉錄活性，而WAP啟動子則在乳腺和皮下脂肪表達效率最高。另外，Danko等22報告，共價閉環(huán)

11、型的質粒pRSVL DNA的表達效率遠高于線性質粒pRSVL DNA。(2) DNA輸入組織的方式DNA輸入組織可以用注射、脂質體包裹后注射、基因槍轟擊、口服等。其免疫效果因注射速度、導入速度、免疫劑量、接種部位、及宿主細胞不同而各有差異。另外肌肉注射前用蛇毒、心肌毒素、高滲蔗糖（25%W/V，用PBS溶解）、丁哌卡因等預處理，可顯著提高外源基因的表達。(3) 佐劑；Arom、QSI、細胞因子如IL-2等均可轉變或提高核酸疫苗的免疫效力。 (4) 機體免疫反應：由于核酸疫苗導入體內加工后表達既可激活CD8+TCL細胞，引起細胞免疫，表現出外周血淋巴細胞增殖反應增加、白細胞介素2、干擾素分泌增加

12、、細胞毒T淋巴細胞反應增加等表現。又能通過分泌抗原表達，激活TH細胞或直接激活B淋巴細胞產生抗體，故筆者認為機體免疫機能狀態(tài)也是影響其免疫效力的主要緣由之一。六 核酸疫苗的爭辯現狀及應用前景 自從90年核酸疫苗誕生之日起，學者們先后將一些不同病原體抗原基因的質粒DNA克隆到適宜的真核表達載體中，并接種于相應的動物體內，引發(fā)了特異性的免疫應答，對野毒株的攻擊具有愛護作用，以達到預防和治療疾病的目的。目前，很多種細菌、病毒、寄生蟲的核酸疫苗得到了廣泛的應用，并取得了良好的臨床愛護效果。 Ulmer等（1993）首先報道將流感病毒高度保守的核蛋白（NP）的cDNA克隆于質粒載體中，構建成表達NP的核

13、酸疫苗，取適量注入小鼠的股四頭肌，誘導出抗NP的特異性IgG抗體和CTL應答。由于愛護性抗原基因格外保守，故免疫小鼠即可抗同株流感病毒攻擊，又可抵制異株流感病毒攻擊。愛滋病自本世紀80年月初發(fā)覺以來，呈逐年成倍增長的趨勢，其高度的致死性與驚人的集中速度令人“談艾色變”，因此在世界范圍內急需一種平安有效的HIV疫苗問世。HIV中和抗原gp120V3區(qū)序列存在一高度同源共有序列，以此作疫苗研制的靶抗原可能會擴大疫苗的免疫愛護范圍。目前有關HIV外殼糖蛋白的基因重組疫苗、合成肽疫苗、重組病毒活載體苗正在樂觀研制中，但仍未取得另人滿足的的結果。1993年美國的WANG等領先應用DNA疫苗技術將編碼HI

14、V-1包膜糖蛋白基因cDNA重組質粒pM160接種小鼠，產生了抗HIV-1包膜糖蛋白的特異性抗體，此抗體能中和HIV-1對體外培育細胞的感染，抑制HIV-1介導的體外培育細胞的合胞體的形成；并且還觀看到了特異性的T細胞增殖現象；同時他們通過小鼠、猴體內進一步試驗發(fā)覺，若在DNA注射前對局部肌肉用藥物預處理能明顯提高了動物機體 對HIV-1包膜糖蛋白的免疫應答力量，并檢測到了特異的CTL應答。1994年Davis等分別將乙型肝炎表面抗原基因插入到了帶CMV啟動子的質粒構建了DNA疫苗，并肌肉注射小鼠體內，證明可在體內產生類似于病毒感染的細胞和體液免疫應答。Davis等爭辯人員證明注射部位藥物預處

15、理后，可產生更強大的免疫效力。同時證明使用無針生物注射器（Bioinjector）可將重組疫苗導入肌肉組織中，也能誘導對HBsAg的體液免疫反應。國內亦有對HBV核酸疫苗爭辯的報道。此外，針對人類病原微生物的核酸疫苗還包括HEV28狂犬病病毒11單純皰疹病毒結核病多種寄生蟲LCMV5等。我們也構建了編碼豬冠狀病毒（TGEV）的主要抗原位點和完整刺突 (Spike, S) 基因的真核表達質粒，并檢測到了體內和體外的表達。七 核酸疫苗的平安性問題核酸疫苗的性質介于傳代細胞系生產的生物治療劑與基因產品之間。由外源基因導入引起的內源性致癌基因的插入性激活和抑癌基因插入性激活的可能性往往被忽視，但核酸疫

16、苗本質主要為外源DNA，并且目前構建的DNA載體來看，大都含有某些致癌病毒的DNA序列，如CMV、RSV的啟動子序列。雖然通過對1800余中核酸疫苗的檢查沒有發(fā)覺導入基因和宿主染色體DNA整合的證據，但核酸疫苗在應用于人體之前，這個問題須明確解決。目前對于抗DNA抗體的產生有兩種假設：1是由B淋巴細胞增生產生2由抗原DNA引起B(yǎng)淋巴細胞活化和選擇產生，而抗DNA抗體的消滅必定會誘發(fā)新的疾病。核酸疫苗注射機體后可長期在體內表達外源抗原，一方面，核酸疫苗表達的抗原在新環(huán)境中可能誘導不適當的免疫應答，甚至在長期表達狀態(tài)下誘導免疫耐受；另一方面，假如免疫應答過程中有可能消滅過度刺激并產生交叉免疫反應性，后者在嚴峻狀況下導致自身免疫病的產生亦可發(fā)生超敏反應。盡管這些推想尚屬假設，但仍具有可能性，一旦消滅上述狀況，很難逆轉，必需予以重視。現階段疫苗的研制開發(fā)正處于探究階段，各試驗室所用的動物、表達載體、基因片段、免疫途徑等尚無統一標準，導致試驗結果差異較大，平安性不能得到充分保證，因此有必要依據不同病原體等實際狀況制定一套規(guī)范的準則，使核酸疫苗的制備和應用有規(guī)可循，