測(cè)序常見問題分析實(shí)例

1、測(cè)序常見問題分析實(shí)例 峰型整齊，在某一點(diǎn)前后突然變亂信號(hào)迅速衰減信號(hào)極弱或無信號(hào)整條序列信號(hào)雜亂                                       峰型整齊，在某一點(diǎn)前后突然變亂： 圖1 Pol

2、yT特殊結(jié)構(gòu)     上圖是我們的一個(gè)質(zhì)粒測(cè)序樣品，用T7通用引物進(jìn)行測(cè)序，從圖中可以看出，在約285bp的polyT結(jié)構(gòu)后，序列明顯變亂。主要原因是在polyT結(jié)構(gòu)后，測(cè)序酶容易在模板上滑動(dòng)，導(dǎo)致polyT結(jié)構(gòu)后的峰型變得雜亂。此類樣品通過對(duì)其反向互補(bǔ)序列進(jìn)行測(cè)序，一般可以得到好的結(jié)果。圖2 移碼突變雙模板的存在    上圖是我們的一個(gè)質(zhì)粒測(cè)序樣品，用M13+通用引物進(jìn)行測(cè)序，從圖中可以看出，該序列在290bp后序列明顯有兩套峰存在。造成該現(xiàn)象的原因可能有如下幾條：序列發(fā)生缺失突變插入外援片段的載體和未插入外援片段的載體同時(shí)存在PC

3、R產(chǎn)物用T載體進(jìn)行克隆時(shí)，PCR片段可以以兩個(gè)方向克隆進(jìn)T載體所挑克隆不純兩個(gè)大小相近的PCR產(chǎn)物同時(shí)存在，無法純化分開解決的辦法：對(duì)于質(zhì)粒模板，重新挑選克隆，或從另一段進(jìn)行測(cè)序?qū)τ赑CR模板，用另一端引物進(jìn)行測(cè)序，或克隆后進(jìn)行測(cè)序圖3 等位基因雙模板的存在    上圖是針對(duì)一個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行的測(cè)序結(jié)果，從圖中可以明顯看出，在序列的80bp到120bp之間有兩套峰存在，但是沒有發(fā)生移碼突變。該情況與圖2所舉的例子有所不同，該情況下從反向進(jìn)行測(cè)序仍然不可能得到好的測(cè)序結(jié)果。該種情況下只能采取克隆的方法將兩套模板分開，分別進(jìn)行測(cè)序。信號(hào)迅速衰減   &#

4、160;                                                 &#

5、160;                 返回 圖4 CTT重復(fù)結(jié)構(gòu)    如上圖，在大約260堿基后出現(xiàn)了一個(gè)嚴(yán)重的CTT重復(fù)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致信號(hào)迅速衰減，很難得到跨過該區(qū)后的信息。該種情況下，只能從另一端進(jìn)行測(cè)序，一般來說，AAG重復(fù)結(jié)構(gòu)不會(huì)太影響測(cè)序。也可以對(duì)片段進(jìn)行亞克隆，使每個(gè)片段大小不大于200bp，然后再進(jìn)行測(cè)序。不過，該方法要麻煩很多。 圖5 GGT重復(fù)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重影響測(cè)序  &#

6、160;  上圖下半部分是一個(gè)質(zhì)粒模板用M13+通用引物進(jìn)行測(cè)序，大約在130bp開始，出現(xiàn)GGT重復(fù)結(jié)構(gòu)，測(cè)序信號(hào)迅速減弱至消失。上圖的上半部分是用M13-通用引物從反向進(jìn)行測(cè)序，在反向序列上該重復(fù)是GGT的反向互補(bǔ)序列，即ACC，大約在500bp處，測(cè)序很輕松地就讀過了ACC重復(fù)序列區(qū)。GGT重復(fù)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重影響測(cè)序的原因是在測(cè)序試劑盒中，為了得到均勻的測(cè)序峰型圖，G和T堿基均進(jìn)行了替代，分別替代成I和U，因此與模板的結(jié)合能力減弱，測(cè)序酶反應(yīng)到此后就比較難延伸下去，導(dǎo)致該區(qū)域后信號(hào)迅速減弱。通過優(yōu)化多種條件，可以對(duì)結(jié)果有一點(diǎn)改善，但仍然不能得到可用的結(jié)果。對(duì)該類型的模板，對(duì)反向互補(bǔ)鏈

7、進(jìn)行測(cè)序，可以很輕松地跨過該區(qū)域。  圖6 GC特殊結(jié)構(gòu)區(qū)    上圖是一個(gè)質(zhì)粒模板用M13+通用引物進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果，序列中存在一個(gè)GC特殊結(jié)構(gòu)區(qū)，在該區(qū)域后，信號(hào)迅速減弱。上圖的下半部分是對(duì)測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化后的測(cè)序結(jié)果，在GC特殊結(jié)構(gòu)后，測(cè)序信號(hào)得到一定程度的改善，但是離一般的測(cè)序結(jié)果還是相差甚遠(yuǎn)。針對(duì)該類型的模板，一般應(yīng)從反向進(jìn)行測(cè)序，然后在該特殊結(jié)構(gòu)區(qū)附近將兩個(gè)方向的測(cè)序結(jié)果拼接起來，得到完整的序列。圖7 模板特殊結(jié)構(gòu)    上圖是一個(gè)pGEM-T載體用M13+引物進(jìn)行測(cè)序，可以看出，序列在載體后迅速衰減，造成此現(xiàn)象的

8、原因一直不明，我們?cè)囉昧硕喾N方法試圖解決該測(cè)序問題，但幾乎毫無效果。該種情況很有可能是在全序列中有大的特殊結(jié)構(gòu)，造成嚴(yán)重的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，使測(cè)序酶無法讀過此區(qū)域。正常情況下pGEM-T載體測(cè)序結(jié)果非常理想。                         返回信號(hào)極弱或無信號(hào) 造成該現(xiàn)象主要有兩個(gè)原因：模板質(zhì)量極差；   引物與模板序列不匹配。 圖8

9、 pGEM質(zhì)粒用T3通用引物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果無可用信息，因?yàn)閜GEM載體上無T3通用引物結(jié)合位點(diǎn)。上圖中兩處峰前面的一個(gè)主要是未去除的測(cè)序反應(yīng)單體造成的，靠右邊的一處峰主要是引物的非特異性反應(yīng)造成的。       在我們每天的測(cè)序樣品中，有相當(dāng)一部分測(cè)序失敗的樣品是由于缺少引物結(jié)合序列造成的，主要有下面幾種原因可能造成該種結(jié)果：客戶提供了錯(cuò)誤的載體信息或引物信息，用客戶自己在克隆片段上的引物對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，但是該質(zhì)粒為空載體，不包含插入片段。載體由于突變，丟失了原來的引物結(jié)合位點(diǎn)。圖9 一個(gè)PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果，整個(gè)序列信號(hào)極低，幾

10、乎無可用信息。造成該現(xiàn)象主要是在測(cè)序反應(yīng)中，模板的量太低，所得信號(hào)太弱。       重新提供足夠量的模板一般可以得到較好的測(cè)序結(jié)果。                          返回  整條序列信號(hào)雜亂       模板本

11、身的問題： 圖10 一個(gè)污染的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，可以看出，整條序列都有極高的背景。 有以下幾個(gè)原因可能造成測(cè)序模板污染：   PCR產(chǎn)物有雜帶 質(zhì)粒類型的模板克隆不純 對(duì)于PCR類型的模板，我們現(xiàn)在都采取切膠的方法進(jìn)行純化。該純化方法一般情況下可以將PCR產(chǎn)物的雜帶及多余的引物去掉。但是，當(dāng)擴(kuò)增的片段中包含有大小非常近似的片段時(shí)，切膠純化的方法也無濟(jì)于事了。該情況下只能采取將待測(cè)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序了。質(zhì)粒類型的測(cè)序模板一般有兩種原因可以造成模板污染。一為所挑選的克隆不純，包含兩種或兩種以上的克隆，如不包含插入片段的克隆和包含插入片段的克隆的混合體，用T載體

12、進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時(shí)，正向插入的克隆和反向插入的克隆的混合體等。通常重新挑選獨(dú)立的克隆可以解決該問題。第二種情況是一些產(chǎn)量很低的質(zhì)粒，測(cè)序時(shí)需要加入較多體積的模板，因此相應(yīng)包含的雜質(zhì)就要多了，這些增加的雜質(zhì)對(duì)測(cè)序?qū)a(chǎn)生極大的影響。通常我們要求質(zhì)粒的產(chǎn)量要達(dá)到每毫升菌液能夠提取到至少200 ng的質(zhì)粒，低于此產(chǎn)量的質(zhì)粒用于測(cè)序成功率將大大下降。對(duì)于低產(chǎn)量的質(zhì)粒，一般讓客戶自己采取大量提取的方法，拿到足夠用于測(cè)序的量的質(zhì)粒，最少1ug。圖11 PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果，該結(jié)果信號(hào)很強(qiáng)，峰型整齊，但是在該測(cè)序結(jié)果中有多個(gè)位置有重疊峰，出現(xiàn)N值。造成該情況的主要原因很可能是該P(yáng)CR產(chǎn)物中有突變體的存在。在每個(gè)突變位點(diǎn)上有一個(gè)重疊的峰，由于儀器無法正確識(shí)別該處的堿基，就只能以N值代替。在有的測(cè)序結(jié)果中，整條序列信號(hào)很好，在個(gè)別位置有N值，一定要確認(rèn)該處N值的具體情況，如果卻是兩個(gè)重疊峰存在，重新測(cè)序也解決不了問題。