端粒酶—腫瘤治療研究新方向——周冰峰、龍妮婭VIP

1、貴陽醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)酶工程論文（2010級） 題 目 端粒酶腫瘤治療研究新方向 班 級 醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)2010級 學(xué)生姓名 周冰峰 龍妮婭 完成日期 2013 年 11 月 18 日 端粒酶腫瘤治療研究新方向周冰峰 龍妮婭摘要：端粒（telomere）是存在于真核細胞染色體末端的一段富含GC串聯(lián)重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)；端粒酶（telomerase）是一種由蛋白質(zhì)和RNA構(gòu)成的核糖核蛋白體，為RNA依賴的DNA聚合酶，也即逆轉(zhuǎn)錄酶，可以催化端粒DNA的合成。正常人體細胞的端粒酶活性檢測呈陰性，而在85%以上惡性腫瘤患者的腫瘤細胞中端粒酶是高度活躍的，呈現(xiàn)陽性，也即在端粒酶作用下，腫瘤細胞染色體端

2、粒不會隨細胞分裂而縮短，因此，端粒酶活性是診斷多數(shù)惡性腫瘤、判斷愈后的良好指標(biāo)，我們可以運用端粒酶作為治療腫瘤的靶點，為腫瘤治療提供一個新的研究方向。關(guān)鍵詞：端粒 端粒酶 細胞 腫瘤治療1、 端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn) （一）端粒早在20世紀30年代，諾貝爾獎得主Hermnn Muller和Barbara Mcclintock 已經(jīng)觀測到染色體的末端結(jié)構(gòu)在避免染色體之間的融合起到重要的作用，從而猜測它可能有保護染色體的作用1,2，之后，在20世紀70年代初對DNA聚合酶特性的深入研究引申出染色體并沒有隨著復(fù)制后RNA引物的降解而縮短，其自然末端也沒有相互融合，這就暗示了有一個特殊的結(jié)構(gòu)在保護染色體復(fù)制

3、過程中免遭融合、縮短，由此，人們把染色體末端這一特殊結(jié)構(gòu)定義為端粒（telomere）3。 （二）端粒酶真核生物DNA的復(fù)制只能沿著5一3方向進行，并需要有互補單鏈作模板，還要求有一定長度的RNA作為引物。隨著引物的切除，隨從鏈5末端總有一段相當(dāng)于RNA引物長度的DNA不能完整復(fù)制下來，這必然導(dǎo)致染色體DNA隨著每一次的細胞分裂其端區(qū)不斷縮短，這就是Warson于1972年提出的“末端復(fù)制問題(end replication problem)”4。但Larson和Spangler等在對對數(shù)生長期的四膜蟲的研究中卻發(fā)現(xiàn)其端區(qū)不見縮短，甚至還有所延長。針對這一矛盾，Blackburn和Greide

4、r等5認為四膜蟲端區(qū)的延長不可能是DNA聚合酶作用的結(jié)果，而是另有原因。后來他們在四膜蟲的細胞提取液中發(fā)現(xiàn)了一種酶活性成分，能往端粒區(qū)添加重復(fù)序列TTGGGG，當(dāng)時稱之為末端轉(zhuǎn)移酶，這就是現(xiàn)在所稱的端粒酶(telomerase)。2、 端粒酶的結(jié)構(gòu)和作用機制 （一）端粒酶的結(jié)構(gòu)端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白酶復(fù)合體，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性能夠以自身的RNA為模板合成端粒DNA。端粒酶結(jié)構(gòu)主要包括3部分：端粒酶RNA( telomerase RNA，TR)；端粒酶催化亞單位(telomerase catalytic subunit，TERT)和端粒酶相關(guān)蛋白質(zhì)1(telomerase associate

5、dprotein 1，TPlTLPl)；另外，還有hSP90(heat shock protein 90)，p23和dyskerin等6。這其中最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)就是TR和TERT。人端粒酶RNA（hTR）主要負責(zé)指導(dǎo)端粒重復(fù)序列的合成，hTR的結(jié)構(gòu)改變或成分的丟失均會影響端粒酶的活性。其次，端粒酶催化亞單位（hTERT）是一個包含1132個氨基酸殘基的多態(tài)鏈，它具有逆轉(zhuǎn)錄酶的共同結(jié)構(gòu)，也即7個蛋白質(zhì)域以及端粒酶催化亞基獨特的T框架保守區(qū)域，其編碼基因位于染色體5p上；hTERT是端粒酶起作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和主要調(diào)控亞單位，它可以通過逆轉(zhuǎn)錄hTR模板序列，合成端粒DNA重復(fù)序列并且添加到染色體末端，從而

6、延長端粒長度。（2） 端粒酶的作用機制 端粒酶的活性調(diào)控，包括 mRNA 剪接與成熟，hTERT 和 hTR 基因轉(zhuǎn)錄，不同組分之間的定位和移位，轉(zhuǎn)錄后修飾，具有活性的端粒酶組合，端粒酶結(jié)合到端粒產(chǎn)生延長作用等多個水平進行。伴隨端粒酶活性的增加，hTERT-mRNA表達水平也相對應(yīng)成一定比例增加，并且在癌細胞和正常組織中的表達有很大的不同，據(jù)此可認定，調(diào)控人類端粒酶活性的主要亞單位是 hTERT，只要 hTERT 表達，其他亞單位就會與其共同構(gòu)成高活性的端粒酶全酶7。因此，端粒酶的核心作用是延長端粒，從而維持端粒在復(fù)制分裂中保持一定長度，為細胞具有不斷復(fù)制提供遺傳基礎(chǔ)。 TR和TERT是端粒酶

7、發(fā)揮作用的核心組分，分別提供模板和逆轉(zhuǎn)錄酶合成端粒DNA。癌細胞中端粒酶的激活及活性的維持可能是多種因素在多個水平對不同分子靶作用的結(jié)果。正常組織廣泛表達hTR和hTP1，而hTERT的表達被抑制，大多數(shù)端粒酶陽性的腫瘤和永生化細胞系中均表達hTERT；此外，在端粒酶陰性細 胞中導(dǎo)入hTERT即可檢測到端粒酶活性，這就說明hTERT的表達與端粒酶活性是平行的，hTERT的激活對腫瘤細胞中端粒酶活性的激活是“必須的和足夠的”8。所以在端粒酶的激活過程中hTERT基因在細胞中的表達是決定端粒酶活性的關(guān)鍵9。3、 端粒酶活性的檢測技術(shù)端粒酶的常用檢測方法有三種：（1） 端粒重復(fù)序列擴增法(telom

8、ere repeat amplification protocol，TRAP)它是端粒酶活性檢測的基本方法10，在此基礎(chǔ)上又衍生出許多更加簡便靈活的檢測方法，比如TRAP-PAGE、TRAPELISA等；但是對于端粒酶的活性檢測的靈敏度都會因為取樣的位置不同而有所差異，總體來說， 使用TRAP檢測體液樣本的端粒酶活性，從提取、擴增至讀取結(jié)果，用時23 h，僅包含離心、加樣等基本的分子生物學(xué)檢測技術(shù)操作，并且可以參考試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)對陽性及陰性結(jié)果進行簡單、及時的判讀，是一種快速、簡便、靈敏的端粒酶活性檢測方法。（2） RT-PCR法檢測hTERT的表達（3） 用32P標(biāo)記的端粒（CCCTAA）探針

9、或用Hinf1和Ras1酶解的基因組DNA雜交，檢測端粒的長度 四、端粒酶在腫瘤治療方面的應(yīng)用正常細胞中的端粒酶活性檢測是呈現(xiàn)陰性的，而85%以上惡性腫瘤細胞中的端粒酶活性是高度表達的11，這就說明，腫瘤細胞的端粒酶活性因為某些原因被激活，使端粒不斷維持在一定的長度，細胞因此逃過正常的衰亡而成為無限增殖的細胞；端粒酶活性與惡性腫瘤之間的密切關(guān)系，為腫瘤的診斷提供了有效的標(biāo)志物12。因此，端粒酶是正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞的關(guān)鍵性物質(zhì)，是抗腫瘤治療的重要靶點。而且，正常細胞與腫瘤細胞中端粒酶的表達、端粒的長度和細胞動力學(xué)的差異，使得選擇端粒酶作為藥物靶標(biāo)成為相對安全有效的治療手段13。由于端粒酶活性

10、是通過TERT基因的轉(zhuǎn)錄機制來嚴格調(diào)控的。通過克隆TERT基因啟動子結(jié)構(gòu)區(qū)域，研究者發(fā)現(xiàn)TERT基因啟動子是高GC富含區(qū)，缺少TATA盒和CAAT盒。TERT基因核心啟動子上存在一些潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)，如E.box (CACGTG)、SPl、CEsts等。這些結(jié)構(gòu)特征使得TERT基因啟動子具有高腫瘤靶向性及較強的啟動活性，從而成為腫瘤靶向基因治療中具有巨大潛力的啟動子14。 近年來，針對端粒酶為作用靶點的抗腫瘤研究非常活躍，其研究目標(biāo)就是尋找各種有效的途徑來抑制腫瘤細胞的端粒酶活性，目前主要的途徑有以下幾種15： （一）阻斷端粒酶RNA的模板作用，包括：反義hTR、反義寡核苷酸、錘頭狀核酶和

11、肽苷酸等；我們以反義寡核苷酸為例，講述腫瘤治療中以反義寡核苷酸為靶點的應(yīng)用；研究發(fā)現(xiàn)，針對人端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）11個堿基區(qū)域的治療可以直接抑制端粒酶的活性，因此是寡核苷酸治療的理想靶點。不論端粒酶全酶的結(jié)構(gòu)如何，hTR的模板區(qū)域一定會連接到端粒的重復(fù)結(jié)構(gòu)，因此就會出現(xiàn)靶寡核苷酸的暴露，這為寡核苷酸介導(dǎo)的治療提供了理論基礎(chǔ)16。有報道稱以hTR為靶點的反義寡核苷酸可降低胃癌細胞系SW480（人結(jié)腸癌細胞株）的活性，并同時誘導(dǎo)其凋亡17。 （二）針對端粒酶催化亞基的抑制劑：反義hTERT抑制劑、端粒酶蛋白抗體、PKC調(diào)節(jié)劑等；目前，對于端粒酶催化亞基的

12、抑制劑，國內(nèi)外研究的比較深入的是反義h TERT抑制劑，其抑制腫瘤的機制是：針對端粒酶RNA組分中含有與端粒DNA序列互補的堿基模板序列設(shè)計的反義核苷酸，它具有阻斷其模板的作用，從而抑制DNA端粒酶合成端粒DNA序列。因此，反義hTERT抑制劑可以抑制腫瘤細胞的端粒酶活性并導(dǎo)致細胞死亡。已經(jīng)有實驗證明，用反義hTERT轉(zhuǎn)染人Hela細胞，發(fā)現(xiàn)端粒DNA逐漸丟失，經(jīng)2326個分裂周期后細胞就開始死亡18。這一實例就證明了用端粒酶作為靶點去設(shè)計端粒酶抑制劑是腫瘤治療的一個極具前景的新方向。5、 結(jié)語2009年的三位諾貝爾獎得主為我們揭示了端粒保護染色體的一系列機制，以及端粒與細胞癌變、衰老之間的密

13、切關(guān)系，也為后來的研究者提供了一個嶄新的研究端粒酶治療腫瘤方面的思路和研究路線，使我們從染色體的層次深刻的認識了腫瘤細胞，并且結(jié)合端粒酶在腫瘤細胞中的高表達特性，為腫瘤的診斷、端粒酶靶向抗腫瘤藥物的研制提供了更高效、專一的位點；盡管越來越多的端粒酶研究都取得很好的結(jié)果，但是仍然有一些問題需要我們?nèi)ソ鉀Q：第一，并不是所有的腫瘤患者和腫瘤類型都能檢測到端粒酶的活性，因此，這些細胞可能會對端粒酶靶向的治療方法不敏感。第二，當(dāng)端粒酶活性被抑制后，端粒的長度需要一段時間縮短至一定程度時才能引起細胞凋亡。因此，從藥物治療開始到產(chǎn)生一定的治療作用會有一段時間的滯后期。第三，腫瘤細胞常常會啟動其它補償機制而逃

14、脫治療的壓力，在以端粒酶為靶向的治療中刺激與端粒酶功能相似的其它基因的表達。這些都是需要我們?nèi)?yīng)用生物技術(shù)解決的問題，但是，相信總有一天，人類會利用端粒酶研究更多的端粒酶抑制藥物，從根本上克服腫瘤。 參考文獻1楊品紅，王志陶，王志勇.端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用.生物技術(shù)通報, 2010 (8):46-5123鐘天映,陳媛媛,畢利軍.端粒與端粒酶的研究解讀2009年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎.生物化學(xué)與生物物理進展,2009, 36(10): 1233-12384WATSON J DOrigin of concatemerie T7 DNAJ.Nat NewBioI, 1972, 239(94):197

15、-2015GREIDER C W,BLACKBURN E HIdentification of a specific telomere terminal transferase activity in TetrahymenaextractsJ.Cell,1985,43(2 Pt 1)：405-4136孔令平,汪華僑.端粒和端粒酶與衰老、癌癥的潛在關(guān)系2009年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎簡介.自然雜志,2009,31(6):327-3317朱軍,丁建強,馮云.端粒、端粒酶研究及應(yīng)用進展.中國醫(yī)藥科學(xué),2012,02 (7): 59-628衛(wèi)立辛,吳孟超.端粒酶:腫瘤治療研究的新希望.中國腫瘤生物治療雜

16、志,20 06,13(5):325-3289王峰,刁勇,許瑞安.人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子在腫瘤基因治療中的應(yīng)用.中國生化藥物雜志,2012,33(5):687-68910劉巖,徐美林,王菁,吳秉銓,鐘鎬鎬,方偉崗.端粒酶活性和免疫細胞化學(xué)在腫瘤細胞學(xué)診斷中的應(yīng)用.中華病理學(xué)雜志,2012,41(3):181-18511黃志偉,隋英麗.反義端粒酶RNA抑制腫瘤細胞的研究進展.中國現(xiàn)代普通外科進展, 2012,15(12):978-97912von Figura G,Hartmann D,Song Z,et al.Role of telomere dysfunction in aging and its detection by biomarkers.J Mol Med,2009-08-08Epub ahead of print13鐘天映,陳媛媛,畢利軍.端粒與端粒酶的研究解讀2009年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎.生物化學(xué)與生物物理進展,2009, 36(10): 1233-123814王峰,刁勇,許瑞安.人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子在腫瘤基因治療中的應(yīng)用.中國生化藥物雜