硝化細(xì)菌的簡(jiǎn)介及研究思路

1、1.1 問(wèn)題的提出1.1.1 我國(guó)水體富營(yíng)養(yǎng)化狀況我國(guó)是一個(gè)湖泊眾多的國(guó)家，大于1 km2的天然湖泊就有2300多個(gè)，湖泊面積為70988 km2，約占全國(guó)陸地總面積的0.8。湖泊總蓄水量為7077多億m31。調(diào)查結(jié)果表明：2004年七大水系的412個(gè)水質(zhì)監(jiān)測(cè)斷面中，IIII類(lèi)、類(lèi)和劣類(lèi)水質(zhì)的斷面比例分別為41.8、30.3和27.9，七大水系主要污染指標(biāo)為氨氮、五日生化需氧量、高錳酸鹽指數(shù)和石油類(lèi)3。2004年監(jiān)測(cè)的27個(gè)重點(diǎn)湖庫(kù)中，II類(lèi)水質(zhì)的湖庫(kù)2個(gè)，III類(lèi)水質(zhì)的湖庫(kù)5個(gè)，類(lèi)水質(zhì)的湖庫(kù)4個(gè)，類(lèi)水質(zhì)湖庫(kù)6個(gè)，劣類(lèi)水質(zhì)湖庫(kù)10個(gè)。其中，“三湖”（分別為太湖、巢湖和滇池）水質(zhì)因總氮和總磷濃度

2、高而均為劣類(lèi)。太湖水質(zhì)與上年比有所改善，但仍處于中度富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)。滇池的草海屬于中度富營(yíng)養(yǎng)化，外海屬重度富營(yíng)養(yǎng)化。巢湖水質(zhì)屬中度富營(yíng)養(yǎng)化。對(duì)于海洋環(huán)境，2004年全海域共發(fā)現(xiàn)赤潮96次，較上年減少23次。赤潮累計(jì)發(fā)生面積266630平方公里，較上年增加83.0，其中，大面積赤潮集中在東海。目前，水體的富營(yíng)養(yǎng)化已經(jīng)成為我國(guó)最為突出的環(huán)境問(wèn)題之一。許多大型湖泊，如巢湖、太湖、鄱陽(yáng)湖、滇池和西湖等，都已經(jīng)處于富營(yíng)養(yǎng)或重度富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)。而且一些河流在部分河段也出現(xiàn)了富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象，如黃浦江流域、珠江廣州河段等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)主要湖泊處于因氮、磷污染而導(dǎo)致富營(yíng)養(yǎng)化的占統(tǒng)計(jì)湖泊的564。因此，如何治理富營(yíng)養(yǎng)化

3、的水體，減少其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，回復(fù)水體的綜合功能，已成為當(dāng)前全球性的環(huán)境問(wèn)題的研究熱點(diǎn)5。1.1.2 富營(yíng)養(yǎng)化水體的微生物治理針對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象，其水質(zhì)改善及對(duì)策包括三個(gè)大的方面：污染源控制對(duì)策、水體生態(tài)修復(fù)對(duì)策以及應(yīng)急除藻對(duì)策6-8。水體富營(yíng)養(yǎng)化的關(guān)鍵與核心是生物多樣性的破壞，其典型表現(xiàn)就是富營(yíng)養(yǎng)化水體發(fā)生藻類(lèi)“水華”現(xiàn)象9。因此，從保護(hù)和恢復(fù)生物多樣性入手，引入微生物、植物和動(dòng)物，尤其是關(guān)鍵物種，重建食物鏈結(jié)構(gòu)，是恢復(fù)水體正常的主要手段之一10-12。為此經(jīng)常用到的技術(shù)措施包括：以藻控藻，投加細(xì)菌微生物13、放養(yǎng)魚(yú)類(lèi)14，恢復(fù)與構(gòu)建水生植被15,16等。利用微生物種群的新陳代謝活動(dòng)對(duì)

4、富營(yíng)養(yǎng)化水體中的有機(jī)污染物、氨氮和有機(jī)氮等進(jìn)行去除，尤其是氮污染物的去除，主要需要建立硝化反硝化體系。而在自然界中，原本存在有專(zhuān)門(mén)從事硝化反硝化過(guò)程中的微生物種群。但是由于某些微生物種群，如硝化細(xì)菌的代時(shí)較長(zhǎng)，增殖速率非常低。同時(shí)，水體的人為活動(dòng)的破壞。導(dǎo)致了富營(yíng)養(yǎng)化水體中硝化反硝化體系的弱化甚至缺失。故針對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化水體，可采用向水體中投加復(fù)合微生物菌群，從而增強(qiáng)水體的生物自凈化能力，達(dá)到控制水體富營(yíng)養(yǎng)化的目的，該技術(shù)被稱(chēng)之為“微生物強(qiáng)化技術(shù)”。該技術(shù)具有費(fèi)用低、見(jiàn)效快、無(wú)污染和方便安全等特點(diǎn)。復(fù)合微生物種群主要由光合細(xì)菌、硝化細(xì)菌等組成，再輔之以反硝化細(xì)菌。其中，光合細(xì)菌通過(guò)自身代謝與藻類(lèi)競(jìng)

5、爭(zhēng)性爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并可降解、消除藻類(lèi)代謝分泌于體外的多種物質(zhì)，削弱藻類(lèi)的競(jìng)爭(zhēng)力。一般的光合細(xì)菌都有固氮能力，在厭氧光照條件下固氮能力最強(qiáng)。光合細(xì)菌與其他細(xì)菌的混合培養(yǎng)，能夠提高其他細(xì)菌的固氮能力。另外，硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌可針對(duì)水體中的有機(jī)氮和氨氮等進(jìn)行降解處理。硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)條件是偏堿性的好氧環(huán)境。光合細(xì)菌在代謝過(guò)程中可產(chǎn)生堿性物質(zhì)，從而為硝化細(xì)菌提供了堿性環(huán)境。潘涌璋17等應(yīng)用復(fù)合微生物培養(yǎng)液和BBL1菌劑，采用投加菌液的方法對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化人工景觀湖水進(jìn)行了凈化試驗(yàn)，氨氮的去除率大于90。楊世平18等人利用固定化硝化細(xì)菌處理養(yǎng)殖廢水，24小時(shí)后COD去除率為74.9，氨氮去除率82.5。周康群

6、19等利用投加氨氧化菌、亞硝酸鹽氧化菌、芽孢菌和假單胞菌等于廣州市西村水廠的水源中，可降解氨氮4094.5。黃曉東20等人利用角野以聚丙烯酰胺凝膠為固定化載體，用包埋法固定硝化細(xì)菌，并以7.5的填充率將固定化細(xì)胞透入到內(nèi)循環(huán)的流化床中，對(duì)按標(biāo)準(zhǔn)活性污泥法運(yùn)行、含硝化細(xì)菌極少的曝氣池活性污泥混合液進(jìn)行連續(xù)處理實(shí)驗(yàn)，停留時(shí)間僅為2小時(shí)，就可達(dá)到完全硝化。據(jù)Wagner M21等報(bào)道：某化工廠在采用兩步生物增強(qiáng)技術(shù)，投加降解硝基苯和對(duì)硝基苯的菌以及氨氧化菌后，可將出水中的NH4+-N從120 mg/L降到20 mg/L。1.2 硝化細(xì)菌的分類(lèi)及研究現(xiàn)狀生物硝化作用（NH3NO2-NO3-）在地球氮素

7、循環(huán)過(guò)程中扮演著極其重要的角色。生物硝化作用主要通過(guò)硝化細(xì)菌中兩個(gè)“關(guān)鍵”共生菌群對(duì)氮素的遷移和轉(zhuǎn)化作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，這兩個(gè)共生菌群分別是將氨氮氧化成亞硝酸鹽的氨氧化菌（ammonia-oxidizing bacteria ，AOB）和將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽的亞硝酸鹽氧化菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）22。 硝化細(xì)菌的分類(lèi)根據(jù)伯杰氏鑒定手冊(cè)第8版分類(lèi)，硝化細(xì)菌統(tǒng)歸于7個(gè)屬，分別是硝化桿菌屬（Nitrobacter）、硝化刺菌屬（Nitrospina）、硝化球菌屬（Nitrococcus）、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、亞硝化螺菌屬（Nitrososp

8、ira）、亞硝化球菌屬（Nitrosococcus）和亞硝化葉菌屬（Nitrosolobus），共14種。伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)第9版中除了收錄上述7個(gè)屬外，另增加有2個(gè)屬，分別是硝化螺菌屬（Nitrospira）和亞硝化弧菌屬（Nitrosovibrio），總共20種。這些菌種的分布很廣，分布于土壤、湖泊及底泥和海洋等環(huán)境中23?；?6S rRNA基因序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，所有的自養(yǎng)型氨氧化菌系統(tǒng)發(fā)育較為單一，他們皆屬于變形菌綱（Proteobacteria）亞綱和亞綱（圖1所示）24，其中屬于亞綱的氨氧化菌又可以分為兩個(gè)類(lèi)群：亞硝化單胞菌群（Nitrosomonas）和亞硝化螺菌群（

9、Nirosospira）。其中，亞硝化單胞菌群包括歐洲亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas europaea）和運(yùn)動(dòng)亞硝化球菌（Nitroscoccus mobilis）；亞硝化螺菌屬包括所有的屬于亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、亞硝化弧菌屬（Nitrosovibrio）和亞硝化葉菌屬（Nitrosolobus）的菌株，從進(jìn)化距離上看，這3個(gè)屬可完全歸于1個(gè)屬。圖1-1 依據(jù)16SrRNA基因序列構(gòu)建的硝化作用微生物的系統(tǒng)發(fā)育25Fig. 1-1 Systematic evolution of nitrifying bacteria based on the sequences

10、of their 16S rRNAThe sequences of 16SrDNA were from GenBank, and accession numbers from up to down were L35503, L35504, Y14636, Y14644, L35511, L35507, M96400, M96399, M96396, M96397, M96401, M96404, L35510, and M96395與氨氧化菌不同，亞硝酸鹽氧化菌的系統(tǒng)發(fā)育則要復(fù)雜許多，Bock E等26人的研究結(jié)果表明，亞硝酸鹽氧化菌的4個(gè)屬分屬于不同的4個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)型（圖1）。如，硝化桿菌屬

11、（Nitrobacter）屬于變形菌綱的亞綱，硝化球菌屬（Nitrococcus）屬于亞綱，硝化刺菌屬（Nitrospina）屬于亞綱、硝化螺菌屬（Nitrospira）屬于硝化螺菌門(mén)（phylum Nitrosira）。以上這些內(nèi)容充分說(shuō)明了生物硝化作用中的微生物在進(jìn)化上系統(tǒng)發(fā)育起源的異源性。Lipski A等27人研究了亞硝酸鹽氧化菌的脂肪酸圖譜，結(jié)果表明，亞硝酸鹽氧化菌中各屬所含的脂肪酸存在較大差異，并有各自的特征脂肪酸，所得結(jié)果與16S rRNA基因序列相似性分析的結(jié)果相吻合26。 硝化細(xì)菌的特征1硝化細(xì)菌的自養(yǎng)性硝化細(xì)菌絕大部分種類(lèi)皆為專(zhuān)性化能的自養(yǎng)菌，它們能夠利用氨氮或者亞硝酸鹽獲

12、得合成反應(yīng)所需的化學(xué)能。在有機(jī)培養(yǎng)基上幾乎不生長(zhǎng)（維氏硝化桿菌除外），也不需要外源的生長(zhǎng)因素。它們對(duì)底物的專(zhuān)一性很強(qiáng)，氨氧化菌以氨氮為底物提供能量，亞硝酸鹽氧化菌以亞硝酸鹽為底物提供能量。2生長(zhǎng)緩慢，二均分裂28硝化細(xì)菌是化能自養(yǎng)型菌，其由自身合成糖類(lèi)，這一過(guò)程需要較長(zhǎng)的時(shí)間。因此，硝化細(xì)菌的平均代時(shí)一般都在10h以上。大多數(shù)種類(lèi)為無(wú)性的二均分裂，只有維氏硝化桿菌為出芽繁殖。3好氧性硝化細(xì)菌皆為好氧生長(zhǎng)，O2是最終的電子受體。硝化細(xì)菌正常代謝需要溶解氧，溶解氧供給不足可破壞氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌之間的生態(tài)平衡。4形態(tài)多樣性硝化細(xì)菌均為革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜。雖然生理學(xué)上具有共同性，但是

13、，同一生理亞群中的種類(lèi)，其細(xì)胞形態(tài)卻多種多樣，例如，球形、桿形、螺旋形等。其細(xì)胞膜大多具有復(fù)雜的薄膜狀、囊泡狀和管狀膜內(nèi)褶結(jié)構(gòu)。DNA中GC分子百分含量范圍較窄，氨氧化菌的含量略高于亞硝酸鹽氧化菌。5分布硝化細(xì)菌對(duì)溶解氧、溫度、pH等外界環(huán)境因素的變化反應(yīng)較為靈敏，易受外界環(huán)境的影響。有些屬分布較廣，有些則較局限，如硝化球菌和硝化刺菌屬的種僅分布在海水中。 硝化細(xì)菌的檢測(cè)方法早期對(duì)于硝化細(xì)菌的檢測(cè)是通過(guò)菌體分離、培養(yǎng)，然后形態(tài)觀察來(lái)進(jìn)行的。但是，由于硝化細(xì)菌為化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型微生物，其生長(zhǎng)速率十分緩慢，分離和培養(yǎng)硝化細(xì)菌的周期特別長(zhǎng)，以硝化桿菌為例，在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中，其最短的代時(shí)也在7h以上。而在

14、自然環(huán)境中，絕大部分的硝化細(xì)菌由于底物、溶解氧、溫度和pH的限制，其代時(shí)更會(huì)長(zhǎng)達(dá)幾天或者數(shù)周。同時(shí)，硝化細(xì)菌個(gè)體小，形態(tài)觀察十分困難。硝化細(xì)菌這種緩慢的生長(zhǎng)速率嚴(yán)重的阻礙了對(duì)硝化細(xì)菌數(shù)量的檢測(cè)，同樣也使得對(duì)硝化細(xì)菌的菌群構(gòu)成和硝化動(dòng)力學(xué)等方面的研究陷入困境29-31。在一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境系統(tǒng)中，常規(guī)的硝化細(xì)菌檢測(cè)方法為MPN法32-35。此方法是建立在統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)之上。然而，實(shí)施MPN法不僅耗時(shí)，而且容易對(duì)硝化細(xì)菌的數(shù)量造成低估，更不能對(duì)不同種的硝化細(xì)菌進(jìn)行有效區(qū)分36,37。根據(jù)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的不同，MPN法僅僅只能對(duì)硝化細(xì)菌菌群中的一小部分進(jìn)行計(jì)數(shù)?？梢钥闯?，MPN法已經(jīng)不能適應(yīng)硝化細(xì)菌的研究

15、。近20年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是PCR技術(shù)、DNA測(cè)序技術(shù)以及核酸雜交和多態(tài)性技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使人們從分子水平研究硝化細(xì)菌成為可能。通過(guò)抗體或16S rRNA的寡聚核苷酸探針，復(fù)雜環(huán)境中的硝化細(xì)菌可以被檢測(cè)出來(lái)。熒光抗體技術(shù)可以被直接應(yīng)用于復(fù)雜環(huán)境系統(tǒng)中硝化細(xì)菌的檢測(cè)38-41。Voytek等（1995）利用嵌套引物兩步PCR擴(kuò)增16S rRNA基因及熒光探針雜交法檢測(cè)了分離菌種和環(huán)境樣品中Proteobacteria亞綱的氨氧化菌42；Deni等（1995）利用16S rDNA引物特異性擴(kuò)增了397bpDNA片段，對(duì)土壤中的硝化桿菌（Nitrobacter）進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)數(shù)4

16、3。明鎮(zhèn)寰等利用PCR對(duì)煉化廠生物硝化池曝氣池中的硝化細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間（整個(gè)過(guò)程大約需要6小時(shí)），而且勞動(dòng)量小，靈敏度高44。但是，對(duì)于識(shí)別細(xì)胞壁上特異抗原的抗體，其首先需要分離純化得到靶細(xì)胞。盡管如此，這種抗體也僅僅只能識(shí)別極少部分的硝化細(xì)菌類(lèi)別。而最近，以關(guān)鍵酶，如氨氧化還原酶和亞硝酸鹽氧化還原酶為目標(biāo)的抗體已被開(kāi)發(fā)成功45, 46。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是，其克服了抗體只能識(shí)別細(xì)胞壁上位點(diǎn)的問(wèn)題。這種抗體技術(shù)已經(jīng)成功的應(yīng)用于環(huán)境樣品中硝化細(xì)菌的檢測(cè)和關(guān)鍵酶的生理生化研究上47, 48。另外，環(huán)境樣品中的硝化細(xì)菌可以通過(guò)不同的PCR技術(shù)得以檢測(cè)，通常使用16S rRNA49-50和關(guān)

17、鍵酶51,52序列作為對(duì)象。其中，利用此原理的最為參見(jiàn)的方法就是熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)53 - 55。除了上述方法外，Lipski56等人研究發(fā)現(xiàn)，硝化細(xì)菌體內(nèi)的脂肪酸具有系統(tǒng)發(fā)育的多樣性，因此，可以作為硝化細(xì)菌不同種群的檢測(cè)手段。 硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝硝化細(xì)菌作為一種化能自養(yǎng)型微生物，其可以利用無(wú)機(jī)氮源促進(jìn)生長(zhǎng)。同時(shí)，又可通過(guò)卡爾文循環(huán)固定CO2，為生長(zhǎng)提供碳源。但是，硝化細(xì)菌區(qū)別于純粹的化能自養(yǎng)型微生物，在生長(zhǎng)過(guò)程中添加有機(jī)物質(zhì)可刺激細(xì)胞的生長(zhǎng)和增值57, 58。此外，硝化桿菌也可以利用丙酮酸、蟻酸鹽和醋酸鹽等作為碳

18、源進(jìn)行異養(yǎng)型代謝提供能量59。然而，整體上說(shuō)，硝化細(xì)菌的這種異養(yǎng)型生長(zhǎng)終歸是慢于自養(yǎng)型生長(zhǎng)60, 61。另外，亞硝化單胞菌屬和硝化桿菌屬在低溶氧和缺氧環(huán)境下都可進(jìn)行反硝化反應(yīng)，從而產(chǎn)生氧化一氮、氧化二氮或四氧化二氮等562- 64。而且研究表明，亞硝化單胞菌屬還可利用二氧化氮或四氧化二氮作為氧的電子供體，而不需要O265, 66。以下為氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌兩類(lèi)主要硝化細(xì)菌種群的基本生化代謝情況。1.2.4.1 氨氧化菌的生長(zhǎng)代謝氨氧化菌通過(guò)氧化氨氮為生長(zhǎng)提供能量，此過(guò)程需要兩個(gè)關(guān)鍵酶進(jìn)行催化作用，分別是氨單加氧酶（ammonia monooxygenase，AMO）和羥氨氧化還原酶（hyd

19、roxylamine oxidoreductase，HAO）。過(guò)程分為兩步進(jìn)行。第一步，AMO氧化NH3為羥胺。此過(guò)程又分為兩個(gè)部分：O2經(jīng)放能還原反應(yīng)生成水；而后，其生成的能量促使NH3和氧氣作用生成中間產(chǎn)物羥胺67。第二步由羥氨氧化還原酶參與，氧化羥胺生成亞硝酸鹽。此過(guò)程亦分為幾個(gè)部分組成，具體如下：整個(gè)氧化過(guò)程，可以通過(guò)圖2反應(yīng)出來(lái)。圖 1-2 歐式亞硝化單胞菌屬的電子傳遞鏈模型AMO=氨單加氧酶；C=細(xì)胞質(zhì)；Cyt=細(xì)胞色素；HAO=羥胺氧化酶；NIR=亞硝酸鹽還原酶；P=細(xì)胞周質(zhì)；UQ=輔酶QFig. 1-2 Model of electron transport chain of

20、NitrosomonasAMO = ammonia monooxygenase; C = cytoplasimc side og the membrane; Cyt = cytochrome; HAO = hydroxylamine oxidoreductase; NIR = nitrite reductase; P = periplasimic side of the membrane; UQ = ubiquinone.2 亞硝酸鹽氧化菌生長(zhǎng)的生化機(jī)制由亞硝酸氧化為硝酸鹽只需一步完成，該反應(yīng)由亞硝酸氧化酶系統(tǒng)來(lái)參與進(jìn)行，電子經(jīng)細(xì)胞色素傳遞給O2，再通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，過(guò)程如圖3所示。圖

21、1-3 硝化桿菌屬的電子傳遞鏈模型C=細(xì)胞質(zhì)；Cyt=細(xì)胞色素；NOR=亞硝酸鹽氧化還原酶；P=細(xì)胞周質(zhì)；TCC=三羧酸循環(huán)；UQ=輔酶QFig. 1-3 Model of electron-transport chain of NitrobacterC = cytoplasmic side of the membrane; Cyt = cytochrome; NOR = nitrite oxidoreductase; P = periplasmic side of the membrane; TCC = tricarboxylic acid cycle; UQ = ubiquinone po

22、ol.在亞硝酸鹽氧化菌中用亞硝酸氧化酶將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽；電子通過(guò)一個(gè)極短的電子傳遞鏈（因?yàn)镹03-/N02-具有高電勢(shì)）傳給終端氧化酶。細(xì)胞色素a和c參與亞硝酸氧化劑的電子傳遞，并通過(guò)細(xì)胞色素aa3的反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)質(zhì)子動(dòng)力，最終促進(jìn)ATP的形成。因?yàn)橹挥泻苌俚囊徊糠帜芰磕鼙幌跛峒?xì)菌利用，所以硝酸細(xì)菌的生長(zhǎng)率更低。.3 硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)速度硝化細(xì)菌與異養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)方式和消耗底物的類(lèi)型是完全不同的。細(xì)菌的反應(yīng)動(dòng)力常數(shù)與其底物的有效性有關(guān)。在處于最大活性時(shí)，它們都能消耗自身總量幾倍的底物。但硝化細(xì)菌只將少量的底物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞成分，大部分ATP用于合成NADPH，而異養(yǎng)細(xì)菌則將大量的底物轉(zhuǎn)化為新細(xì)胞6

23、8。因此，硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)速率相對(duì)而言緩慢得多。如Nitrosomonas在1020，pH 6.57.5的生長(zhǎng)率為0.10d-10.61d-1，Nitrobacte為0.10 d-10.45d-1 69，比那些異養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)速率要慢許多。另一個(gè)重要的特性是，硝化細(xì)菌在較低底物濃度的環(huán)境中即可維持最大的反應(yīng)活性，所需的底物濃度是異養(yǎng)細(xì)菌的1%70。表1-2 氨氧化菌、亞硝酸鹽氧化菌和異養(yǎng)細(xì)菌的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Table 1-2 The kenetic parameters of AOB, NOB and heterotrophic bacteria細(xì)菌類(lèi)群底物消耗速率（mg/mg·d）比生長(zhǎng)速

24、率（/d）增長(zhǎng)效率（mg /mg底物）飽和常數(shù)（mg/L）氨氧化菌6200.52.00.050.291亞硝酸鹽氧化菌10400.21.00.020.081異養(yǎng)型細(xì)菌203010150.40.575125 環(huán)境因子對(duì)硝化細(xì)菌的影響 硝化細(xì)菌作為自然界氮素循環(huán)的重要組成部分，其具有不可或缺的作用。但是，由于硝化細(xì)菌本身為化能自養(yǎng)型細(xì)菌，且其代時(shí)較長(zhǎng)等特殊性，決定了硝化細(xì)菌對(duì)環(huán)境因子即為敏感。其中，主要的影響因子如下： 1溫度溫度對(duì)硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)和氧化速率的影響很大。根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)中所記錄，硝化細(xì)菌的最適溫度為1035范圍了，高于或低于此溫度范圍，硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)和氧化速率都會(huì)受到極大的影響。

25、如溫度低于10，硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)速率減慢，同時(shí)其亞硝酸鹽氧化速率和氧化活性衰減速率也同時(shí)降低71。而溫度高于35時(shí)，高溫直接對(duì)硝化細(xì)菌的酶系產(chǎn)生不可逆的破壞。在1035范圍內(nèi)所以，溫度每升高10，硝化速率可提高3倍72。因此，在進(jìn)行硝化細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)盡量將溫度控制在2030范圍。2pHpH對(duì)微生物的主要作用在于，其可引起細(xì)胞膜電荷的變化，從而影響了微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；影響代謝過(guò)程中酶的活性；改變生長(zhǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可給性；以及有害物質(zhì)的毒性。因此，pH也是影響硝化細(xì)菌的重要因子之一。一般來(lái)說(shuō)，氨氧化菌的最適pH值為7.07.8，而亞硝酸鹽氧化菌的pH在7.78.1。此時(shí)，兩者的活性最高73。

26、但是有文獻(xiàn)報(bào)道，氨氧化菌的最適pH范圍是7.08.5，亞硝酸鹽氧化菌的最適pH范圍是6.07.574。Shammas75和Groenewegh76等人認(rèn)為，硝化反應(yīng)的適宜pH在7.59.0之間，最佳pH在8.08.5。當(dāng)pH6.5或者pH9.8時(shí)，硝化速率降低50以上。當(dāng)pH5.5時(shí)，硝化反應(yīng)則完全停止。綜合來(lái)講，硝化細(xì)菌的最適生長(zhǎng)pH為弱堿性環(huán)境，不同的環(huán)境系統(tǒng)中，硝化細(xì)菌的最適生長(zhǎng)和硝化pH范圍會(huì)有所不同。 此外，pH值和溫度一同作用，決定了氨在總氨氮中的比例，氨對(duì)于硝化細(xì)菌是具有微量的毒性作用。當(dāng)氨的濃度達(dá)8mg/L時(shí)，就能對(duì)硝化細(xì)菌產(chǎn)生抑制77。亞硝酸鹽氧化菌的硝化活性對(duì)環(huán)境中的pH變

27、化較為敏感，往往pH發(fā)生變動(dòng)，短時(shí)間內(nèi)，硝化細(xì)菌的活性便會(huì)發(fā)生顯著性的變化72。3COD硝化細(xì)菌屬于化能自養(yǎng)型微生物。因此，早期人們普遍認(rèn)為，有機(jī)物對(duì)硝化細(xì)菌具有一定的毒害作用。但是，眾多的研究和實(shí)踐證明，有機(jī)物（非有毒有機(jī)物）對(duì)硝化作用并無(wú)特定的毒害作用78。產(chǎn)生毒害現(xiàn)象的原因可能是，有機(jī)物的存在促進(jìn)了異養(yǎng)細(xì)菌的快速生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致其與硝化細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)氧和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而使得硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)受到限制，但有機(jī)物本身并不直接影響硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)與硝化作用79。Hanaki也認(rèn)為有機(jī)物導(dǎo)致硝化作用的降低不是直接毒害作用的結(jié)果，其分析原因可能有兩點(diǎn)：一是異養(yǎng)菌的同化作用導(dǎo)致氨的減少；二是異養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞的凝聚體會(huì)

28、對(duì)氨的氧化作用產(chǎn)生抑制作用。二者共同作用導(dǎo)致了硝化作用的降低。3滲透壓硝化細(xì)菌對(duì)滲透壓的能力較強(qiáng)，這主要由硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)環(huán)境所決定。一般來(lái)說(shuō)，從淡水到海水，硝化細(xì)菌都有相關(guān)的種屬生活其中。即使環(huán)境條件土壤發(fā)生變化，例如，從淡水突然轉(zhuǎn)到海水中，多數(shù)的硝化細(xì)菌可以快速適應(yīng)環(huán)境，且活性的變化不大80。從某種意義上可以說(shuō)，滲透壓對(duì)硝化細(xì)菌沒(méi)有影響，因此，在眾多的文獻(xiàn)報(bào)道中均不將滲透壓作為硝化細(xì)菌的主要研究?jī)?nèi)容。4溶解氧硝化細(xì)菌皆為好氧菌，因此，在生長(zhǎng)過(guò)程中需要氧來(lái)提供電子供體，從而獲得能量。一般來(lái)說(shuō)，每毫克氮素經(jīng)過(guò)硝化作用途徑后，由氨轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛岣?，最大需?.57毫克溶解氧來(lái)“清除”含氮物質(zhì)釋放的電子

29、81。研究認(rèn)為，硝化過(guò)程中溶解氧的濃度一般控制在1.0 mg/L2.0 mg/L比較好，過(guò)高和過(guò)低的溶解氧含量都會(huì)不利于硝化細(xì)菌的硝化能力。溶解氧過(guò)低會(huì)對(duì)硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)和硝化細(xì)菌的活性產(chǎn)生抑制，溶解氧過(guò)高則會(huì)對(duì)污泥深處中反硝化細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，不能把由硝化細(xì)菌產(chǎn)生的硝酸鹽最終從污水中去除，從而硝酸鹽反過(guò)來(lái)也抑制了硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)和活性。Eckenfelde提出DO濃度必須在2mg/L以上；也有人提出DO不能低于0.5mg/L；還有人提出氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌有所差異，DO濃度分別為1.0mg/L與2.0mg/L。而Michael K. Stenstrom與RichardA.Poduska在總結(jié)

30、大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)各種因素及雙底物限制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析，認(rèn)為這些濃度之所以各不相同，主要是由于雙底物限制動(dòng)力學(xué)的原因，并得出結(jié)論：在較高的平均細(xì)胞停留時(shí)間（MCRT）的條件下，DO濃度為0.51.0mg/L就可完成硝化作用，MCRT較低時(shí)，完全硝化則需要相對(duì)高的DO濃度；而能夠發(fā)生硝化作用的最低DO濃度約為0.3mg/L82。Kanaki,K.等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低的DO不會(huì)對(duì)氨的氧化產(chǎn)生影響，因?yàn)樵诘偷腄O（0.5mg/L）條件下，氨氧化菌的生長(zhǎng)量會(huì)增加，恰好補(bǔ)償了DO太低引起的氨氧化速率的降低。而低的DO會(huì)大大地抑制亞硝酸鹽的氧化作用，因?yàn)閬喯跛猁}氧化菌的生長(zhǎng)量未增加，不能補(bǔ)償由DO過(guò)低引

31、起的亞硝酸鹽氧化速率的降低，并且低的DO會(huì)加劇有機(jī)負(fù)荷對(duì)硝化作用的影響83。王建龍等也發(fā)現(xiàn)低的DO < 0.8mg/L 會(huì)對(duì)亞硝酸鹽氧化菌的生長(zhǎng)酶系產(chǎn)生抑制作用，而對(duì)氨氧化菌的生長(zhǎng)酶系則會(huì)起到促進(jìn)的作用。有趣的是，好氧硝化細(xì)菌也有反硝化的能力。在大量的純培養(yǎng)研究中，部分氨顯示出被轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的氮化合物。顯然，這些氣態(tài)化合物是由硝化細(xì)菌的反硝化反應(yīng)所產(chǎn)生。這些反硝化反應(yīng)的主要副產(chǎn)物是N284，NO85, 86或N2O87。在低的溶解氧濃度和亞硝酸鹽存在的條件下，超過(guò)60的氮被轉(zhuǎn)化為這些化合物88。在厭氧條件下，Nitrosomonas eutropha能夠利用氫和亞硝酸鹽89以及氨和NO2生

32、長(zhǎng)90。在這種情況下的終產(chǎn)物都是氮?dú)狻?光照 亞硝酸鹽氧化菌對(duì)近紫外波段很敏感，其原因可能與細(xì)胞膜上的氧產(chǎn)生超氧化物游離基有關(guān)。但對(duì)于這一波段的光對(duì)亞硝酸鹽氧化菌產(chǎn)生負(fù)面影響的確切原因尚未發(fā)掘。對(duì)于那些受光照影響的亞硝酸鹽氧化菌，應(yīng)及時(shí)的將其轉(zhuǎn)移到暗區(qū)，并提供足量的供能物質(zhì)，大約需要幾個(gè)小時(shí)它們才能修復(fù)。5抑制劑很多化學(xué)物質(zhì)能對(duì)硝化細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，如：ATU（烯丙基硫脈）、乙炔、重金屬、金屬鰲合劑（尤其是與銅鰲合的）、二硫化碳、游離氨、2-氯_6一三氯甲基吡啶（Nitrapyrin）等。表1-3列出了一些經(jīng)常被使用的硝化細(xì)菌抑制劑。表1-3 一些常用的硝化作用抑制劑91Table 1-3 s

33、ome comonely used inhibitors of nitrification抑制劑抑制對(duì)象丙烯基硫脲（ATU）亞硝酸鹽氧化菌氯酸鈉氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌2-氯-6-三氯甲基吡啶亞硝酸鹽氧化菌疊氮化鈉亞硝酸鹽氧化菌乙炔亞硝酸鹽氧化菌游離氨氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌亞硝酸氨氧化菌6共代謝正如前文提及的，催化亞硝酸細(xì)菌反應(yīng)的是氨單加氧酶（ammoniamonooxygenase，AMO），它與甲基營(yíng)養(yǎng)菌的甲烷單加氧酶（methanemonooxygenase，MMO）極其相似92, 93。甲烷單加氧酶能催化氧化已分解的碳?xì)浠衔?，包括鹵代烴類(lèi)。最近一些研究成果表明氨單加氧酶（AMO）也

34、具有類(lèi)似的功能，它能通過(guò)共代謝的途徑來(lái)氧化其他非氨底物92。有人估計(jì)，亞硝酸細(xì)菌能以共代謝的途徑降解其每日耗氮量十分之一的碳?xì)浠衔铩?硝化細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用硝化細(xì)菌為自然界氮循環(huán)中氧化亞硝酸鹽為硝酸鹽的一類(lèi)重要微生物1。 由于養(yǎng)殖水體的定期消毒，水體微生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中亞硝酸鹽大面積過(guò)度積累事件頻繁爆發(fā)，直接或間接造成我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失, 并日益成為限制我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖進(jìn)一步發(fā)展的重要因素之一。 然而，長(zhǎng)期對(duì)水體亞硝酸鹽積累現(xiàn)狀的忽視，使得我國(guó)市面上硝化細(xì)菌產(chǎn)品極其匱乏（多為其他種類(lèi)低效混合微生物的替代產(chǎn)品，如光合細(xì)菌、芽孢桿菌等），同時(shí)針對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化水體亞硝酸鹽降

35、解研究的缺失。因此，硝化細(xì)菌菌劑的研究與開(kāi)發(fā)顯得尤為重要。有關(guān)硝化細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的報(bào)道不多，分析原因主要是硝化細(xì)菌菌劑本身價(jià)格昂貴，而且由于保質(zhì)期較短大大限制了其使用范圍。養(yǎng)殖水體中的氨氮與亞硝酸鹽對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象的毒害是非常嚴(yán)重的，其中，尤其是對(duì)蝦養(yǎng)殖，近年來(lái)，由于氨氮或亞硝酸鹽積累產(chǎn)生毒害造成大面積病害蝦和死蝦的現(xiàn)象日益頻繁。在一個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，氨氮和亞硝酸鹽的除去通常有硝化細(xì)菌來(lái)完成。但是在一個(gè)新建的水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中，氨氮或亞硝酸鹽往往在足夠的硝化細(xì)菌生成前就以積累到對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象產(chǎn)生毒害。因此，為了縮短硝化細(xì)菌生成足夠量所需的時(shí)間，人為添加硝化細(xì)菌以降低氨氮和亞硝酸鹽所產(chǎn)生的毒害。Gro

36、mmen等向養(yǎng)魚(yú)池廢水投加由高活性亞硝酸鹽氧化菌及富集液組成的復(fù)合菌液，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)復(fù)合菌液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg·VSS/L時(shí)可確保4 d之內(nèi)對(duì)NH3 - N和NO2 - N的去除率由10 mg/L到低于可檢測(cè)范圍。當(dāng)DO大于6 mg/L時(shí)沒(méi)有檢測(cè)出NO2- ，因此，投加該復(fù)合菌液表現(xiàn)出可靠性和可再生性。邢華等人采用純硝化細(xì)菌直接潑灑，使得池塘中的菌體濃度達(dá)到1ppm后，在未換水的情況下，經(jīng)過(guò)19天時(shí)間，亞硝態(tài)氮下降了98.6，且對(duì)蝦生長(zhǎng)狀況良好。馬悅欣等94研究了牙鮮自凈式養(yǎng)殖槽水層和過(guò)濾層氨氧化菌含量分別為3.0×102 m/L和2.0×104 m/L，亞

37、硝酸鹽氧化菌含量是2.0×102 m/L和3.0×103 m/L。無(wú)循環(huán)過(guò)濾槽中氨氧化菌和硝化細(xì)菌含量為3.5×103 m/L和3.5×103 m/L。王國(guó)祥等95研究認(rèn)為自然水體中硝化細(xì)菌分布廣泛，他對(duì)同一水體不同小環(huán)境中的硝化細(xì)菌的分布作了深入的研究。91綜述了硝化細(xì)菌的特點(diǎn)，推薦開(kāi)展硝化細(xì)菌水生微生態(tài)研究。養(yǎng)殖水體中存在的三氮（NH3N、NO2N和NO3N）中，NH3N和NO2N具有很強(qiáng)的毒性。王鴻泰等96研究了池塘中亞硝酸鹽對(duì)草魚(yú)的毒害作用。黃正等97利用固定化硝化細(xì)菌處理養(yǎng)殖廢水，24小時(shí)后，COD除去率達(dá)到74.9，NH3N去除率達(dá)到82.5

38、。C.Schuster等人用硝化細(xì)菌處理閉合循環(huán)養(yǎng)殖隨系統(tǒng)，氨氮含量比對(duì)照降低了77。H.Shah和等用固定化的硝化細(xì)菌處理龍蝦養(yǎng)殖廢水，獲得了理想的效果。Suny-Koo Kim等選擇了適合固定化硝化細(xì)菌且具有經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值的固定化材料。他們使用混合固定化的硝化細(xì)菌處理循環(huán)養(yǎng)殖水，獲得了70 g/m3·d的氨氮處理負(fù)荷。N.Sauthier等使用硝化細(xì)菌生物濾池處理循環(huán)養(yǎng)殖水，氨氮負(fù)荷可達(dá)到2.41 g/m3·d。R.Gromman等用生物濾池也得到了相同的結(jié)果。1.3 論文研究的內(nèi)容及目的1.3.1 論文選題的意義國(guó)際上公認(rèn)的水體發(fā)生富營(yíng)養(yǎng)化的限制濃度是：TN0.2 mg

39、L，TP 0.02 mgL。根據(jù)1986年至1989年，中國(guó)第一次開(kāi)展的大規(guī)模湖泊富營(yíng)養(yǎng)化調(diào)查結(jié)果，全國(guó)26個(gè)主要湖泊、水庫(kù)中TN全部高于0.2 mgL，92的水體TP超過(guò)0.02 mgL。目前許多城市和市郊的小湖已發(fā)展到富營(yíng)養(yǎng)化及“超”富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)。富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象不僅出現(xiàn)在象湖泊這樣水流緩慢的水體中，甚至在某些水淺的急流河段，河床礫石上也大量生長(zhǎng)著藻類(lèi)，出現(xiàn)了十分明顯的富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象。在我國(guó)，對(duì)蝦養(yǎng)殖模式主要為分散式、高密度養(yǎng)殖模式，即小面積、分散式、高密度的投放及投喂對(duì)蝦養(yǎng)殖模式。在這種養(yǎng)殖模式下，一個(gè)養(yǎng)殖周期所產(chǎn)生的總磷（TP）、總氮（TN）和固體懸浮物（TSS）分別為321,668和215

40、,000公斤公頃。為了除去養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，尤其是氨氮和亞硝態(tài)氮，幾天內(nèi)往往需要更換40的養(yǎng)殖水體，而這種富營(yíng)養(yǎng)化的養(yǎng)殖廢水又往往未經(jīng)任何處理直接排入河流進(jìn)入入海口和近海區(qū)域。這樣，大大增加了近海“赤潮”發(fā)生的幾率，同時(shí)大量生長(zhǎng)的好氧生物所造成的局部缺氧環(huán)境嚴(yán)重的破壞了我國(guó)近海海洋生態(tài)平衡。同時(shí)由于高密度的投放飼養(yǎng)和投喂，導(dǎo)致養(yǎng)殖水體本身所積累的氨氮和亞硝態(tài)氮，一直是我國(guó)高密度養(yǎng)殖的最大問(wèn)題。氨氮和亞硝態(tài)氮直接對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象產(chǎn)生毒害，使養(yǎng)殖對(duì)象對(duì)病害的抵抗力降低，從而染病乃至死亡，造成水產(chǎn)養(yǎng)殖戶的巨大損失。一般不同的養(yǎng)殖對(duì)象對(duì)氨氮和亞硝態(tài)氮的耐受濃度不同，以南美白對(duì)蝦為例，非離子型氨氮的安

41、全值為小于0.1 mgL，亞硝態(tài)氮的安全值為小于0.2 mgL。而根據(jù)我國(guó)尤其是廣東地區(qū)，在整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程中，氨氮的濃度一般在0.15 mg/L左右，亞硝態(tài)氮的一般為0.20.8 mg/L左右，這樣大大增加了水產(chǎn)養(yǎng)殖的風(fēng)險(xiǎn)。硝化細(xì)菌（包括氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌）在養(yǎng)殖水體中是存在的。但是，由于養(yǎng)殖過(guò)程中非規(guī)范性的頻繁換水和不定期的消毒，往往導(dǎo)致水體中硝化細(xì)菌的大量流失或死亡，破壞了整個(gè)養(yǎng)殖水體的生態(tài)平衡，也導(dǎo)致了硝化細(xì)菌脫除氨氮和亞硝態(tài)氮作用的弱化乃至喪失。針對(duì)養(yǎng)殖廢水的富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失和環(huán)境破壞，各國(guó)研究人員進(jìn)行了相關(guān)研究，其中，硝化細(xì)菌菌劑的投放技術(shù)、污水工程反應(yīng)器處理技術(shù)便是主要的

42、兩種處理方法。工業(yè)及市政污水處理工程中用到的污水工程反應(yīng)器處理技術(shù)，大都集中應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)效益較好的大規(guī)模的工廠化養(yǎng)殖場(chǎng)地，這樣將廢水集中處理，有效地緩解了養(yǎng)殖水體富營(yíng)養(yǎng)化的情況。但是由于其繁瑣的處理工藝及高昂的維持費(fèi)用使得其在我國(guó)分散式高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理上難以得到應(yīng)用。這種情況還出現(xiàn)在許多發(fā)展中國(guó)家，例如泰國(guó)、馬來(lái)西亞、菲律賓和越南等地。分散的低值養(yǎng)殖個(gè)體戶，由于區(qū)域分散、風(fēng)險(xiǎn)投資和經(jīng)濟(jì)效益等原因，決定了其不可能進(jìn)行大規(guī)模的生物廢水處理工程。因此，針對(duì)這種分散式高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖模式，市場(chǎng)上出現(xiàn)了許多的純“硝化細(xì)菌”產(chǎn)品，主要為國(guó)外及港臺(tái)等地的產(chǎn)品，而國(guó)內(nèi)這種純“硝化細(xì)菌菌劑”產(chǎn)品幾乎沒(méi)有。即使是國(guó)外或港臺(tái)的這類(lèi)產(chǎn)品，由于價(jià)格昂貴也大都應(yīng)用于觀賞魚(yú)的養(yǎng)殖和水族館等場(chǎng)所?，F(xiàn)今水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域有關(guān)“硝化細(xì)菌”的產(chǎn)品魚(yú)目混雜，大都為混合菌群，其中絕大多數(shù)為異養(yǎng)厭氧微生物菌群，例如，芽孢桿菌類(lèi)、乳酸菌類(lèi)和光合細(xì)菌類(lèi)，其本身并不是硝化細(xì)菌菌種。即使是真正的硝化細(xì)菌產(chǎn)品，也因?yàn)槠涫褂梅绞降南拗?，尤其是其菌劑本身氧化性能低，保藏期短等限制，其功效也往往難以達(dá)到產(chǎn)品宣傳的效果。我國(guó)幅員遼闊，養(yǎng)殖面積很廣，以水產(chǎn)養(yǎng)殖凈化水質(zhì)的微生態(tài)制劑為例，2000年全國(guó)淡水池塘養(yǎng)殖面積約300萬(wàn)畝，若每畝水質(zhì)改良劑的用量為30公斤/年，則需