激光動(dòng)態(tài)光散射儀操作手冊(cè)

1、激光動(dòng)態(tài)光散射儀操作手冊(cè)一、 動(dòng)態(tài)光散射儀的工作原理 動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（dynamiclightscattering,DLS）是指通過(guò)測(cè)量樣品散射光強(qiáng)度起伏的變化來(lái)得出樣品顆粒大小信息的一種技術(shù)。之所以稱為“動(dòng)態(tài)”是因?yàn)闃悠分械姆肿硬煌５刈霾祭蔬\(yùn)動(dòng)，正是這種運(yùn)動(dòng)使散射光產(chǎn)生多普勒頻移。動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的工作原理可以簡(jiǎn)述為以下幾個(gè)步驟：首先根據(jù)散射光的變化，即多普勒頻移測(cè)得溶液中分子的擴(kuò)散系數(shù)D，再由D=KT/6r可求出分子的流體動(dòng)力學(xué)半徑r，(式中K為玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，為溶液的粘滯系數(shù)),根據(jù)已有的分子半徑-分子量模型，就可以算出分子量的大小。 光在傳播時(shí)若碰到顆粒，一部分光會(huì)被吸收，一

2、部分會(huì)被散射掉。如果分子靜止不動(dòng)，散射光發(fā)生彈性散射時(shí)，能量頻率均不變。但由于分子不停地在做雜亂無(wú)章的布朗運(yùn)動(dòng)，所以，當(dāng)產(chǎn)生散射光的分子朝向監(jiān)測(cè)器運(yùn)動(dòng)時(shí)，相當(dāng)于把散射的光子往監(jiān)測(cè)器送了一段距離，使光子較分子靜止時(shí)產(chǎn)生的散射光要早到達(dá)監(jiān)測(cè)器，也就是在監(jiān)測(cè)器看來(lái)散射光的頻率增高了；如果產(chǎn)生散射的分子逆向監(jiān)測(cè)器運(yùn)動(dòng)，相當(dāng)于把散射光子往遠(yuǎn)離監(jiān)測(cè)器的方向拉了一把，結(jié)果使散射光的頻率降低。日常生活中，但我們聽(tīng)到救護(hù)車由遠(yuǎn)而近時(shí)，聲音的頻率越來(lái)越高，也是同樣的道理。實(shí)際上我們可以根據(jù)聲音頻率變化的快慢來(lái)判斷救護(hù)車運(yùn)動(dòng)的速度。 光散射技術(shù)就是根據(jù)這種微小的頻率變化來(lái)測(cè)量溶液中分子的擴(kuò)散速度。由D=KT/6r可

3、知，當(dāng)擴(kuò)散速度一定時(shí)，由于實(shí)驗(yàn)時(shí)溶劑一定，溫度是確定的，所以擴(kuò)散的快慢只與流體動(dòng)力學(xué)半徑有關(guān)。蛋白質(zhì)多方面的性質(zhì)都直接和它的大小相關(guān)。因此，光散射廣泛應(yīng)用與蛋白質(zhì)及其它大分子的理化性質(zhì)研究。動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)： 1樣品制備簡(jiǎn)單，不需特殊處理，測(cè)量過(guò)程不干擾樣品本身的性質(zhì)，所以能夠反映出溶液中樣品分子的真實(shí)狀態(tài)； 2測(cè)量過(guò)程迅速，而且樣品可以回收利用； 3檢測(cè)靈敏度高，10kD蛋白質(zhì)，濃度只需0.1mg/mL,樣品體積只需20-50µL即可； 4能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)樣品的動(dòng)態(tài)變化。 二、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的應(yīng)用 溶液中的顆粒物質(zhì)（如生物大分子、高分子聚合物、膠束等），其顆粒大小的變化往往可以反應(yīng)

4、出某些性質(zhì)方面的變化。由于光散射實(shí)際上是首先 通過(guò)測(cè)量大分子物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)，進(jìn)而推導(dǎo)出其它參數(shù)。所以，光散射不僅可以用來(lái)進(jìn)行靜態(tài)測(cè)量，還可以檢測(cè)一些動(dòng)態(tài)過(guò)程的變化。 下面以大家熟悉的生物學(xué)中的幾個(gè)具體實(shí)例來(lái)介紹動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的應(yīng)用。 1.測(cè)定蛋白質(zhì)分子的均一性 蛋白質(zhì)樣品的均一性是生長(zhǎng)晶體的前提條件，在無(wú)法直接觀察蛋白質(zhì)在溶液中狀態(tài)的情況下，生長(zhǎng)晶體是一個(gè)需要經(jīng)驗(yàn)和運(yùn)氣的過(guò)程。但是用光散射技術(shù)，只需要幾分鐘就可以確切地告訴你，這個(gè)樣品是否有長(zhǎng)出晶體的可能性。你還可以測(cè)定蛋白在不同溶液中的狀態(tài)，從而確定出哪種溶液最適合生長(zhǎng)晶體。 2.測(cè)定蛋白質(zhì)分子的pH穩(wěn)定性 有些蛋白質(zhì)分子在不同的pH值條件下

5、，會(huì)有不同的構(gòu)型，或者形成聚合態(tài)，或是變性。如胰島素在pH2.0時(shí)是以單體存在，而在pH3.0時(shí)則以二聚體形式存在，當(dāng)pH升至7.0時(shí)則以六聚體存在。因?yàn)檫@種變化表現(xiàn)為大小的變化，所以光散射技術(shù)可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)分子的pH穩(wěn)定性。 3.測(cè)定蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性 對(duì)一些熱不穩(wěn)定的蛋白，溫度改變會(huì)導(dǎo)致分子變性聚合，因此可以觀察到分子半徑明顯增大。所以可以利用光散射技術(shù)來(lái)研究蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性。 4.蛋白質(zhì)變復(fù)性及折疊的研究 蛋白質(zhì)變性時(shí)往往是以聚合形式或較松散的狀態(tài)存在，復(fù)性后，蛋白質(zhì)折疊成天然狀態(tài)，會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，這一變化可以導(dǎo)致流體動(dòng)力學(xué)半徑的變化，所以光散射技術(shù)可以用來(lái)檢測(cè)這一動(dòng)態(tài)變化的

6、過(guò)程。5.臨界膠束濃度的測(cè)定 一定濃度的表面活性劑分子加到溶液中會(huì)形成微膠束，但濃度不同會(huì)影響膠束的大小以及是否能夠形成膠束。如果濃度增加到一定程度，膠束就會(huì)形成，膠束的大小和單分子大小會(huì)有明顯區(qū)別，利用光散射就可以確定膠束形成的臨界濃度。 動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)還可用于一些動(dòng)態(tài)過(guò)程的檢測(cè)，譬如蛋白質(zhì)復(fù)性的整個(gè)過(guò)程的監(jiān)測(cè)。三、激光動(dòng)態(tài)光散射儀的結(jié)構(gòu) 動(dòng)態(tài)光散射儀的結(jié)構(gòu)原理圖如下： 儀器結(jié)構(gòu)總是與其功能相適應(yīng)的，下圖為生命科學(xué)學(xué)院所有的proteinsolution公司的MS800光散射儀的外形。 上方為主機(jī)，包括激光器、檢測(cè)器、相關(guān)器等；下方是溫控器和樣品室  四、動(dòng)態(tài)光散射儀的使

7、用 1、樣品制備 由于動(dòng)態(tài)光散射儀對(duì)灰塵和氣泡及其它大的顆粒非常敏感，所以制備樣品時(shí)，一定要注意不要讓樣品中混有大顆粒物質(zhì)。一般采取如下措施： a)先將樣品離心，12000g離心5分鐘,離心時(shí)的溫度視樣品要求而定。取上層樣品過(guò)濾，濾膜的選擇要視樣品分子大小而定，對(duì)蛋白質(zhì)樣品通常用0.02µm的濾膜，如果目標(biāo)分子在100kD以上，建議用0.1µm的濾膜。過(guò)濾后的樣品直接加樣到樣品室中。、加樣步驟 將加樣針伸到樣品池的底部，一邊加樣一邊緩緩向上提起加樣針，以免形成氣泡，然后蓋上樣品池的蓋子。注意，加樣針不能碰到樣品池的窗口，否則會(huì)留下劃痕，影響測(cè)量。 1）樣品池的清洗與準(zhǔn)備 2

8、）動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)非常靈敏，所以對(duì)每一個(gè)細(xì)節(jié)的要求都很高。樣品池的內(nèi)外表面不能粘有臟物，不能有手指印跡等。 3）清洗步驟：用1tritonX100浸泡，超聲清洗十分鐘，然后用超純水沖洗干凈，再用高純氮?dú)獯蹈?。檢測(cè)是否洗干凈的方法是裝上超純水，進(jìn)行光散射測(cè)量，看散射光強(qiáng)是否與標(biāo)準(zhǔn)值接近。清洗干凈的樣品池保存在專用的盒子中備用。3、數(shù)據(jù)分析與解釋 *Polydispersity CP<15%ofRH®均一(如下圖上排所示)。注意：均一并不說(shuō)明一定是單體，下圖上排三種情況均是均一狀態(tài)。 CP<30%ofRH®(如下圖下排左一所示) CP>30%ofRH®

9、(如下圖下排左二、三所示)  五、實(shí)驗(yàn)步驟 1、打開(kāi)計(jì)算機(jī)，打開(kāi)光散射儀電源； 2、運(yùn)行DynamicV6程序，將溫度設(shè)定在所需的值，并待其溫度穩(wěn)定； 3、裝配過(guò)濾器，濾膜孔徑為0.02µm。將100ul配制好的蛋白質(zhì)溶液12000rpm離心5分鐘，取上層樣品40微升，過(guò)濾上樣。 4、新建實(shí)驗(yàn)窗口，從file菜單中選擇new或在主界面直接點(diǎn)擊new快捷; 5、輸入相應(yīng)的參數(shù)和文件名，參數(shù)包括；溶劑類型，采集數(shù)據(jù)的時(shí)間，溫度，樣品濃度，所選理論模型等; 6、將盛放好樣品的樣品池放到樣品室中，蓋上樣品室蓋子； 7、點(diǎn)擊record按鈕，采集數(shù)據(jù)； 8、收集十組以上有用

10、數(shù)據(jù)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 注意，樣品池用過(guò)之后，下一次上樣之前，必須清洗干凈，判斷方法是在樣品池中加入過(guò)濾后的超純水，看所測(cè)結(jié)果是否符合標(biāo)準(zhǔn)。 六、注意事項(xiàng) 儀器中光路系統(tǒng)的干燥管需要定期檢查，如果吸潮到一定程度，需要烘干再生。  實(shí)驗(yàn)流程 開(kāi)機(jī)及打開(kāi)軟件 設(shè)置參數(shù)（包括溫度，激光強(qiáng)度，分子結(jié)構(gòu)模型） 將樣品放到散射池中 將散射池放到樣品室中 等五分鐘，待溫度平衡 采集數(shù)據(jù) 檢測(cè)數(shù)據(jù)采集 保存數(shù)據(jù) 如果數(shù)據(jù)較好，分析粒徑分布 采樣結(jié)束，取出散射池 清理散射池，裝載下一個(gè)樣品 采集數(shù)據(jù) 重復(fù)測(cè)試其它樣品或終止實(shí)驗(yàn) 推出軟件（必須在關(guān)閉儀器電源之前） 關(guān)閉電源 操作流程圖示

11、0; 軟件操作部分 1、新建一個(gè)文件  2、點(diǎn)擊右下的connect,建立軟件與儀器的連接；3、連接成功后，startbutton會(huì)變成綠色。4、裝載樣品，點(diǎn)擊startbutton，即可開(kāi)始采集數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采集時(shí)，startbutton為紅色，點(diǎn)擊紅色的startbutton即可停止數(shù)據(jù)采集。建議： 1第一次上樣建議用未過(guò)濾的樣品，最小上樣體積12微升。把加樣針的前端伸到樣品池的底部，加樣時(shí)緩慢將上樣針上提，避免氣泡產(chǎn)生。 2如果采集的數(shù)據(jù)表明樣品有聚集或者有大的顆粒，可將樣品進(jìn)行離心（15000g，10min）,或者將樣品進(jìn)行過(guò)濾處理。  當(dāng)樣品池放好，點(diǎn)擊綠色startbutt