應(yīng)用不同物理加強條件的Ⅰ型膠原支架的大白鼠動物模型與組織學(xué)分析

1、www.CRTER.org張聰，等. 應(yīng)用不同物理加強條件的型膠原支架的大白鼠動物模型與組織學(xué)分析應(yīng)用不同物理加強條件的型膠原支架的大白鼠動物模型與組織學(xué)分析張 聰1，張艷勤1，Mark Spilker1，3，Myron Spector2，李登云1，魯玉梅1，許和平1，2(1北京銀河巴馬生物技術(shù)股份有限公司，北京市 101111；2美國哈佛醫(yī)學(xué)院，美國波士頓 02138；3美國骨骼肌肉移植基金會，美國 02101)引用本文：張聰，張艷勤，Mark Spilker，Myron Spector，李登云，魯玉梅，許和平. 應(yīng)用不同物理加強條件的型膠原支架的大白鼠動物模型與組織學(xué)分析J.中國組織工程研

2、究，2016，20(12):1745-1752.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.12.011 ORCID: 0000-0003-1551-8550(許和平)文章快速閱讀：張聰，女，1985年生，吉林省松原市乾安縣人，漢族，2012年甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)，碩士，主要從事膠原材料制作及應(yīng)用方面的研究。 通訊作者：許和平，博士，教授，北京銀河巴馬生物技術(shù)股份有限公司，北京市 101111；美國哈佛醫(yī)學(xué)院，波士頓 02138中圖分類號:R318文獻標(biāo)識碼:A文章編號:2095-4344(2016)12-01745-08稿件接受：2016-01-07http:/WWW.c

3、膠原支架動物皮下置入生物相容性實驗105 /24 h高溫脫水進行交聯(lián)加強驗證采用不同條件的高溫脫水物理交聯(lián)方法對膠原支架的抗降解能力的變化將高純度保持三螺旋結(jié)構(gòu)的動物源性型膠原制成膜狀支架置入后第3，14，42天，取出標(biāo)本進行組織學(xué)檢查與分析置入大白鼠背部皮下組織105 /48 h高溫脫水進行交聯(lián)加強115 /24 h高溫脫水進行交聯(lián)加強 文題釋義：交聯(lián)加強反應(yīng)：不經(jīng)任何交聯(lián)加強的膠原在體內(nèi)極易被膠原酶降解吸收。對于自體膠原以外的膠原物質(zhì)不經(jīng)交聯(lián)其在機體內(nèi)的組織反應(yīng)較強。為了提高其抗降解能力、減少異物/免疫反應(yīng)，提高物質(zhì)的某些理化性能，需采用物理或化學(xué)方法對其進行交聯(lián)加強。去除

4、或替代肽鏈結(jié)構(gòu)中某些離子或基團，使肽鏈中蛋白分子間形成暫時或永久性的聯(lián)結(jié)，使其膠原纖維中蛋白分子在體內(nèi)抗膠原酶降解性能以及對-平滑肌收縮蛋白的抗收縮能力得到改善與提高。膠原：是哺乳動物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)(占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%-30%)，它是細胞外間質(zhì)的主要成分，是形成細胞生長外環(huán)境的重要物質(zhì)。 而型膠原是體內(nèi)諸多膠原種類中的一種，是絕大多數(shù)組織細胞生存所需要的物質(zhì)，占體內(nèi)膠原總量的90%，如皮膚，骨，肌腱，周圍神經(jīng)，腦膜，血管等。摘要背景：為改善膠原支架的降解性能，作者對膠原支架的高溫脫水物理交聯(lián)方法進行了改進，將交聯(lián)時間由24 h增加到48 h，將交聯(lián)溫度由105 提高到115 。目的

5、：驗證改進高溫脫水物理交聯(lián)方法制備膠原支架的抗降解能力，獲取支架在體內(nèi)對受損組織修復(fù)與再生的最佳功效。方法：將高純度保持三螺旋結(jié)構(gòu)的動物源性型膠原制成膜狀支架，分別采取3種不同條件的高溫脫水進行交聯(lián)加強(105 /24 h、105 /48 h、115 /24 h)，將1 cm×1 cm的材料置入大白鼠背部皮下組織，在置入后第3，14，42天處死，取出標(biāo)本進行組織學(xué)檢查與分析。結(jié)果與結(jié)論：實驗表明，3組內(nèi)置物在機體內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)嚴重的異物及特異性免疫機能性反應(yīng)，采用105 / 48 h加強條件處理的膠原支架，置入后14 d在體內(nèi)的存留及保持孔隙開放程度均較其他兩組好(P < 0.05

6、)，間接表明將交聯(lián)加強時間從常規(guī)24 h延至48 h可以增強膠原支架在體內(nèi)的抗降解性能。關(guān)鍵詞：生物材料；材料相容性；膠原；支架；高溫脫水；交聯(lián)；降解；組織再生主題詞：膠原；支架；組織工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Histological evaluation of type I collagen scaffolds preparde under different dehydrothermal cross-linking conditions in a rat model Zhang Cong1, Zhang Yan-qin1, Mar

7、k Spilker1, 3, Myron Spector2, Li Deng-yun1, Lu Yu-mei1, Xu He-ping1, 2 (1BJ YH Biomax Biologic Technologies Co., Beijing 101111, China; 2Harvard Medical School, Boston 02138, USA; 3MTF, USA)AbstractBACKGROUND: In previous studies, the dehydrothermal cross-linking method was modified by the authors

8、to improve the degradation property of collagen scaffolds. The cross-linking time was increased from 24 to 48 hours, and the cross-linking temperature increased from 105 to 115 .OBJECTIVE: To verify the anti-degradation ability of collagen scaffolds prepared using the modified dehydrothermal cross-l

9、inking method and to obtain the optimal efficacy of the scaffolds on damaged tissue repair and regeneration.METHODS: Highly-purified type I collagen scaffolds with native triple helix structure were prepared and subjected to three different dehydrothermal cross-linking conditions: 105 for 24 hours,

10、105 for 48 hours and 115 for 24 hours. Material samples, 1 cm×1 cm, were implanted subcutaneously into the rat dorsum. The specimens were harvested at 3 days, 14 days and 42 postoperative days followed by fixation and histological analysis using hematoxylin-eosin staining.RESULTS AND CONCLUSION

11、: No untoward foreign body and immunological reactions were observed in any groups. In the group of 105 for 48 hours, the scaffold retention and degree of pore openness were better than the other two groups at 14 days after scaffold implantation (P < 0.05). These findings indirectly suggest that

12、the anti-degradation ability of collagen scaffolds can be strengthened under certain dehydrothermal cross-linking conditions: the cross-linking time is increased from 24 to 48 hours.Subject headings: Collagen; Stents; Tissue EngineeringCite this article: Zhang C, Zhang YQ, Spilke M, Spector M, Li DY

13、, Lu YM, Xu HP. Histological evaluation of type I collagen scaffolds preparde under different dehydrothermal cross-linking conditions in a rat model. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(12):Zhang Cong, Master, J YH Biomax Biologic Technologies Co., Beijing 101111, ChinaCorresponding author: Xu

14、He-ping, M.D., Professor, BJ YH Biomax Biologic Technologies Co., Beijing 101111, China; Harvard Medical School, Boston 02138, USA1745-1752.1749ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction組織工程學(xué)與再生醫(yī)學(xué)是21世紀(jì)高速發(fā)展的一種新型學(xué)科，其利用良好的生物材料、不同種類的細胞及組織生長因子，在機體器官或組織病變受損部位進行修復(fù)、再生，這種高科技理念、技術(shù)與方法可以應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的各個

15、領(lǐng)域，是21世紀(jì)醫(yī)學(xué)科學(xué)的重大發(fā)展。在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，同時運用兩至三種材料進行臨床使用并取得藥品檢驗機構(gòu)的認可批準(zhǔn)，到目前為止不多。組織工程學(xué)與再生醫(yī)學(xué)3大因素中生物材料的選擇與使用有著特殊的要求，單獨運用適當(dāng)?shù)纳锊牧闲迯?fù)機體損傷組織也可以起到明顯的效果。型膠原是人體內(nèi)有著重要生理功能的細胞外間質(zhì)，對組織器官的結(jié)構(gòu)組成起著至關(guān)重要的作用。由牛跟腱中提取的高純度保持三螺旋結(jié)構(gòu)的型膠原是一種天然生物組織材料，有著良好的組織相容性，經(jīng)加工制作的膠原支架，在神經(jīng)外科、骨科中已被廣泛使用。天然的未經(jīng)交聯(lián)加強的型膠原支架在體內(nèi)極易被特異性膠原酶分解代謝，而不能很好地發(fā)揮細胞外間質(zhì)的支架作用，使

16、受損部位細胞和某些未分化前質(zhì)細胞不能充分利用支架所提供的空間與時間得以移行、分化、再生與重塑，導(dǎo)致受損組織與器官得不到良好的修復(fù)與再生1。采用某些物理化學(xué)方法去除或替代肽鏈結(jié)構(gòu)中某些離子或基團，在肽鏈中蛋白分子間形成永久或暫時性的交聯(lián)，使其膠原纖維中蛋白分子在體內(nèi)抗膠原酶降解性能及對-平滑肌收縮蛋白的抗收縮能力得到改善與提高，延長支架在體內(nèi)的存留和保持孔隙開放狀態(tài)2，從而使體內(nèi)受損部位的健康組織細胞及未分化前質(zhì)細胞有充足的時間在支架內(nèi)修復(fù)再生，進而生成正常的組織細胞而再分泌自身細胞外間質(zhì)，促進新生細胞的分化與生長，最終形成具有正常功能的組織與器官3-6。高溫脫水交聯(lián)加強是一種有效的物理加強方法

17、，肽鏈中蛋白分子中水分子游離基(H+)的轉(zhuǎn)換形成肽鍵間的交聯(lián)結(jié)合，結(jié)果顯示：經(jīng)高溫脫水處理后的膠原螺旋結(jié)構(gòu)盤繞轉(zhuǎn)變溫度增強，在保持三螺旋結(jié)構(gòu)的情況下提高了膠原的熱穩(wěn)定性，同時增強了膠原支架的抗降解能力7-8。型膠原產(chǎn)品的常規(guī)高溫脫水加強條件通常為105 / 24 h。在以往的研究中，將型膠原加定量的硫酸軟骨素制成膠原支架，經(jīng)常規(guī)高溫脫水交聯(lián)加強后置入大白鼠皮下組織，支架降解時間為7-10 d9-10。作者設(shè)計了采用單一成分的高純度保持三螺旋結(jié)構(gòu)的型膠原支架并對其進行延時(從24 h延長至48 h)和升溫(從105 提升為115 )交聯(lián)加強實驗，以觀察其在體內(nèi)抗降解性能的變化。通過不同條件下交聯(lián)

18、加強的膠原支架動物皮下置入生物相容性實驗，觀察改變加強條件后支架在機體內(nèi)的變化，以期達到提高支架在體內(nèi)抗膠原酶降解及抗-平滑肌收縮蛋白的能力，達到更加完善的組織再生及抗粘連效果。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計 對比觀察動物實驗。1.2 時間及地點 于2011年10月17日至11月28日在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部進行。1.3 材料 實驗采用由牛跟腱中提取的高純度保持三螺旋結(jié)構(gòu)的非溶性型膠原，經(jīng)冷凍干燥技術(shù)制成材料濃度為0.5%、厚度5 mm、孔隙在100-250 µm的三維膜狀膠原支架，材料制成后采用3種不同條件高溫脫水方法對支架進行交聯(lián)加

19、強(105 /24 h、105 /48 h、115 /24 h)，其后將交聯(lián)后的支架制成10 mm×10 mm×5 mm的樣品，應(yīng)用環(huán)氧乙烷氣體進行滅菌 11。 實驗動物：健康成年雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量150-250 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供。將24只大鼠隨機分為3組，分別為105 /24 h組、105 /48 h組、115 /24 h組，每組8只。1.4 實驗方法 取3組SD大鼠，以50 mg/kg異戊巴比妥鈉行腹膜內(nèi)麻醉，所有手術(shù)均在無菌外科技術(shù)下進行。以鼠背中線橫切口上下5 cm的左上、左下、右上和右下，將4塊10 mm×10 mm

20、5;5 mm的膠原支架樣品分別置入，其后常規(guī)閉合傷口，每組對應(yīng)置入交聯(lián)加強條件的膠原支架樣品。術(shù)后按實驗動物管理條例進行飼養(yǎng)。1.5 主要觀察指標(biāo) 置入后3 d(n=3)、14 d(n=3)、42 d(n=2)處死動物，同時對手術(shù)內(nèi)置部位的皮膚進行大體觀察，并將包括4個標(biāo)本在內(nèi)的整個背部皮膚切除，將標(biāo)本置于體積分數(shù)10%甲醛溶液中固定24 h，其后再描述內(nèi)置樣品位置、大小及炎癥情況。以殘存材料或局部炎性反應(yīng)為中心周邊1 cm范圍切除標(biāo)本。經(jīng)脫水、石蠟包埋后制成6 m切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，對標(biāo)本進行組織學(xué)分析，觀察與評價植入物的降解程度、孔隙變化、組織細胞反應(yīng)、瘢痕及新生組織形成。1.6 統(tǒng)

21、計學(xué)分析 應(yīng)用Statview 5.0.1統(tǒng)計學(xué)軟件，統(tǒng)計學(xué)方法為Fishers PLSD法。2 結(jié)果 Results 2.1 實驗動物數(shù)量分析 24只動物無感染、死亡發(fā)生，均進入結(jié)果分析。2.2 大體觀察 所有動物皮膚與皮下組織中沒有嚴重粘連、出血、組織變性、壞死及惡性增生等現(xiàn)象，見圖1。置入后3 d：經(jīng)3種不同條件高溫脫水交聯(lián)加強的型膠原支架，100%存留于皮下組織且均有所改變，其中包括內(nèi)置物的形態(tài)、大小及其周邊的組織變化，膠原支架保持完好，界限清晰且被軟組織完全包裹，其中105 /24 h組膠原支架呈現(xiàn)收縮變形；105 /48 h組和115 /24 h組膠原支架顯示少許收縮變形，支架周圍

22、有較為明顯的炎性反應(yīng)，可見周圍毛細血管增生，局部組織略顯增厚。 置入后14 d：膠原支架形態(tài)變化明顯，均有不同程度降解，約80%的支架存于皮下組織，其邊界較為模糊。所有殘留膠原支架均有較大程度的形態(tài)改變，收縮明顯，形態(tài)多呈圓形或橢圓形，其中105 /24 h組膠原支架呈現(xiàn)收縮變形或被降解吸收；105 /48 h組殘留支架較多，保持良好且形態(tài)完整；115 /24 h組膠原支架明顯收縮變形，降解吸收顯著，105 /48 h組與115 /24 h組膠原支架周圍有較明顯的毛細血管增生。 置入后42 d：膠原支架被完全降解吸收，沒有發(fā)現(xiàn)存留于皮下組織或能被肉眼鑒別在軟組織中存在的痕跡。3組膠原支架內(nèi)置部

23、位及周圍無明顯炎性反應(yīng)，少許周圍毛細血管增生，有些部位皮下組織有少許增厚。2.3 顯微鏡組織學(xué)觀察置入后3 d：105 /24 h組：支架邊緣清晰，周圍有少許或中等程度組織反應(yīng)，膠原孔隙邊緣收縮較中心嚴重，支架邊緣細胞浸潤明顯且多由兩端向外周邊浸潤；10倍顯微鏡下觀察顯示，材料邊緣有少許組織反應(yīng)，細胞生長活躍，細胞由支架邊緣向中間移行，支架中心有少許或多無移行細胞，支架邊緣的孔隙因-平滑肌收縮蛋白作用而收縮；20倍顯微鏡下觀察顯示，支架內(nèi)部孔隙保持明顯的開放狀態(tài)，但邊緣孔隙收縮明顯，同時可見支架邊緣新生血管的存在；高倍鏡下觀察細胞多由淋巴細胞及巨噬細胞浸潤，見圖2。105 /48 h組：低倍鏡

24、下觀察可以發(fā)現(xiàn)支架邊緣清晰，周圍有少許或中等程度組織反應(yīng)，支架邊緣孔隙收縮程度較中心明顯，但均呈開放狀態(tài)。整體支架孔隙開放，特別是中心孔隙保持開放程度較105 /24 h組更為明顯，邊緣細胞同樣是由兩端向外周中心浸潤，支架的皮下組織反應(yīng)相對于105 /24 h組為多。顯微鏡下顯示支架經(jīng)延時交聯(lián)圖1 支架置入大白鼠背部皮下的大體標(biāo)本表現(xiàn)Figure 1 Macroscopic manifestation of a collagen scaffold subcutaneously implanted in a rat model圖注：圖中A為105 /48 h交聯(lián)加強膠原支架術(shù)中皮下內(nèi)置情況；B為

25、同一動物在置入14 d后處死，皮下觀察顯示膠原支架仍保持明顯輪廓(箭頭)，無感染，無炎性反應(yīng)。 ABBCDA×40×20×4×10 C圖2 置入后3 d 105 /24 h組膠原支架的組織觀察(蘇木精-伊紅染色)Figure 2 Histological observation in 105 /24 hours cross-linking group at 3 days after implantation (hematoxylin-eosin staining)圖注：圖中A顯示膠原支架輪廓清晰，無粘連，稍許新生組織在材料底部生成；B顯示膠原支架內(nèi)部孔隙

26、保持開放狀態(tài)(空白箭頭)，周邊致密新生組織環(huán)繞支架材料(黑細箭頭)；C顯示致密的纖維組織層內(nèi)呈現(xiàn)較多細胞浸潤(黑細箭頭)，同時少許細胞移行至支架內(nèi)部孔隙中(黑細箭頭)?？梢娦律苄纬?白箭頭)；D顯示在支架邊緣呈現(xiàn)多種細胞聚集，但以淋巴細胞為多，偶見巨噬細胞。DCBA×40×20×20×4圖3 置入后3 d 105 /24 h組膠原支架的組織觀察(蘇木精-伊紅染色)Figure 3 Histological observation in 105 /48 hours cross-linking group at 3 days after implanta

27、tion (hematoxylin-eosin staining)圖注：圖中A顯示膠原支架輪廓清晰，與皮膚無粘連，支架基底部少許反應(yīng)(黑細箭頭)；B顯示有組織反應(yīng)開始由膠原支架側(cè)端向材料上下浸潤(黑細箭頭)，材料孔隙保持開放；C顯示支架內(nèi)部孔隙清晰，邊緣孔隙較內(nèi)部收縮率高且呈扁平(黑細箭頭)，未見明顯細胞浸潤；D顯示細胞多見于之間底部(白箭頭)，稍許細胞移行浸入孔隙內(nèi)，并貼于膠原孔隙內(nèi)壁(黑粗箭頭)。DCBA×10×40×10×4圖4 置入后3 d 115 /24 h組膠原支架的組織觀察(蘇木精-伊紅染色)Figure 4 Histological ob

28、servation in 115 /24 hours cross-linking group at 3 days after implantation (hematoxylin-eosin staining)圖注：圖中A顯示膠原支架收縮明顯，周圍組織反應(yīng)重(黑細箭頭)；B顯示膠原支架邊緣孔隙密集收縮，外周細胞浸潤呈組織炎性反應(yīng)；C顯示新生外周炎性反應(yīng)中伴有血管增生(黑細箭頭)，同時活躍的細胞在膠原外周浸潤形成致密的細胞層(白箭頭)；D顯示淋巴細胞、巨噬細胞在邊緣密集存在。后，細胞組織學(xué)反應(yīng)表現(xiàn)與105 /24 h組近似。未分化的細胞及組織反應(yīng)細胞從端側(cè)向支架內(nèi)部中間移行，鏡下可見在支架中部孔隙

29、內(nèi)有移行停滯的細胞附著于膠原孔隙壁上；高倍鏡下觀察基底部位細胞反應(yīng)較強，可見淋巴細胞和巨噬細胞及特有的未分化細胞，同時伴有新生血管，見圖3。115 /24 h組：低倍鏡下觀察1753ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHDCBA×40×40×40×4圖5 置入14 d 105 /24 h組膠原支架的組織觀察(蘇木精-伊紅染色)Figure 5 Histological observation in 105 °C/24 hours cross-linking group at 14 days after

30、 implantation (hematoxylin-eosin staining)圖注：圖中A顯示膠原支架已開始降解吸收并留有膠原殘片，外周有成熟的新生組織形成；B顯示有序的纖維組織形成，成纖維細胞排列有序(白箭頭)，其間有淋巴細胞(黑細箭頭)以及未分化細胞(黑粗箭頭)；C顯示大量浸潤細胞存在于代謝膠原支架中，同時內(nèi)部血管形成(白箭頭)表明再生的組織正在形成；D偏光顯微鏡透明光帶(白箭頭)顯示膠原組織形成。DCBA×40×40×20×4圖6 置入后14 d 105 /48 h組膠原支架的組織觀察(蘇木精-伊紅染色)Figure 6 Histologic

31、al observation in 105 /48 hours cross-linking group at 14 days after implantation (hematoxylin-eosin staining)圖注：圖中A顯示標(biāo)本支架橫切面，膠原支架周邊較致密，支架孔隙收縮(黑細箭頭)，但支架中部孔隙保持開放狀態(tài)(黑粗箭頭)；B顯示支架開放孔隙內(nèi)有移行細胞生存(白箭頭)，膠原支架壁變粗顯示材料開始降解；C顯示新生顯微毛細血管形成出現(xiàn)(黑細箭頭)，膠原纖維束狀形成(黑粗箭頭)，可見成纖維細胞(黑細箭頭)；D偏光鏡下顯示較多的新生膠原纖維組織形成(白實箭頭)。DCBA×40&#

32、215;40×20×4圖7 置入后14 d 115 /24 h組膠原支架的組織觀察(蘇木精-伊紅染色)Figure 7 Histological observation in 115 /24 hours cross-linking group at 14 days after implantation (hematoxylin-eosin staining)圖注：圖中A顯示膠原支架整體收縮嚴重，密度增大，開放孔隙基本閉縮；B顯示殘留膠原支架纖維大量細胞浸潤及類瘢痕組織反應(yīng)(白箭頭)；C顯示殘留膠原支架膠原纖維及細胞浸潤；D顯示豐富的血管增生，橫向(白箭頭)和縱向(黑粗箭頭)

33、交叉分布。DCBA×40×40×10×4圖8 置入后42 d 105 /48 h組膠原支架的組織觀察(蘇木精-伊紅染色)Figure 8 Histological observation in 105 /48 hours cross-linking group at 42 days after implantation (hematoxylin-eosin staining)圖注：圖中A顯示膠原支架基本降解吸收，皮下膠原及肌肉密度明顯增高、組織增厚；B顯示伴隨新生血管(黑細箭頭)周圍的新膠原組織肥大、增粗成束；C顯示新生組織中仍可見淋巴細胞(黑細箭頭)，

34、但以未分化細胞(白箭頭)和成纖維細胞(黑粗箭頭)占有主要成分；D偏光顯微鏡檢查可見新肥大膠原纖維(白箭頭)的偏光影像。殘留支架邊緣清晰，外周孔隙收縮顯著，支架體積縮小，材料周圍有較為明顯的組織反應(yīng)，支架孔隙邊緣收縮較中心更為嚴重，細胞多由兩端邊緣向邊周浸潤明顯，支架在皮下的組織反應(yīng)較其他兩組都嚴重，殘留的支架中心可見少許細胞存在；10倍顯微鏡下觀察顯示支架邊緣孔隙密集收縮，外周細胞浸潤成組織炎性反應(yīng)，新生外周炎性反應(yīng)中伴有血管增生，同時活躍的細胞在膠原外周浸潤形成致密的細胞層；40倍顯微鏡下觀察膠原支架外周聚集較多的淋巴細胞和巨噬細胞，見圖4。綜上所見，3組內(nèi)置膠原支架以不同形態(tài)與大小100%

35、存留于皮下組織。保持較低溫度的交聯(lián)加強時間有所不同，但在組織形態(tài)學(xué)方面顯現(xiàn)無巨大差異，細胞組織反應(yīng)較輕；而115 /24 h組局部炎性反應(yīng)較重。3組新生組織中伴有少許新生血管，支架均顯示開放孔隙，其中115 /24 h組支架整體收縮明顯，孔隙收縮明顯；而105 /48 h組支架內(nèi)部保持孔隙開放性較其他組更佳。3組支架中部均可見少許細胞移行浸潤，以105 / 48 h組細胞附著最佳，115 /24 h組支架基底部的細胞反應(yīng)較嚴重，各組支架與皮膚無明顯粘連和瘢痕形成。置入后14 d：105 /24 h組：通常以大白鼠背部檢測型膠原+氨基葡糖膠原支架的生物相容性試驗，術(shù)后14 d觀察其內(nèi)置物均已降解

36、吸收9-10。但采用單一的型膠原為材料的支架，置入后14 d均有不同程度的殘留。低倍顯微鏡下觀察顯示膠原支架均已呈現(xiàn)不同程度的降解吸收，大量細胞浸潤并保持于支架孔隙或基質(zhì)內(nèi)；高倍顯微鏡下觀察顯示有序的纖維組織形成，成纖維細胞排列有序，其間仍有較多的淋巴細胞及巨噬細胞存在，同時伴有更多的未分化細胞浸潤，組織中的新生血管形成，表明組織再生過程的進行；偏光顯微鏡透明光帶進一步顯示新生膠原組織的形成，見圖5。105 /48 h組：4倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，膠原支架保存完好，清晰可見；其邊緣較105 /24 h組更為清晰，且支架中心孔隙仍保持良好的開放狀態(tài)。支架周圍有中等程度組織反應(yīng)，支架邊緣細胞呈包裹性浸

37、潤，大量細胞在殘留膠原支架中移行分化。20倍顯微鏡下觀察膠原支架孔隙中有大量活躍細胞，但中心開放孔隙中細胞數(shù)量仍較邊緣及近邊緣支架中的細胞數(shù)量為少。40倍顯微鏡下觀察顯示在孔隙中的細胞多以淋巴細胞、未分化細胞為主。在新生血管周圍新生的膠原組織開始形成并成束狀排列，組成粗大膠原纖維。采用偏光顯微鏡觀察視野內(nèi)較多的透亮的膠原纖維組織呈現(xiàn)，膠原組織形成量較105 /24 h組多，見圖6。115 /24 h組：此組膠原支架在體內(nèi)的生物學(xué)反應(yīng)較其他兩組明顯，且膠原支架多數(shù)已降解吸收，在顯微鏡下觀察支架的膠原纖維基本降解，支架收縮嚴重且趨于降解吸收，其現(xiàn)象間接表明提高溫度的高溫脫水交聯(lián)加強中遠期效果較差、

38、降解快、抗收縮能力弱。顯微鏡下觀察顯示支架整體收縮嚴重，密度增大，開放孔隙基本閉縮，邊緣有較多新生組織或類瘢痕形成，膠原支架的膠原纖維僅少量存在，大量細胞浸潤；鏡下可觀察殘留膠原支架，膠原纖維及豐富的細胞浸潤，豐富的血管增生，橫向和縱向交叉分布，見圖7。3組膠原支架在皮下組織中有較大的差異，支架仍存在于皮下組織中，但均發(fā)生支架收縮殘留或被降解吸收，其中以115 /24 h組最為顯著。在可發(fā)現(xiàn)殘留膠原支架的標(biāo)本中，以105 /48 h組支架存留率及中心孔隙開放率最為理想，支架內(nèi)部仍明顯保存開放孔隙結(jié)構(gòu)，而且細胞在其內(nèi)部生長活躍。對于其他兩組支架的外周孔隙也基本閉合，支架周邊纖維組織形成明顯。在組

39、織反應(yīng)方面，3組支架外周細胞生長活躍，殘留支架的孔隙內(nèi)有較多細胞生存，支架外周已被新形成的組織替代，內(nèi)有新生血管形成。115 /24 h組中整體細胞組織反應(yīng)較重，瘢痕組織在支架端側(cè)明顯且多伴有新生血管形成，細胞則多以淋巴細胞、未分化細胞為主，仍可見巨噬細胞，新生組織細胞以成纖維細胞為主，新纖維呈束伴有新生毛細血管。在115 /24 h組和105 /24 h組中支架整體形態(tài)多有消失，邊緣及中心開放性孔隙基本消失明顯。消失的支架多被大量的有活性的未分化細胞浸潤，在新生組織外周出現(xiàn)有序的正常組織，成纖維細胞有序排列，再生的新膠原成束出現(xiàn)。偏光鏡觀察有膠原特有的斷節(jié)影像出現(xiàn)，新生膠原組織形成(圖4D)

40、。置入后42 d：3組膠原支架基本完全降解吸收，無殘留，鏡下顯示局部呈現(xiàn)均勻的結(jié)締組織，局部組織無明顯過度增生現(xiàn)象，均可發(fā)現(xiàn)新生膠原組織，毛細血管增生，在其周圍的新生膠原纖維肥大、成束。105 /48 h組和115 /24 h組組織中仍可見一定數(shù)量的淋巴細胞。顯微鏡偏光檢查可以佐證新生組織是具有結(jié)構(gòu)的膠原組織，再生的新膠原組織呈束狀，見圖8。3 討論 Discussion未經(jīng)任何交聯(lián)加強的型膠原支架，在體內(nèi)因固有膠原酶的作用在很短的時間內(nèi)被降解吸收。降解時間與支架本身的濃度及質(zhì)量有關(guān)。在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，使用任何可降解吸收的材料，除應(yīng)具有良好的生物相容性外，還必須考慮材料在體內(nèi)的存留時

41、間及對細胞的親和效果，以保證作為細胞外間質(zhì)支架作用的材料，可以有充分時間允許受損部位的健康細胞及未分化細胞利用支架進行組織修復(fù)與再生1,12。同時還應(yīng)該考慮如何降低材料本身對機體的反應(yīng)、減少產(chǎn)生異物及免疫反應(yīng)的誘因。對膠原材料進行交聯(lián)加強可增加材料抗自身膠原酶降解能力，提高其在機體受損部位存留時間，同時降低其對機體產(chǎn)生的生物學(xué)反應(yīng)。采用高溫脫水交聯(lián)方法對型膠原分子間進行脫水，可以促使膠原肽鏈間形成較為穩(wěn)定的結(jié)合，促成分子間的交聯(lián)8, 13。實驗證明高溫脫水交聯(lián)功效可靠，但和其他如甲醛、戊二醛等化學(xué)交聯(lián)劑相比，處理后的膠原支架抗膠原性能還相差較多。由于高溫脫水交聯(lián)加強采用的是物理方法，所以沒有化

42、學(xué)交聯(lián)劑的副作用，如細胞毒性反應(yīng)，因此它對引發(fā)機體組織學(xué)的反應(yīng)也是最低的，故這種交聯(lián)方法是最安全的，但高溫脫水常規(guī)交聯(lián)條件(105 /24 h)的效果相對較低，而影響交聯(lián)效果的因素只有交聯(lián)溫度與時間，因此延長交聯(lián)時間或提高溫度是改變交聯(lián)效果的兩個手段。實驗表明在一定溫度臨界和限定的時間，膠原肽鏈分子間的氫離子轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定趨勢，不會因持續(xù)提升溫度和延長交聯(lián)時間而增加材料的抗降解性能。采用美國麻省理工學(xué)院Yannas教授的高溫脫水交聯(lián)加強條件是在105 ，真空條件下持續(xù)24 h進行真空脫水交聯(lián)加強。在臨床實踐中，使用型膠原人工硬腦膜材料時發(fā)現(xiàn)，常規(guī)處理的膠原硬腦膜支架在體內(nèi)經(jīng)1個月左右的時間基本降解

43、吸收，有時不能真正達到同步修復(fù)硬腦膜缺損，造成腦脊液滲漏1。為此作者設(shè)計了延長交聯(lián)時間的方法，借以改善膠原材料支架在體內(nèi)的存留時間及支架內(nèi)部孔隙開放，使得膠原支架得以在臨床上取得更好的效果。本實驗顯示置入后14 d，105 /48 h組皮下殘留的膠原支架及其內(nèi)部仍保存開放孔隙結(jié)構(gòu)最佳。支架殘留于皮下組織中的比例為：105 /24 h組為43%，105 /48 h組最高，為82%；115 /24 h最低，為14%。在統(tǒng)計學(xué)方面延時交聯(lián)(105 /48 h)組和升溫交聯(lián)(115 /24 h)組之間在膠原支架殘留量上有明顯差距(P < 0.05)，表明105 /48 h組支架的抗膠原酶降解能力

44、較強(圖9A)。同時在研究中發(fā)現(xiàn)，材料形態(tài)與孔隙保持開放程度有較為明顯的差異，115 /24 h組和105 /24 h組中膠原支架整體形態(tài)消失，邊緣及中心開放性孔隙基本消失，而且有不同程度的收縮，其中115 /24 h最為嚴重；105 /48 h組顯示支架孔隙保持開放，尤其是支架中心部位孔隙保持開放尤為明顯，同時伴有細胞生存。3組膠原支架中心保持開放性孔隙的比例分別為14%、73%和0，表明105 /48 h組抗降解及抗-平滑肌收縮蛋白的收縮能力較其他各組為強(P < 0.05，圖9B)。在組織反應(yīng)方面，3組中殘留膠原周圍均發(fā)現(xiàn)包繞支架的新生組織或類瘢痕組織形成。105 /24 h組顯示

45、機體對材料的組織學(xué)反應(yīng)較弱，在膠原支架外周正常細胞生長活躍；在105 /48 h組和115 /24 h組中發(fā)現(xiàn)細胞組織反應(yīng)較常規(guī)組為重，尤其升溫組顯示尤為突出。類瘢痕組織在膠原支架端側(cè)明顯且多伴有新生血管形成。細胞形態(tài)多以淋巴細胞、未分化細胞為主，也發(fā)現(xiàn)少量的巨噬細胞。細胞反應(yīng)也在這個時期最為突出，其后42 d時細胞數(shù)量及種類趨于正常。膠原支架內(nèi)多被大量有活性的未分化細胞浸潤，新生組織外周出現(xiàn)有序的正常組織，成纖維細胞有序排列，再生的新膠原成束顯現(xiàn)，顯微鏡偏光鏡觀察有膠原特有的反光影像出現(xiàn)。結(jié)論：以型膠原為基質(zhì)的生物材料支架在組織工程學(xué)與再生醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用廣泛。型膠原支架具有良好的生物相容性，是

46、一種具有良好功效的天然生物材料。由于膠原纖維本身力學(xué)性能較弱，低濃度的支架材料且未經(jīng)交聯(lián)加強時，在機體內(nèi)極易被自體膠原酶降解吸收，在體內(nèi)沒有足夠的時間保持其三維立體結(jié)構(gòu)，不能使之發(fā)揮最大限度的支架作用1。 105 、24 h連續(xù)真空脫水是常規(guī)高溫脫水交聯(lián)加強的條件1-3。決定高溫脫水交聯(lián)加強效果的因素是連續(xù)加溫時間與真空溫度的設(shè)定，作者在這里將加強時間設(shè)定由24 h延長至48 h，交聯(lián)溫度由原來105 提升為115 。通過實驗顯示在上述兩大因素中，采用105 加溫時間的延長對增加型膠原的抗降解能力高于單純提高溫度因素。3組內(nèi)置物在機體內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)特異性免疫和嚴重的異物反應(yīng)，顯示了型膠原材料良好的

47、組織相容性及高溫脫水交聯(lián)加強方法的安全、有效性。通過大白鼠背部皮下組織的生物相容性實驗初步判斷，采用延長交聯(lián)加強時間 (105 /48 h)高溫脫水交聯(lián)加強的型膠原支架較常規(guī)處理膠原支架(105 /24 h)及提高交聯(lián)加強溫度同時保留常規(guī)交聯(lián)時間(115 /24 h)高溫脫水具有更佳的抗膠原酶的降解吸收及抗-平滑肌收縮蛋白的收縮能力。在42 d的長期觀察中，所有的動物皮下組織均可見到再生的正常膠原組織，所有實驗標(biāo)本均沒有發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)及嚴重的異物過敏反應(yīng)。綜上所述，采用105 /48 h交聯(lián)加強處理的膠原支架不引起感染和傷口不愈合現(xiàn)象，在體內(nèi)殘留及保持其孔隙開放較105 /24 h、115 /2

48、4 h兩組為佳。動物標(biāo)本觀察、顯微鏡組織學(xué)分析及統(tǒng)計學(xué)處理都表明，延長高溫脫水時間而保持常規(guī)較低溫度的這種交聯(lián)加強方法，可以使膠原支架具有更好抗膠原酶降解及抗-平滑肌收縮蛋白的能力，并達到更加完善的組織再生及抗粘連效果，是一種更為有效、安全的物理性加強方法。020406080100120未降解膠原支架百分比(%)105 /24 h組105 /48 h組115 /24 h組A020406080100120 開放性孔隙(%)105 /24 h組105 /48 h組115 /24 h組B3 d 14 d 42 d3 d 14 d 42 d圖9 各組膠原支架置入后不同時間點的殘留量及開放性孔隙統(tǒng)計分析

49、圖Figure 9 Statistic analysis chart of residual amount and degree of pore openness of collagen scaffolds at different time points after collagen scaffold implantation圖注：圖中A為未降解膠原支架百分比，B為膠原支架內(nèi)置后孔隙開放率。105 /48 h組抗降解及抗-平滑肌收縮蛋白的收縮能力較其他兩組強(P < 0.05)。致謝：感謝北京銀河巴馬生物技術(shù)股份有限公司、美國Brigham and Womens Hospita骨科研究

50、實驗室提供的支持。作者貢獻：許和平醫(yī)學(xué)博士進行實驗設(shè)計，實驗實施為張聰課題組，資料收集及實驗評估為許和平醫(yī)學(xué)博士，張聰和許和平醫(yī)學(xué)博士成文，許和平醫(yī)學(xué)博士審校。利益沖突：所有作者共同認可文章無相關(guān)利益沖突。倫理問題：實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)要求。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。文章外審：本刊實行雙盲外審制度，文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家審核，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：通訊作者對于研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體

51、作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻 References1 Yannas IV,Burke JF.Design of an artificial skin. I. Basic design principles.J Biomed Mater Res. 1980;14(1):65-81.2 Krane SM. Collagenases and collagen degradation. J Invest Dermatol 1982;79(Suppl 1):83S-86S.3 Wang MC,Pins GD,Silver FH.Collagen fibres with improved strength fo