熒光測定黃酮

1、基于熒光光譜法對銀杏黃酮糖苷的檢測研究溫宗壯 中國礦業(yè)大學化工學院生物工程11-2摘要：銀杏黃酮糖苷因具有多種生物活性而被制藥、食品、日用品等諸多領域廣泛應用。針對目前銀杏黃酮糖苷檢測操作繁瑣、成本高、耗時長的不足，建立了一種高精確性、低成本的快速測定方法。根據黃酮類化合物能與Al3+反應形成熒光螯合物的原理，以蘆丁為標樣探索測試條件，結果表明在激發(fā)波長ex=400 nm，發(fā)射波長em=520 nm，pH為3.6 的Al（NO3）3-（HAc-NaAc）反應體系中反應1500 s，螯合物熒光強度趨于穩(wěn)定且達到最大值。求得蘆丁濃度與熒光值的線性回歸方程為y=29.92x+36.49（R2=0.9

2、86），線性范圍為1.8×10-63.2×10-5 mol/L。用這種方法檢測了銀杏懸浮培養(yǎng)細胞中黃酮糖苷的含量，并進行加標回收實驗，平均回收率為101.3%。該方法靈敏度高，重現性好，操作簡單，具有良好的應用前景。關鍵詞：熒光光譜法 銀杏 黃酮糖苷引言銀杏黃酮具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等諸多作用，是生物制藥、保健食品、功能性產品、化妝品和動物飼料添加劑等諸多行業(yè)產品開發(fā)的主要原料1。紫外可見分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry, UV）、高效液相色譜法（ high performance liquid chromat

3、ography, HPLC）等方法是常用于檢測植物中黃酮類化合物的手段。其中UV法是最傳統、應用最廣泛的方法。Zhu等利用紫外可見分光光度法對5種提取馬齒莧黃酮方法的結果進行了檢測2。Wang等也在刺五加上用同樣的方法做過類似的研究3。但是該種方法用于測定植物中未經純化的黃酮粗提物，結果會很大程度上受到雜質的干擾，這已經成為不爭的事實。其原因在于許多提取物中常見的雜質如咖啡酸和鞣質也具有鄰苯二羥基結構，也能參與Al3+的顯色反應，使得測定結果會比實際值偏高。HPLC法測定結果相對準確，但設備昂貴、儀器維護成本高、使用費時且測定各成分時需要標準品對照，使用成本也高，實力一般的科研機構難以接受，通

4、常為了得到更為精確的組分信息，經常與質譜（mass spectrum, MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）等手段連用，進行定性定量檢測。Qing等利用HPLC-MS結合13CNMR法從月季中鑒定了4個黃酮糖苷4。Anja5 、Zhao6 、Chang7等都從不同的生物樣本中分離鑒定了多種黃酮類化合物。毛細管電泳法在分析植物次生代謝物方面也有許多報道。在檢測銀杏黃酮組分中也已經有了應用。Zhang等用毛細管電泳法檢測了菊花黃酮，建立了濃度與電流響應的線性關系8。Chi等利用毛細管區(qū)帶電泳分離檢測了中國涼茶中幾種黃酮物質，這種方法能高效分離、省時、所

5、需樣品少、重現性好9。但其具有HPLC法一樣的缺點。此外氣相色譜法在黃酮類化合物的分析中應用很少，這主要是由于黃酮類化合物不耐受高溫，檢測前需利用衍生化試劑將其衍生化，增加了實驗成本，操作復雜，不被廣泛采用。根據黃酮類化合物能與Al3+反應形成熒光螯合物的原理，本文建立了以蘆丁為標品的銀杏黃酮糖苷熒光光譜法（Fluoro-spectrophotometry method，FSM）的檢測手段。Serbia等曾研究了熒光分光光度法對人血清桑色素的檢測，以液相色譜法的檢測結果為對照，表明兩種方法的相對標準誤差在可接受范圍內，熒光分光光度法是可靠的10。本試驗中以銀杏懸浮培養(yǎng)細胞為樣品提取黃酮糖苷并測

6、定其含量，為植物藥的開發(fā)利用提供了有力保障。1 實驗部分1.1試驗材料與試劑 銀杏細胞為本實驗室培養(yǎng)所得，烘干并碾成粉末，貯存于干燥器中暗處保存?zhèn)溆?。氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇、蘆丁均為分析純及色譜級甲醇產自國藥集團化學試劑有限公司。槲皮素、山萘素和異鼠李素標準品（純度98%）購于成都曼斯特生物科技有限公司，配制成0.05 mg/mL備用。去離子水。1.2儀器設備熒光分光光度計為日本Hitachi公司生產的FL-2700型號；高效液相色譜儀為戴安中國有限公司生產的Dionex P680型，反相C18柱250×4.6mm。1.3 標樣及樣品的制備精確稱取蘆丁標樣0.01 g，

7、色譜級甲醇溶解，定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的標準溶液。取標準溶液1、2、3、4和5mL，各加入10%的Al(NO3)3及2.5 mL的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，用純甲醇定容至25 mL。精確稱取烘干的銀杏愈傷組織和樣品1 g，按固液比1:9加入甲醇，500 W超聲波輔助萃取50 min后濾紙過濾，取試樣加10%的Al(NO3)3溶液及2.5 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，用甲醇定容。1.4測試條件熒光分光光度法測定中激發(fā)光譜通帶和發(fā)射光譜通帶均設定為5 nm，激發(fā)電壓700 V，此條件下,掃描最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長，考察鋁離子添加量、緩沖液pH、甲醇濃度、反應時間對熒光強度的影響。并在

8、所得的最佳色譜條件下測定各濃度標準溶液的熒光強度，建立回歸方程。在相同條件下測定懸浮培養(yǎng)細胞黃酮提取液的熒光強度，根據回歸方程計算含量。黃酮糖苷水解及HPLC法測試條件參照Chen等的方法11。1.5 數據處理所有實驗數據利用軟件Origin pro 8.0處理。2 結果與討論2.1 最佳激發(fā)波長與發(fā)射波長的確定對蘆丁標準品進行激發(fā)波長和發(fā)射波長掃描，如圖1所示當熒光強度最大時，激發(fā)波長ex=400 nm，發(fā)射波長em=520 nm，所以選擇激發(fā)波長ex=400nm，發(fā)射波長em=520nm檢測黃酮。 圖片1 激發(fā)波長和發(fā)射波長下的掃描2.2 Al(NO3)3的添加量考察了10% Al（NO3

9、）3添加量分別為0、1、2、3、4、5和6 mL與黃酮形成的螯合物熒光強度的影響。光譜圖如下2所示：(a)1mLAl3 + (b)2mLAl3+ (c)3mLAl3+ (d)4mLAl3+ (e)5mLAl3+ (f)6mLAl3+ (ck)未添加Al3+ 圖2 不同Al3+添加量下蘆丁熒光光譜圖結果表明，不添加Al3+的處理中，蘆丁未形成螯合物，所以熒光強度一直不穩(wěn)定。所有添加Al3+的處理中，在1500 s后基本呈穩(wěn)定趨勢，添加量小于4 mL的各處理其熒光強度在穩(wěn)定趨勢中還有小幅度波動。綜合熒光強度和絡合物穩(wěn)定性兩方面因素考慮，選擇加入硝酸鋁的量為4 mL較適宜。2.3 甲醇濃度的影響黃酮

10、類化合物在甲醇中溶解度較好，難溶于水，選擇甲醇做為溶劑。分別以10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的甲醇溶解蘆丁，各處理下熒光強度見下圖。（a）10%甲醇 （b）20%甲醇 （c）30%甲醇 （d）40%甲醇 （e）50%甲醇 （f）60%甲醇 （g）70%甲醇 （h）80%甲醇 （i）90%甲醇 （j）100%甲醇圖片3 不同甲醇濃度下的蘆丁光譜圖根據各甲醇濃度與對應的蘆丁螯合物最大熒光值繪制趨勢圖，發(fā)現甲醇濃度為100%時，熒光強度最大，且光譜曲線平滑，沒有波動，說明此條件下所生成的螯合物熒光強度穩(wěn)定。所以選擇100%的甲醇作為溶劑。圖片4 熒光

11、強度隨著甲醇濃度的變化 2.4 pH值的影響溶液的pH值對絡合物的形成和熒光強度的大小有一定的影響。向溶液中加入不同pH的緩沖液，對熒光強度的的大小進行考察，見圖5，結果表明，加入pH=3.4-4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液時，溶液的熒光強度相對比較大，且熒光值相對穩(wěn)定。pH=3.6時熒光值達到最大583.2。（a）pH3.6 （b）pH3.8 （c）pH4.0（d）pH4.2 （e）pH4.4 （f）pH4.6（g）pH4.8 （h）pH5.0 （i）pH5.2 （j）pH5.4 （k）pH5.6 （l）pH5.8 （ck）未加緩沖 圖片5 不同PH下蘆丁的光譜圖根據緩沖液各pH與對應的蘆丁螯

12、合物最大熒光值繪制趨勢圖，隨著pH的加大，熒光強度在不斷減小，尤其是pH從4.0降至4.2時熒光值發(fā)生了急劇的下降。4.2-5.8范圍內仍然是不斷下降趨勢，故試驗選取pH 3.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液。 圖片6 熒光強度隨著PH的變化情況 2.5 反應時間的影響Al3+與黃酮反應時間不同，產生的熒光強度大小不一樣。添加Al3+后將溶液避光，測定溶液的熒光強度，進行時間掃描。見圖7，實驗表明，隨時間推移，熒光強度逐漸加強， 1500 s后趨于穩(wěn)定，為了檢驗所產生的熒光化合物是否穩(wěn)定，將反應時間延長至3500 s，但熒光強度沒有發(fā)生明顯變化，說明1500 s時反應已經充分完成。因此，選擇反應時間15

13、00 s時測定熒光值。圖片7 熒光強度光譜圖隨反應時間的變化2.6干擾實驗檢驗了常見的幾種金屬離子對FMS法測定銀杏黃酮的干擾，結果表明Na+、K+、Ca2+3種金屬離子對測定干擾很小，可以忽略。2.7 標準曲線經過對實驗條件的優(yōu)化，對標品蘆丁做標準曲線。取不同濃度的蘆丁，加pH 3.6 的HAc-NaAc緩沖液，添加10%硝酸鋁4mL反應1500s，測定各濃度下絡合物熒光強度。用origin pro8.0擬合出標準曲線，得出熒光強度與蘆丁濃度在1.8×10-6-3.2×10-5 mol/L內具有良好的線性關系，如圖8。 圖8 蘆丁濃度-熒光強度標準曲線其回歸方程為：y=2

14、9.92x+36.49其中y為熒光強度，x為蘆丁濃度。2.8 實際樣品測定及加標回收利用該方法對銀杏培養(yǎng)細胞黃酮糖苷含量進行測定，并與HPLC法進行了對比，各對樣品溶液分別進行5次平行測定，結果見表1。表1 熒光分光光度法對銀杏懸浮細胞黃酮糖苷的測定試驗編號黃酮糖苷含量/%FSMHPLC12.853.0222.933.0833.022.9442.902.8952.893.12平均2.9183.01在細胞提取液中加入蘆丁標樣進行回收實驗，計算回收率。結果見表2。表2 銀杏細胞黃酮提取物加標回收率編號原含量/mg加入量/ mg測定值/ mg回收率/%平均回收率/%114.841.0015.8610

15、2.0101.45216.371.5017.88100.8313.622.0015.67102.4418.031.5019.54100.6由表2可知，熒光分光光度法測定銀杏愈傷組織中黃酮含量的平均回收率為 101.3%，實驗結果說明該方法精確度高，可行性強。3 結論建立了一種準確性高、成本低、快速測定銀杏黃酮的方法。結果表明在合適的pH范圍內黃酮在乙醇-水提取體系中與Al3+反應，所形成的復合物在體系穩(wěn)定、在ex400 nm、em520 nm測試條件下，其具有較強的熒光強度。利用這種方法檢測了銀杏懸浮細胞中黃酮的含量為2.918%，回收率為101.3%。FSM的開發(fā)對銀杏資源的開發(fā)利用有較大的

16、促進作用，對其他藥用植物的黃酮測定有一定借鑒意義。 參考文獻1 Shibata S. Anti-tumorigenic chalconeJ. Stem Call, 1994, 12(1): 44.2Zhu H, Wang Y, Liu Y, Xia Y, et al. Food Analytical Methods, 2010, 3 (2): 90.3Wang Y, Chu H T. Advanced Materials Research, 2011, 236: 2630.4 Qing L S, Xue Y, Zhang J G, et al. Journal of Chromatography A, 2012, 1249 (6): 130.5Anjak,Markusg G. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2012, 70 (5): 553:556.6 Zhao X, Zhao Y L, Liu X M, et al. Journal of Seperation Science, 2012 ,35 (8) , 984:993. 7Chang C C, Lee SS.Chemistry and Natural Compounds, 2012, 48 (4):689:690. 8Zhang Y Y,