水通道蛋白的基本結(jié)構(gòu)與特異性通透機理

1、水通道蛋白的基本結(jié)構(gòu)與特異性通透機理王晶 桑建利（北京師范大學生命科學學院 北京 100875）摘要 水通道蛋白是一個具有跨膜運輸水分子功能的蛋白家族。從1988 年Agre 等發(fā)現(xiàn)水通道蛋白起，目前在不同物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了200 余種水通道蛋白，其中存在哺乳動物體內(nèi)的有13 種。概述了水通道蛋白的結(jié)構(gòu)、組織特異性分布及特異性通透機理。關(guān)鍵詞 水通道蛋白 水分跨膜轉(zhuǎn)運 水分子的跨膜轉(zhuǎn)運對維持不同區(qū)域的液體平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)非常重要。水分子作為一種不帶電荷且半徑極小的極性分子，很早被證實能通過自由擴散穿透脂質(zhì)雙分子層。在發(fā)現(xiàn)水通道蛋白以前，人們一直認為這是水分子透過質(zhì)膜的唯一方式。但通過實驗發(fā)現(xiàn)，紅

2、細胞和腎小管細胞中水的通透速率之快遠非簡單擴散強度所能提供的， 因此猜測，質(zhì)膜上可能存在某種通道介導水的轉(zhuǎn)運。1 水通道蛋白的發(fā)現(xiàn)1988年，Agre 等從人類紅細胞膜上純化分離分子量為32106 的Rh 多肽時，偶然鑒定到一種新的分子量為28106 的整合膜蛋白， 并且通過免疫印跡發(fā)現(xiàn)這類蛋白也存在于腎臟的近端腎小管中1，把它稱為類通道整合膜蛋白（channel-like integralmembrane protein, CHIP28）。隨后，在1991 年Agre和Preston 成功克隆得到了CHIP28 的cDNA，通過分析其編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)CHIP28 含有6個跨膜區(qū)域、2個

3、N-糖基化位點、且N 端和C 端都位于膜的胞質(zhì)一側(cè)。另外，對比CHIP28 與早期從牛晶體纖維中克隆得到的主要內(nèi)源性蛋白（major intrinsicprotein,MIP）的DNA 序列，發(fā)現(xiàn)二者具有高度同源性。由于很早以前就證實了MIP 家族的成員蛋白參與形成允許水和其他小分子通透的膜通道，因此，推測CHIP28 可能也具有類似功能2。1992 年，Preston 等通過在非洲爪蟾的卵母細胞中表達CHIP28， 首次證實它是一種水通道蛋白。非洲爪蟾的卵母細胞對水具有極低的滲透性，當向其中顯微注射體外轉(zhuǎn)錄的CHIP28 的RNA后，卵母細胞在低滲溶液中迅速膨脹，并于5 min內(nèi)破裂。這一現(xiàn)

4、象表明注射CHIP28 的RNA 后卵母細胞膜的水通透性有了明顯提高。為了進一步確定CHIP28 的功能，將提純的CHIP28 構(gòu)建在蛋白磷脂體中， 構(gòu)建后的蛋白磷脂體對水的通透性增長了50 倍，但對尿素卻不具備通透性3。這些結(jié)果最終證實了CHIP28 為水通道蛋白， 后來它被命名為水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP1）。水通道蛋白的發(fā)現(xiàn)，開辟了一個嶄新的領(lǐng)域。隨著更多亞型的發(fā)現(xiàn)， 水通道蛋白相關(guān)研究成為了膜轉(zhuǎn)運方向的研究熱點，Agre 也因其對水通道蛋白做出的突出貢獻而獲得2003 年諾貝爾化學獎。2 水通道蛋白的分子結(jié)構(gòu)水通道蛋白分布廣泛，目前已在哺乳動物、兩棲類、植物、酵母、

5、細菌以及各種各樣的有機體中發(fā)現(xiàn)水通道蛋白的存在。水通道蛋白是一類高度保守的疏水小分子膜整合蛋白， 各種亞型之間蛋白序列及三維結(jié)構(gòu)非常相似。哺乳動物水通道蛋白的分子大小在2610634106 之間， 氨基酸序列同源性為19%52%4。因水通道蛋白的三維結(jié)構(gòu)相似，一般以AQP1的結(jié)構(gòu)作為代表。AQP1 是一條由269 個氨基酸殘基構(gòu)成的單肽鏈，對比AQP1 分子前后半段的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)2 段序列具有相關(guān)性，推測AQP1在進化上可能是通過基因復制而來。單肽鏈在細胞膜上往返折疊形成6 個 螺旋的跨膜區(qū)域， 并且肽鏈的N 端和C 端都位于質(zhì)膜內(nèi)側(cè)；6 個跨膜區(qū)域由5 條環(huán)（AE loop）相連。目前，

6、被人們廣為接受的水通道蛋白三維結(jié)構(gòu)是“ 沙漏模型（hourglassmodel）”4，模型指出：肽鏈中的B 環(huán)和E 環(huán)具有高度保守的天冬酰胺- 脯氨酸- 丙氨酸（Asn -Pro -Ala，NPA）特征性序列，B 環(huán)和E 環(huán)折返進入膜雙分子層，2個保守的NPA 序列在膜的磷脂雙層中間位置相互結(jié)合，6 條跨膜區(qū)域在四周包圍， 共同構(gòu)成了一個供水分子通過的親水通道（圖1）。通過對AQP1 的三維結(jié)構(gòu)進一步研究發(fā)現(xiàn)，B環(huán)和E 環(huán)折返入膜后分別形成短螺旋B（HB）和短螺旋E（HE），中心孔道處起穩(wěn)定作用的2 條NPA基序幾乎呈90交叉，所形成的親水通道的直徑約為2.81010 m，剛好能容納單個水分子

7、通過，外圍6 條跨膜區(qū)域呈現(xiàn)右手螺旋包圍。構(gòu)成中心孔道表面的除B 環(huán)和E 環(huán)外，還有螺旋2、5 以及螺旋1、4 的C 端部分。有研究指出，將B 環(huán)和E 環(huán)聯(lián)系在一起的作用力主要是2 條NPA 基序中脯氨酸殘基間的范德華力，同時也受到離子鍵和氫鍵的穩(wěn)定。幾乎所有AQP 分子的B 環(huán)和E 環(huán)上都有高度保守的NPA 特征性序列。但也有少數(shù)例外： 在AQP11 和AQP12 中僅發(fā)現(xiàn)E 環(huán)上具有NPA 序列，另一個在B 環(huán)上的NPA 序列分別由天冬酰胺-脯氨酸-半胱氨酸（Asn-Pro-Cys,NPC）和天冬酰胺-脯氨酸-蘇氨酸（Asn-Pro-Thr,NPT）替代6。在體內(nèi)，AQP1 主要以同源四聚

8、體的形式存在。研究發(fā)現(xiàn)，四聚體中某個水通道蛋白單體發(fā)生突變并不會影響其他3 個蛋白單體的功能，即每一個水通道蛋白單體是一個獨立的功能單位。水分子的跨膜滲透是通過水通道蛋白單體的中心通道完成的，而無法通過中聚體的中央孔洞（4 個單體銜接處的中心縫隙）7。每個單體通過跨膜的 螺旋與鄰近的2 個單體相互作用。這些相互作用很有可能受到一些氨基酸殘基之間的氫鍵的穩(wěn)固。3 水通道蛋白的種類迄今為止，已有200 余種水通道蛋白在不同物種中被發(fā)現(xiàn)， 其中存在于哺乳動物體內(nèi)的水通道亞型有13 種，即AQP0-AQP12（見下表）。根據(jù)它們的基因結(jié)構(gòu)和通透性，這13 種水通道蛋白可劃分為3 組： 傳統(tǒng)水通道蛋白（

9、orthodox aquaporins）（ 包括AQP0、1、2、4、5、6、10）、甘油水通道蛋白（aquaglyceroporins）（ 包括AQP3、7、9） 和未明確分類的AQP8、11、12。目前對哺乳動物中較早發(fā)現(xiàn)的10 個水通道蛋白AQP0AQP9 研究較為透徹， 它們的功能也通過人類疾病的鑒定及對基因缺失小鼠的研究而被鑒定； 而較近發(fā)現(xiàn)的3 個成員AQP10AQP12 則相對研究較少，它們的胞內(nèi)定位及表達異常導致的人類疾病都還未被鑒定8。4 水分子特異性通透機理水通道蛋白對水分子具有高度選擇性。大部分水通道蛋白嚴格排斥除水分子以外的所有物質(zhì)通過， 包括結(jié)合水分子的氫離子（ 水合

10、氫離子，H3O+）、甘油和各種離子等，但也有部分水通道蛋白對甘油等小分子中性溶質(zhì)具有通透性。AQP1膜蛋白的密度可達到大于109 個/m2，。這一密度遠遠高于普遍的離子通道的密度（除突觸后膜上的乙酰膽堿受體外，大多小于1 個/m2）。水通道蛋白是怎樣對水分子進行嚴格篩選的呢？ 首先，通道的空間大小只能容納單個水分子，限制了比水分子大的分子通過。以對水分子具有專一通透性的AQP1 為例，AQP1 的中心通道呈啞鈴狀，狹口處在脂雙層中央B 環(huán)和E 環(huán)相互作用的NPA 序列位置附近。構(gòu)成中心孔道表面的氨基酸殘基中，親水和疏水的殘基數(shù)量基本是對等的。這些親水殘基在對水分子去水化過程中有重要作用。另外，

11、中心孔道最窄處由4 個殘基構(gòu)成，包括親水的His180、Arg195、Cys189 和疏水的Phe56。雖然這一縮口只有1 個氨基酸殘基的跨度， 但是它2.81010 m 的直徑仍然阻斷了比水分子大的離子和溶質(zhì)的通過。因此，這4 個殘基的變化都可以對水通道的選擇性產(chǎn)生影響。根據(jù)已有研究可知，His180 在只對水具有通透性的水通道蛋白中高度保守， 但在一些對甘油也具通透性的水通道蛋白，如GlpF 中則被甘氨酸殘基代替11。另一個困擾人們已久的問題是何種機制阻斷了水道蛋白對質(zhì)子的跨膜運輸。早在短桿菌肽中的研究就已表明， 水可以以連續(xù)不斷的方式通過膜上的開放孔,這種水分子排列成一條直線、質(zhì)子由一個

12、水分子傳遞到另一個水分子、并伴隨著氫鍵的斷裂和重建的過程，被研究者稱為“Grotthus 效應”。既然水通道蛋白對水具有特異通透性, 那么可通過“Grotthus效應”傳遞的質(zhì)子運輸又是怎樣被阻斷的呢？目前被較多人接受的另一個機制是在NPA 序列處有1對偶極子對水分子起著定向作用。在每個水通道的中心位置，NPA 序列上的Asn76 和Asn192 的氨基向孔道最窄處延伸。此時，位于此處的水分子與其鄰近的水分子之間的氫鍵發(fā)生斷裂，其氧原子替代性地與Asn76 和Asn192 的氨基形成氫鍵。這一變化重排了水的分子軌道，使最窄處水分子的2 個氫原子定向到與通道軸線垂直的方向（圖2）。因此，中心處水

13、分子的2 個氫原子無法與周圍鄰近的水分子形成氫鍵；另外，在通道最窄處的殘基附近的氨基酸殘基都是疏水的，因此不會有另外的殘基與水分子的2 個氫原子形成氫鍵。這一模式使得位于通道上下2 部分中的水分子在取向上相反，不利于形成氫鍵鏈，從而也阻斷了質(zhì)子通過“Grotthus 效應”完成連續(xù)傳輸，同時，因為疏水氨基酸不參與形成氫鍵，也保證了水分子在通過孔道時只需要跨越一個相當?shù)偷哪芰空系K7，12。a：NPA 基序上的偶極矩改變了中心水分子的定向， 使通道上下水分子取向相反。b，c：水分子與Asn192、Asn76 的氨基形成氫鍵，水分子的2 個氫原子重定向至與通道軸線垂直7據(jù)已有研究， 水通道蛋白幾乎嚴

14、格排斥其他所有離子。從理論上來說， 水合化的離子直徑為7.161010 m，而去水合化的離子只有1.91010 m的直徑，是可以通過最窄處為2.81010 m 的中心通道的。孔道狹窄的陽離子通道就具有使離子去水合化的能力， 如KcsA 鉀通道中就有16 個羰基氧以4 個每環(huán)的結(jié)構(gòu)垛疊排列， 這一結(jié)構(gòu)具有分離與離子水合的水分子的能力。而AQP1 中孔道中的羰基氧的結(jié)構(gòu)雖然足以分離體相水中的水分子，但是只能使水合離子部分去水合化，而后者則因直徑仍大于狹口直徑而無法通過水通道13。主要參考文獻1 Denker B.M.， Smith B.L.， Kuhajda F.P. et al . Identification，purification， and partial characterization of a novel Mr 28000integral membrane protein from erythrocytes and renal tubulesJ Biol Chem，1988，263(3):15634.2 Preston G. M.， Agre P. Isolation of the cDNA for erythrocyteintegral membrane protein of 28 kilodaltons:member of an ancient