激光動態(tài)光散射儀操作手冊

1、激光動態(tài)光散射儀操作手冊一、 動態(tài)光散射儀的工作原理 動態(tài)光散射技術(shù)（dynamiclightscattering,DLS）是指通過測量樣品散射光強度起伏的變化來得出樣品顆粒大小信息的一種技術(shù)。之所以稱為“動態(tài)”是因為樣品中的分子不停地做布朗運動，正是這種運動使散射光產(chǎn)生多普勒頻移。動態(tài)光散射技術(shù)的工作原理可以簡述為以下幾個步驟：首先根據(jù)散射光的變化，即多普勒頻移測得溶液中分子的擴散系數(shù)D，再由D=KT/6r可求出分子的流體動力學半徑r，(式中K為玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對溫度，為溶液的粘滯系數(shù)),根據(jù)已有的分子半徑-分子量模型，就可以算出分子量的大小。 光在傳播時若碰到顆粒，一部分光會被吸收，一

2、部分會被散射掉。如果分子靜止不動，散射光發(fā)生彈性散射時，能量頻率均不變。但由于分子不停地在做雜亂無章的布朗運動，所以，當產(chǎn)生散射光的分子朝向監(jiān)測器運動時，相當于把散射的光子往監(jiān)測器送了一段距離，使光子較分子靜止時產(chǎn)生的散射光要早到達監(jiān)測器，也就是在監(jiān)測器看來散射光的頻率增高了；如果產(chǎn)生散射的分子逆向監(jiān)測器運動，相當于把散射光子往遠離監(jiān)測器的方向拉了一把，結(jié)果使散射光的頻率降低。日常生活中，但我們聽到救護車由遠而近時，聲音的頻率越來越高，也是同樣的道理。實際上我們可以根據(jù)聲音頻率變化的快慢來判斷救護車運動的速度。 光散射技術(shù)就是根據(jù)這種微小的頻率變化來測量溶液中分子的擴散速度。由D=KT/6r可

3、知，當擴散速度一定時，由于實驗時溶劑一定，溫度是確定的，所以擴散的快慢只與流體動力學半徑有關(guān)。蛋白質(zhì)多方面的性質(zhì)都直接和它的大小相關(guān)。因此，光散射廣泛應(yīng)用與蛋白質(zhì)及其它大分子的理化性質(zhì)研究。動態(tài)光散射技術(shù)的優(yōu)點： 1樣品制備簡單，不需特殊處理，測量過程不干擾樣品本身的性質(zhì)，所以能夠反映出溶液中樣品分子的真實狀態(tài)； 2測量過程迅速，而且樣品可以回收利用； 3檢測靈敏度高，10kD蛋白質(zhì)，濃度只需0.1mg/mL,樣品體積只需20-50µL即可； 4能夠?qū)崟r監(jiān)測樣品的動態(tài)變化。 二、動態(tài)光散射技術(shù)的應(yīng)用 溶液中的顆粒物質(zhì)（如生物大分子、高分子聚合物、膠束等），其顆粒大小的變化往往可以反應(yīng)

4、出某些性質(zhì)方面的變化。由于光散射實際上是首先 通過測量大分子物質(zhì)的擴散系數(shù)，進而推導出其它參數(shù)。所以，光散射不僅可以用來進行靜態(tài)測量，還可以檢測一些動態(tài)過程的變化。 下面以大家熟悉的生物學中的幾個具體實例來介紹動態(tài)光散射技術(shù)的應(yīng)用。 1.測定蛋白質(zhì)分子的均一性 蛋白質(zhì)樣品的均一性是生長晶體的前提條件，在無法直接觀察蛋白質(zhì)在溶液中狀態(tài)的情況下，生長晶體是一個需要經(jīng)驗和運氣的過程。但是用光散射技術(shù)，只需要幾分鐘就可以確切地告訴你，這個樣品是否有長出晶體的可能性。你還可以測定蛋白在不同溶液中的狀態(tài)，從而確定出哪種溶液最適合生長晶體。 2.測定蛋白質(zhì)分子的pH穩(wěn)定性 有些蛋白質(zhì)分子在不同的pH值條件下

5、，會有不同的構(gòu)型，或者形成聚合態(tài)，或是變性。如胰島素在pH2.0時是以單體存在，而在pH3.0時則以二聚體形式存在，當pH升至7.0時則以六聚體存在。因為這種變化表現(xiàn)為大小的變化，所以光散射技術(shù)可以用來測定蛋白質(zhì)分子的pH穩(wěn)定性。 3.測定蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性 對一些熱不穩(wěn)定的蛋白，溫度改變會導致分子變性聚合，因此可以觀察到分子半徑明顯增大。所以可以利用光散射技術(shù)來研究蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性。 4.蛋白質(zhì)變復(fù)性及折疊的研究 蛋白質(zhì)變性時往往是以聚合形式或較松散的狀態(tài)存在，復(fù)性后，蛋白質(zhì)折疊成天然狀態(tài)，會發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，這一變化可以導致流體動力學半徑的變化，所以光散射技術(shù)可以用來檢測這一動態(tài)變化的

6、過程。5.臨界膠束濃度的測定 一定濃度的表面活性劑分子加到溶液中會形成微膠束，但濃度不同會影響膠束的大小以及是否能夠形成膠束。如果濃度增加到一定程度，膠束就會形成，膠束的大小和單分子大小會有明顯區(qū)別，利用光散射就可以確定膠束形成的臨界濃度。 動態(tài)光散射技術(shù)還可用于一些動態(tài)過程的檢測，譬如蛋白質(zhì)復(fù)性的整個過程的監(jiān)測。三、激光動態(tài)光散射儀的結(jié)構(gòu) 動態(tài)光散射儀的結(jié)構(gòu)原理圖如下： 儀器結(jié)構(gòu)總是與其功能相適應(yīng)的，下圖為生命科學學院所有的proteinsolution公司的MS800光散射儀的外形。 上方為主機，包括激光器、檢測器、相關(guān)器等；下方是溫控器和樣品室  四、動態(tài)光散射儀的使

7、用 1、樣品制備 由于動態(tài)光散射儀對灰塵和氣泡及其它大的顆粒非常敏感，所以制備樣品時，一定要注意不要讓樣品中混有大顆粒物質(zhì)。一般采取如下措施： a)先將樣品離心，12000g離心5分鐘,離心時的溫度視樣品要求而定。取上層樣品過濾，濾膜的選擇要視樣品分子大小而定，對蛋白質(zhì)樣品通常用0.02µm的濾膜，如果目標分子在100kD以上，建議用0.1µm的濾膜。過濾后的樣品直接加樣到樣品室中。、加樣步驟 將加樣針伸到樣品池的底部，一邊加樣一邊緩緩向上提起加樣針，以免形成氣泡，然后蓋上樣品池的蓋子。注意，加樣針不能碰到樣品池的窗口，否則會留下劃痕，影響測量。 1）樣品池的清洗與準備 2

8、）動態(tài)光散射技術(shù)非常靈敏，所以對每一個細節(jié)的要求都很高。樣品池的內(nèi)外表面不能粘有臟物，不能有手指印跡等。 3）清洗步驟：用1tritonX100浸泡，超聲清洗十分鐘，然后用超純水沖洗干凈，再用高純氮氣吹干。檢測是否洗干凈的方法是裝上超純水，進行光散射測量，看散射光強是否與標準值接近。清洗干凈的樣品池保存在專用的盒子中備用。3、數(shù)據(jù)分析與解釋 *Polydispersity CP<15%ofRH®均一(如下圖上排所示)。注意：均一并不說明一定是單體，下圖上排三種情況均是均一狀態(tài)。 CP<30%ofRH®(如下圖下排左一所示) CP>30%ofRH®

9、(如下圖下排左二、三所示)  五、實驗步驟 1、打開計算機，打開光散射儀電源； 2、運行DynamicV6程序，將溫度設(shè)定在所需的值，并待其溫度穩(wěn)定； 3、裝配過濾器，濾膜孔徑為0.02µm。將100ul配制好的蛋白質(zhì)溶液12000rpm離心5分鐘，取上層樣品40微升，過濾上樣。 4、新建實驗窗口，從file菜單中選擇new或在主界面直接點擊new快捷; 5、輸入相應(yīng)的參數(shù)和文件名，參數(shù)包括；溶劑類型，采集數(shù)據(jù)的時間，溫度，樣品濃度，所選理論模型等; 6、將盛放好樣品的樣品池放到樣品室中，蓋上樣品室蓋子； 7、點擊record按鈕，采集數(shù)據(jù)； 8、收集十組以上有用

10、數(shù)據(jù)，分析實驗結(jié)果； 注意，樣品池用過之后，下一次上樣之前，必須清洗干凈，判斷方法是在樣品池中加入過濾后的超純水，看所測結(jié)果是否符合標準。 六、注意事項 儀器中光路系統(tǒng)的干燥管需要定期檢查，如果吸潮到一定程度，需要烘干再生。  實驗流程 開機及打開軟件 設(shè)置參數(shù)（包括溫度，激光強度，分子結(jié)構(gòu)模型） 將樣品放到散射池中 將散射池放到樣品室中 等五分鐘，待溫度平衡 采集數(shù)據(jù) 檢測數(shù)據(jù)采集 保存數(shù)據(jù) 如果數(shù)據(jù)較好，分析粒徑分布 采樣結(jié)束，取出散射池 清理散射池，裝載下一個樣品 采集數(shù)據(jù) 重復(fù)測試其它樣品或終止實驗 推出軟件（必須在關(guān)閉儀器電源之前） 關(guān)閉電源 操作流程圖示

11、0; 軟件操作部分 1、新建一個文件  2、點擊右下的connect,建立軟件與儀器的連接；3、連接成功后，startbutton會變成綠色。4、裝載樣品，點擊startbutton，即可開始采集數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采集時，startbutton為紅色，點擊紅色的startbutton即可停止數(shù)據(jù)采集。建議： 1第一次上樣建議用未過濾的樣品，最小上樣體積12微升。把加樣針的前端伸到樣品池的底部，加樣時緩慢將上樣針上提，避免氣泡產(chǎn)生。 2如果采集的數(shù)據(jù)表明樣品有聚集或者有大的顆粒，可將樣品進行離心（15000g，10min）,或者將樣品進行過濾處理。  當樣品池放好，點擊綠色startbutt