AB液質(zhì)操作規(guī)程

1、第一部分 開關(guān)機(jī)A A 、開機(jī)1.打開UPS電源，打開氮氣發(fā)生器（氣瓶），確認(rèn)Curtain gas的輸入壓力為0.4MPa，gas1/2為0.7MPa，exhuast為 0.4MPa。2.打開機(jī)械泵電源開關(guān)（5500系列直接打開質(zhì)譜主機(jī)電源，儀器自動啟動機(jī)械泵）3.等機(jī)械泵工作至少30min5.打開質(zhì)譜主機(jī)電源開關(guān)6.過夜抽真空B B 、關(guān)機(jī)1.停止輸液：關(guān)停針泵或液相泵，或斷開輸液管線（一般質(zhì)譜主機(jī)Standby后液相系統(tǒng)也自動待機(jī)，輸液泵自動關(guān)停，但建議操作人員再次確認(rèn)，必須保證沒有任何液體再泵入質(zhì)譜）2.使儀器待機(jī)，并滅活配置2.關(guān)閉質(zhì)譜儀主機(jī)電源開關(guān)（5500系列只需按下電源開關(guān)旁的

2、VENT按鍵排放真空）3.機(jī)械泵繼續(xù)工作至少30min4.關(guān)閉機(jī)械泵上的電源開關(guān)（5500系列會自動關(guān)停機(jī)械泵，待機(jī)械泵停止后即可關(guān)閉5500系列主機(jī)上的電源開關(guān)）5.關(guān)閉氣體發(fā)生器或氣瓶第二部分 調(diào)諧1、PPG就是正離子校正液，PPG3000負(fù)離子調(diào)諧液，本臺儀器只用兩瓶校正液，正離子一瓶，負(fù)離子一瓶。洗液一瓶50%的甲醇水。調(diào)諧前先用洗液洗針兩次。吸校正液的時候慢慢吸，避免吸入氣泡，吸好以后將針泵卡住。再將高度調(diào)到5，將管路重新連接。不再連接六通閥，由質(zhì)譜直接進(jìn)樣，且將針泵的速度調(diào)到10L/ml。2、調(diào)諧液弄好后在儀器面板工具欄上：TOOl項目創(chuàng)建項目。此項目為一個文件夾，文件夾里面包括所

3、有此次采集的信息，方法、序列等，且所有采集的項目都固定在一個文件夾下面：D:/Analyst Data/Project。新建項目的時候，彈出窗口中有個Add All，可以創(chuàng)建孫文件夾。3、聯(lián)機(jī)：軟件打開后在左上方硬件配置（單機(jī)選中，雙擊打開）只需選中儀器MSactive profile。圖標(biāo)變?yōu)榫G色，表示聯(lián)機(jī)成功。調(diào)諧只需要選中質(zhì)譜。儀器的實時狀態(tài)可以點擊右下方的圖標(biāo)，質(zhì)譜和液相都是單獨觀察，質(zhì)譜要注意真空度，為0.5.4、調(diào)諧手動調(diào)諧項目（文件夾）選中下拉菜單中的Installation 20161102（為系統(tǒng)默認(rèn)的調(diào)諧文件夾），先Q1start syring pump（打開針泵）star

4、t（質(zhì)譜），開始采集以后觀察基線是否平衡，若等兩分鐘還未平衡好，則手動將針泵往上抬。5、平衡好后（基線平穩(wěn)則為平衡好），重新進(jìn)樣，重新點擊start syring pump。Resolution（分辨率）advanced（高級選項）（看到結(jié)果后調(diào)節(jié)質(zhì)量軸和分辨率做準(zhǔn)備，只能先打開這個，再打開譜圖）實時質(zhì)譜圖右鍵open file隨便點一個框軟件上方的從譜圖校正 PPG.POS(正離子) start出現(xiàn)三行：（1、質(zhì)量軸。2、分辨率。3、兩次調(diào)諧的差異）若質(zhì)量軸有差異右上角 yes若分辨率飛離出虛線offset（偏大調(diào)大，偏小調(diào)小）輸入校正的數(shù)值，再重新進(jìn)樣，如此反復(fù)，直到點落在虛線以內(nèi)，實線代

5、表最合適。6、校正好后儀器會自動保存，直接關(guān)掉窗口即可。負(fù)離子調(diào)諧和正離子調(diào)諧步驟一樣，只是在選擇方法的時候要注意選擇負(fù)離子模式。還有看結(jié)果時要選擇PPG3000.此為負(fù)離子調(diào)諧液。調(diào)諧因針泵流速很小，10L/ml，所以不需要設(shè)定離子源溫度及輔助氣，直接設(shè)定噴霧器流速為50，就可以將樣品霧化，氣簾氣也不需要設(shè)置，因為沒有多余的溶劑需要吹走。第三部分：方法優(yōu)化1.在Analyst軟件Tools菜單中選擇ProjectCreate Project。在Project name項下輸入新建的Project名稱。注意，不要點選窗口中的其他按鈕！點擊OK，確認(rèn)新建Project。2.在Analyst軟件界

6、面下，雙擊導(dǎo)航欄內(nèi)Hardware Configuration。在彈出窗口中選擇MassOnly，點擊Activate Profile，激活MassOnly（只聯(lián)接質(zhì)譜主機(jī)）。3.在導(dǎo)航欄內(nèi)單擊Tune and Calibrate，進(jìn)入調(diào)諧模式。點擊上方工具條中的T鈕。此時，應(yīng)注意到主機(jī)有“撲”聲音，表明進(jìn)入調(diào)諧狀態(tài)。此時右下角質(zhì)譜狀態(tài)顯示綠色。雙擊Manual Tuning，進(jìn)入質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置及運行窗口。4.使用1mL玻璃進(jìn)樣針吸取適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于進(jìn)樣針座上。點擊MS Method下拉菜單，選擇Syringe Pump Method，設(shè)定針泵流速Flow Rate為10L/min。 5.點擊

7、Start Syringe Pump按鈕開針泵進(jìn)樣。6.返回MS Method，選擇掃描模式Scan Type為Q1 MS，設(shè)定掃描速度Scan Rate為10Da/s，設(shè)定掃描范圍StartStop設(shè)定為50化合物分子量。DP預(yù)輸入60。7.點擊start開始采集數(shù)據(jù)。運行穩(wěn)定后，注意觀察是否有預(yù)期的母離子出現(xiàn)，并控制其響應(yīng)值在約E4以下。點擊stop，選擇第一個峰（后面是同位素峰）的平穩(wěn)段，雙擊，選中母離子。點擊右鍵，選擇Delete Pane。8.設(shè)定Scan type為產(chǎn)物離子掃描Product Ion（Ms2），掃描速度200Da/s，選擇掃描正/負(fù)離子，輸入母離子（product

8、of），設(shè)定掃描范圍startstop為50MW+20，覆蓋可能的子離子質(zhì)量范圍，點擊compoud標(biāo)簽，設(shè)定（DP）60，（CE）5。9.點擊start，開始采集數(shù)據(jù)，注意觀察是否有預(yù)期的母離子出現(xiàn)。手動調(diào)節(jié)CE，以5eV為步長，逐漸增加。每次增加后稍作等待，直至目標(biāo)化合物的子離子清晰看見。選擇平穩(wěn)的一段，雙擊，選擇子離子。10.選擇Scan Type為MRM。設(shè)定參數(shù)表格中的Q1對應(yīng)的母離子，Q3對應(yīng)的子離子，time（ms）為50，ID值設(shè)為 名稱 1（定量），名稱 2（定性）。11.點擊Edit Ramp，在Parameter下選擇Collision Energy，點擊OK。點擊sta

9、rt開始采集數(shù)據(jù)，記錄每個MRM通道的最佳CE電壓。在MRM參數(shù)設(shè)定表中，右鍵點擊。選擇Collision Energy CE，調(diào)出表格中的CE列，輸入每個MRM通道的最佳CE電壓值，精確到個位數(shù)。重復(fù)以上步驟，在Parameter項下選擇Declustering Potential，優(yōu)化并保存DP。完成后選擇菜單File/Save保存采樣方法，文件名.dam。 第四部分：方法建立一、LCMS方法的建立：1、連接儀器：打開 HPLC質(zhì)譜電源，將 HPLC系統(tǒng)接上柱子，將6號出口管線與離子源連好。調(diào)離子源噴霧針位置到2mm處，雙擊Hardware Configure，在硬件配置菜單下單擊LCMS

10、 ( 液相與質(zhì)譜聯(lián)用 )， 單擊Activate profile激活儀器，會聽到笛的一聲，說明儀器已經(jīng)連接上。 2、確認(rèn)液質(zhì)同步：選擇項目（之前優(yōu)化方法的時候已經(jīng)建立的項目）；雙擊 Build acquisition method新建方法，彈出新建方法模板。在模板左側(cè)點擊acquisition method，模板右邊顯示對應(yīng)的參數(shù)，確認(rèn)synchronization mode選擇LC Sync,表示液質(zhì)同步。3、設(shè)置MRM參數(shù)：點擊方法模板左側(cè)的MRM, 在模板右側(cè) Scan Type下選擇 MRM；在polarity下選擇化合物極性：Positive(正離子)、Negative（負(fù)離子）；D

11、uration為15min(與液相分離相同的時間)；表格中Q1：母離子分子量，Q3(Da)：子離子分子量，Time（msec）：50，ID欄：化合物名稱（離子對名稱后空格加1為定量，空格加2為定性），在表格中右鍵分別單擊DP、CE，點擊工具欄的OPEN打開之前優(yōu)化的方法參數(shù)，調(diào)出DP,CE值，選中整行， Ctrl+c(復(fù)制)參數(shù)，關(guān)閉窗口，再Ctrl+v(粘貼)參數(shù)）；最后點擊Edit parameter設(shè)置離子源參數(shù)：Source/Gas項用以下推薦值：CUR 35，IS:5500(正離子) 或-4500（負(fù)離子），TEM 600，GS1 60，GS2 70，點擊OK。4、設(shè)置液相參數(shù)：點擊

12、模板左邊的shimadzu LC system，在右邊的pumps欄下，設(shè)置stop time （運行時間）為15min， flow流速為1mL/min，A為水相設(shè)為95%，B為有機(jī)相設(shè)為5%（設(shè)置時改B，A自動），泵最大壓力為50；點擊time program設(shè)置液相梯度：例咪唑類梯度設(shè)置：Time(min)AB-95%5%55%95%105%95%10.195%5%1595%5%接著在右邊的Auto sampler欄下，設(shè)置清洗時間，在Rinse mode 下選擇Before and after(前后都洗)，并設(shè)置清洗時間為5s，清洗液用50%甲醇水。最后點擊保存按鈕,在保存窗口輸入該方法

13、的名稱。二、建立批處理：1、雙擊Build acquisition batch，在右邊窗口set欄為批處理保存的文件夾命名以便識別，再點擊add set，最后點擊add sample，再選擇之前建立的LC-MS方法，在彈出的窗口內(nèi)的number（進(jìn)樣樣品數(shù)）處填入需要進(jìn)樣的樣品個數(shù)，點擊OK。2、在加入的樣品列表內(nèi)依次填寫sample name（樣品名稱）、via position（樣品瓶的位置）、inj.volunme（進(jìn)樣體積：一般5微升或10微升）。3、在submit項下點擊submit按鈕以提交樣品序列。4、點擊工具條上左上角的view queue按鈕 ，可查看已提交的樣品。此時將儀器

14、從校正狀態(tài)退出，進(jìn)入分析模式。確認(rèn)泵已打開，首次進(jìn)樣液相先排氣，再平衡儀器：先點擊工具條上的equilibrate平衡按鈕，在彈出的平衡窗口中輸入平衡時間10min，點擊ok。右下角圖標(biāo)會變黃，待平衡結(jié)束后此處圖標(biāo)會變成綠色，此時即可點擊start sample按鈕采集樣品信息，儀器會自動對已提交的全部樣品進(jìn)行采集。 第五部分 數(shù)據(jù)處理1. 雙擊打開Multiquilt，選擇項目，點擊File下的熒光棒型圖標(biāo)，點擊sample，選擇需要的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)據(jù)，點擊next，create new method，為方法命名，點擊next，選擇一個有代表性的樣品（一般選擇濃度較大的標(biāo)品數(shù)據(jù)），設(shè)置分組（

15、同一物質(zhì)定量離子和定性離子設(shè)置為一組），并指定內(nèi)標(biāo)，next，對每個物質(zhì)進(jìn)行積分。2. 設(shè)置積分參數(shù)：a、 Causian Smoth（平滑）：一般是0，如有毛刺可改成1或2；b、 Expeceted Time（保留時間）:一般不動c、 Expected time范圍：一般30s，表示在保留時間±15s范圍d、 最小峰寬e、 最小峰高f、 背景噪音扣除：可調(diào)整目標(biāo)峰基線以下被積分的面積，比例越高積分越往下，必要時調(diào)整。g、 分峰因子 ：峰有分叉時設(shè)置，如有兩個分叉，設(shè)置為2，峰分叉不能大于2h、 單位：設(shè)置單位，勾選Apply units to all可將此單位用于所有化合物點擊ne

16、xt，點擊finish。在新跳出窗口內(nèi)將標(biāo)準(zhǔn)品選定，輸入濃度。查看各化合物積分是否正常，點擊第三個圖標(biāo)查看標(biāo)準(zhǔn)曲線。報告打印：點擊File，create report，Report template（選擇報告模板，一般用sample1 和標(biāo)線，內(nèi)標(biāo)報告只能用sample1,2,3），命名，選擇存儲報告位置，點ok。信噪比：選擇項目，雙擊open date file，點擊sample，選擇低濃度樣品，點擊ok，點擊XIC，選擇定量離子，點擊ok，選中峰，按住shift，選峰附近的一段時間，點Script，點擊S-ToNScript，即可得到結(jié)果。第六部分：LC-MS離子阱原理及其應(yīng)用原理：在進(jìn)行

17、多級質(zhì)譜分析(MS-MS)時，首先限定目標(biāo)質(zhì)量的離子。通過調(diào)整交變電壓，將大于以及小于目標(biāo)質(zhì)量的離子射出，從而使得僅有一個質(zhì)量的離子存在于離子阱中并將其富集。目標(biāo)質(zhì)量的范圍被稱為Isolation Width。之后通過向離子阱內(nèi)注入氣體（通常為氦氣或氮氣），與離子發(fā)生碰撞使其被打成碎片。操作方法：首先在Analyst中打開一個成熟的MRM采樣方法，然后右鍵單擊Acquisition Method中的MRM，在彈出菜單中選擇Add IDA Criteria Level。在新增的IDA-First Level Criteria頁面中設(shè)置相關(guān)邏輯選項（其中四項尤為重要）1) Select “X”to

18、 “Y” most intense peaks，表示在多個組分色譜共流出時，指定觸發(fā)最強(qiáng)的若干個母離子，“1 to 2”表示最強(qiáng)和次強(qiáng)的兩個母離子，“1 to 3”表示最強(qiáng)和次強(qiáng)和第三位三個母離子，以此類推。請注意，如果選擇了“1 to 2”或“1 to 3”，則后續(xù)的EPI個數(shù)應(yīng)調(diào)整為對應(yīng)的兩個或三個。（一般選擇兩個以下）2) After Dynamic Background Subtraction of Survey Scan，表示執(zhí)行動態(tài)背景扣除，使得感興趣的母離子都盡可能的獲得觸發(fā)EPI 的機(jī)會。該選項尤為重要，為必選項。3) Exclude former target ions。在某些情況下，一次