抗FMDV基因疫苗的研究進(jìn)展.docx

1、第39卷第4期西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)-自然科學(xué)版JournalofSouthwestUniversityforNationalitiesNaturalScienceEditiondoi:10.3969/j.issn.)003-4271.2013.04.02抗FMDV基因疫苗的研究進(jìn)展嚴(yán)亨秀，唐冬梅，付麗新(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041)摘要：口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物一種高接觸性傳染病.口蹄疫一旦爆發(fā)和流行，會(huì)使家南生產(chǎn)性能降低，給養(yǎng)殖戶(hù)造成重大損失，給公共衛(wèi)生造成重大的影響.隨著弱毒苗禁用和滅活苗的戒少使用，新型疫苗的研究成為熱點(diǎn).自1990年首次出現(xiàn)基因疫

2、苗的研究報(bào)道之后、及因疫苗已經(jīng)成為疫苗研究領(lǐng)域中的一大熱點(diǎn)，因此該文對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外口蹄疫基因疫苗研究的主要進(jìn)展進(jìn)行絳述：關(guān)鍵詞：口蹄疫：FMDV;基因疫苗中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65;S855.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1003-4271(2013)04-0495-06口蹄疫(foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)所引起的牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性傳染病.該病具有傳播速度快、流行范圍廣、對(duì)畜牧業(yè)危害較大的特點(diǎn).該病一旦發(fā)生爆發(fā)流行，會(huì)使家畜生產(chǎn)性能降低，給公共衛(wèi)生造成重大的影響.我國(guó)將此病規(guī)定

3、為一類(lèi)動(dòng)物傳染病,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織也將其列為A類(lèi)傳染病.世界各國(guó)都十分重視對(duì)該病的防控.我國(guó)是發(fā)病國(guó)之一，主要流行0型、A型、Asial1型口蹄疫.目前我國(guó)防治口蹄疫主要采取綜合防治措施：以疫苗計(jì)劃免疫為主同時(shí)輔以疫區(qū)封鎖和撲殺.傳統(tǒng)的口蹄疫疫苗主要有弱毒疫苗和滅活疫苗.但由于口蹄疫病毒易發(fā)生變異，弱毒疫苗遺傳性不確定，所以從上個(gè)世紀(jì)70年代開(kāi)始，弱毒苗已經(jīng)停止研究與應(yīng)用.同時(shí)由于滅活疫苗的潛在風(fēng)險(xiǎn)，歐盟于1992年宣布停用FMDV滅活苗.因此，研制安全、高效的新型疫苗已成為未來(lái)疫苗發(fā)展的趨勢(shì)，其中基因疫苗作為一種新型疫苗成為研究的熱點(diǎn).本文就目前豬FMD基因疫苗國(guó)內(nèi)外進(jìn)展作些探討.1 FMD

4、V結(jié)構(gòu)口蹄疫的病原為口蹄疫病毒(FMDV),該病毒屬于單股正鏈無(wú)囊膜RNA病毒，是小RNA病毒科口蹄疫病毒屬的成員.FMDV共有7個(gè)血清型，根據(jù)其核酸同源性大小又分為兩個(gè)群.第1群分為O、A、和AsiaI型；第二群分為SAT1、SAT2、SAT3.目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FMDV至少擁有80個(gè)亞型，且各血清型之間也存在著一些交叉免疫的現(xiàn)象.FMDV的病毒粒子包括衣殼和RNA兩部分.在病毒的中心是一條單鏈的正鏈RNA,大約由8000個(gè)堿基組成，是病毒感染和遺傳的基礎(chǔ)；周?chē)牡鞍踪|(zhì)決定了病毒的抗原性、免疫性和血清學(xué)反應(yīng)能力；病毒的衣殼為對(duì)稱(chēng)的20面體.其由VP1、VP2、VP3、VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白

5、組成網(wǎng).由于結(jié)構(gòu)蛋白突顯在病毒粒子表面，承受了較大的選擇壓力，而且VP1蛋白暴籍在病毒粒子表面部分多，因此VP1基因容易發(fā)生變異.這些變異常常導(dǎo)致毒株的抗原性以及毒力的變化，給口蹄疫防治造成了很大困難.VP1代表了口蹄疫病毒的免疫原性以及遺傳性方面的特點(diǎn)，因此在決定病毒的抗原性方面有著重要作用.經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在口蹄疫O型，有位于VP12140、141160、200213位氨基酸上的3個(gè)中和性抗原.其中141160及200213位氨基酸為B細(xì)胞的表位，能引發(fā)相關(guān)的體液免疫反應(yīng).從口蹄疫病毒衣殼蛋白中分離出VP1可以誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生中和性抗體.研究者們開(kāi)始嘗試用病毒衣殼蛋白上的相關(guān)抗原表位來(lái)設(shè)計(jì)基因工程

6、抗原，并用來(lái)檢測(cè)和預(yù)防疾病同.收稿日期：2013-05-21作者簡(jiǎn)介：嚴(yán)亨秀(I97I-),女,副教授，博士，Email:yanhengxiu基金項(xiàng)目:四川省科技廳項(xiàng)目：2011JYOO33;西南民族大學(xué)研究生學(xué)位點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目(2011XWD-S0906)2 FMDV基因疫苗基因疫苗是將需要的外源基因克隆整合到用作真核表達(dá)的栽體上，再把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，使外源性基因在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)得到相關(guān)表達(dá)，并產(chǎn)生抗原、激活機(jī)體的免疫反應(yīng)叫疫苗原理是：質(zhì)粒DNA本身沒(méi)有或者有微弱的免疫原性，不能夠引起相關(guān)的免疫應(yīng)答，但是在被感染宿主細(xì)胞內(nèi)，模擬病毒感染，從而誘發(fā)有用的應(yīng)答反應(yīng).同傳統(tǒng)疫苗相比，基因疫苗具有很

7、多優(yōu)點(diǎn)，比如無(wú)感染性，較好的熱穩(wěn)定性，易操作等“I.在早期研究中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒DNA能夠刺激并產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng).質(zhì)粒中所包含的相關(guān)抗原基因被翻譯后，提呈給機(jī)體免疫系統(tǒng)時(shí)，可以誘導(dǎo)B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫反應(yīng)IW.同傳統(tǒng)的疫苗相比，基因疫苗能夠引起廣泛的免疫應(yīng)答，包括先天免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫M(jìn)m】.同時(shí)，基因疫苗擁有多種免疫方式，包括注射免疫、基因槍法和電穿孔法等，當(dāng)以基因槍法或者電穿孔法進(jìn)行免疫時(shí)，往往產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫；而進(jìn)行肌肉注射、皮內(nèi)注射、腹腔注射時(shí)則會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫口蹄疫基因疫苗一般是保護(hù)性抗原基因和真核表達(dá)質(zhì)粒載體這兩部分組成.保護(hù)性的抗原基因可以是：能編碼VP1

8、的抗原位點(diǎn)上的表位口-24】，單個(gè)基因(如VP1)四)，一組基因I2&29,也可以是編碼基因和有協(xié)同保護(hù)作用的基因連在一起列.用作口蹄疫基因疫苗的真核表達(dá)質(zhì)粒載體有多種，而研究者通常選擇PCDNA3.I系列.從結(jié)構(gòu)上看,pCDNA3.1具有大腸桿菌的Ori位點(diǎn)，使它能在原核細(xì)胞中進(jìn)行大量復(fù)制，因而目的基因可以隨宿主細(xì)胞的分裂跟隨胞漿遺傳給新生子細(xì)胞而保證目的基因的穩(wěn)定表達(dá)；它是一種高效的真核表達(dá)質(zhì)粒，含有T7多克隆位點(diǎn)，以便于外源基因插入；包含有高效增強(qiáng)子SV40,這種增強(qiáng)子是能促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染活性的調(diào)控元件,在目的基因前多克隆位點(diǎn)前裝有功能很強(qiáng)的基因啟動(dòng)結(jié)構(gòu)T7PCMV,這樣使得目的基因的表達(dá)得

9、以保證.3 FMDV基因疫苗的發(fā)展抗FMDVDNA疫苗的研究開(kāi)始于20世紀(jì)80年代末和20世紀(jì)90年代初【尬31).Wolff時(shí)等將質(zhì)粒DNA接種于小鼠肌肉，取得了較好的免疫效果.Ward時(shí)等首次將FMDV血清型A12的cDNA連接在真核表達(dá)質(zhì)粒載體上,轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后產(chǎn)生病毒粒子.Beard,54等人首次報(bào)道了FMD病毒基因疫苗免疫小鼠后能產(chǎn)生抗FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1的特異性抗體，用其免疫豬后也誘發(fā)了較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，證實(shí)了FMD病毒基因疫苗能引起特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)HuangH1351等，利用豬IgG序列融合蛋白基因構(gòu)建的基因疫苗，在不同的早、晚期啟動(dòng)子控制下，免疫豚鼠均均可誘導(dǎo)中和抗體

10、的產(chǎn)生和脾細(xì)胞的增殖.在口蹄疫基因疫苗的研究中，研究者們最初僅選擇編碼VP1表位的核酸區(qū)段進(jìn)行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表位所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間較短且表現(xiàn)很弱.WongNI等嘗試著克服這一點(diǎn)，將FMDVVP1140160和200213位氨基酸殘基編碼區(qū)基因同豬【gG的重鏈恒定區(qū)編碼基因相連，構(gòu)建了一個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒(pCElS),然后在小鼠(腹部)和豬(耳部、腿部)分別進(jìn)行免疫.免疫腹部的小鼠和免疫耳部的豬都產(chǎn)生了體液免疫和細(xì)胞免疫，并在攻毒中獲得全部保護(hù)，但在腿部進(jìn)行免疫的豬沒(méi)有被保護(hù).趙凱、陳光輝38】等首先缺失掉IgGH鏈基因中的抗原互補(bǔ)決定區(qū)(CDR3區(qū))，再將所剩兩個(gè)基因片段分別與質(zhì)粒pBlu

11、escript口SK(+)和質(zhì)粒pBluescriptHKS(+)相連接.其中與質(zhì)粒pBluescriptflSK(+)相連接的片段再與編碼FMDVVP1的141160和200213位禽基酸殘基所構(gòu)成的串聯(lián)片段相連接.然后將之前的片段和串聯(lián)片段切下與真核表達(dá)載體pET28b再次連接，構(gòu)建出新的表達(dá)質(zhì)粒pET28b-FH,將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，表達(dá)出64kD分子量的蛋白質(zhì).實(shí)驗(yàn)證明這種蛋白抗O型FMDV活性；將該種蛋白通過(guò)肌肉注射豚鼠和豬.在攻毒實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒pET28b-FH對(duì)豚鼠產(chǎn)生了保護(hù)作用;Benvenisti1281等將FMDV結(jié)構(gòu)基因Pl和非結(jié)構(gòu)基因2A、3CD進(jìn)行串聯(lián)后，再連接上腦

12、心肌炎病毒的核格體基因.通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了在機(jī)體外有病毒蛋白表達(dá)，再利用基因槍將產(chǎn)生的蛋白注射到豬皮膚中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分豬獲得了抵抗FMDV強(qiáng)毒攻擊的能力.隨著研究的進(jìn)行，一些學(xué)者開(kāi)始關(guān)注一些細(xì)胞因子的作用.比如IL-2、1L.1、IL-6、IL.15、IL9、IL-18、OX40L和4-IBBL(屬于TNF受體家族)，但只有IL-2和IL18在自然易感動(dòng)物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)刊.Wong等用400瞄pCEIS和400昭pCEIS-IL-2分別來(lái)免疫豬仲，所有組都產(chǎn)生了相同的B細(xì)胞免疫應(yīng)答，但是T細(xì)胞免疫在PCEIS-IL-2組較強(qiáng)，且這組中的所有豬都在攻毒中獲得全部保護(hù).以上早期研究中，盡管學(xué)者們所用的免疫

13、方案簡(jiǎn)單有效，但基因疫苗所產(chǎn)生的保護(hù)效率還很有限.Shieh1251將基因免疫與亞單位疫苗聯(lián)合起來(lái)進(jìn)行免疫，希望以此增強(qiáng)疫苗的免疫效果.首先用負(fù)載口蹄疫病毒基因VP1的質(zhì)粒免疫鼠，接下來(lái)用VP1多肽偶合物(P292KLH)加強(qiáng)，免疫后的小鼠產(chǎn)生高滴度的抗體.這些抗體具有中和口蹄疫病毒的活性.在Shieh的研究基礎(chǔ)上，Jin1451等改進(jìn)免疫方案，用FMDV基因疫苗進(jìn)行初次免疫后,FMDVVP1蛋白加強(qiáng)免疫，比較該種免疫方案和傳統(tǒng)基因疫苗方案的不同.結(jié)果顯示免疫后的小鼠和綿羊均獲得很強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫.人們發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)免疫、聯(lián)合免疫等方式都有刺激免疫增強(qiáng)的作用.基因疫苗中抗原肽的多樣性可能是部分

14、基因疫苗免疫效果不佳的原因所在，因此一些研究人員開(kāi)始研究針對(duì)B細(xì)胞和T細(xì)胞特定表位的FMDV基因疫.Zhang等研究了FMDV多種結(jié)構(gòu)表位組合的基因疫苗作用，包括FMDV的五個(gè)結(jié)構(gòu)位點(diǎn)：SG(sites1,2,4,3,5,VP1T-cellepitope);N4(sites1,2,5,1T-cellepitope);N51(sites2,3,4,VP1T-cellepitope);T51(sites2,5,VP1T-cellepitope);和51(sites1and5),以SG、N4和T51為抗原的基因疫苗能誘發(fā)顯著的抗FMDV和抗體和脾細(xì)胞增殖，表明基因疫苗中的抗原位點(diǎn)應(yīng)該來(lái)自VP1的1,

15、5區(qū)和T細(xì)胞表位.Guo,47)等研究在缺失其他免疫刺激物的情況下，將一種T細(xì)胞表位(位于非結(jié)構(gòu)蛋白3D上)的內(nèi)含物加入免疫，觀(guān)測(cè)其能否提高臨床保護(hù).用600昭包含VP1,2A和3C(pCDNA.3.1P12X3C)的質(zhì)粒DNA和1.5mg純化3D免疫豚鼠，結(jié)果都產(chǎn)生了細(xì)胞免疫，但所產(chǎn)生的抗體水平普遍較低.攻毒后，對(duì)豚鼠不能產(chǎn)生保護(hù).值得一提的是用不含3D的pCDNA.3.1P12X3C進(jìn)行免疫時(shí)，產(chǎn)生了較高的抗體水平和臨床保護(hù).進(jìn)入21世紀(jì)，人們開(kāi)始關(guān)注DNA疫苗的載體、如何更佳趨化免疫細(xì)胞、以及限制病毒復(fù)制等問(wèn)題.如果這些問(wèn)題得到很好的解決，將可以大大降低DNA的用量和它的潛在風(fēng)險(xiǎn).人們已

16、開(kāi)始嘗試在不同部位免疫、用PLG包裹DNA、陽(yáng)離子脂質(zhì)體、電穿孔法、佐劑等方法提高免疫效力.也有學(xué)者直接用免疫增強(qiáng)劑來(lái)提高FMDV基因疫苗的活力，包括tween80、丁哌卡因、BCG、C3d、殼聚精、板蘭根提取物、CD40等甄罰；盡管大部分佐劑被證明有加強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫的作用，但是到目前為止，這些佐劑還未在自然易感動(dòng)物中進(jìn)行測(cè)試，其潛力仍待探索.Niborski和Li等用PLG微粒，陽(yáng)離子微脂囊，明磯和羊的GM.CSF分別與CedilloBarron等使用的質(zhì)粒結(jié)合免疫研究其免疫效果阡叫同時(shí)他們也研究接種部位和劑量對(duì)免疫效果的影響.研究顯示，當(dāng)以1.2mgPLG微粒負(fù)載DNA皮注或肌注免疫

17、綿羊時(shí)，產(chǎn)生了最好的體液免疫和細(xì)胞免疫，在進(jìn)行天然氣溶膠攻毒時(shí)，綿羊獲得全部保護(hù).Li等發(fā)現(xiàn)，對(duì)羊進(jìn)行皮注和肌注結(jié)合免疫時(shí)產(chǎn)生了很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這是首次考慮由接種部位不同而產(chǎn)生不同的免疫效果，對(duì)今后評(píng)估基因疫苗的有效性具有重要啟示作用.Wang1541等探究使用包含多種疾病編碼基因的基因疫苗免疫能否提高免疫應(yīng)答.使用三種質(zhì)粒：含。型FMDV5個(gè)表位的質(zhì)粒，含偽狂犬病毒株(Ea)的gD基因的質(zhì)粒，豬高熱病病毒的E2基因的質(zhì)粒.分別以150昭DNA進(jìn)行電穿孔法免疫后都獲得了體液免疫和細(xì)胞免疫.但當(dāng)每種劑量減少到150熙再結(jié)合進(jìn)行免疫時(shí)，抗FMDV的體液免疫和細(xì)胞免疫被抑制.這啟示我們應(yīng)該仍需進(jìn)一步

18、研究抗FMDV的基因疫苗能否與其他疫苗一起使用.Lif551等用初免一加強(qiáng)法：先以1.2mgpcDNA3/P12A3C3D質(zhì)粒和800昭表達(dá)pGM-CSF的質(zhì)粒進(jìn)行初免,再以滅活146SFMDV抗原和重組3D蛋白構(gòu)建的結(jié)合蛋白來(lái)加強(qiáng)免疫.結(jié)果在豬上產(chǎn)生了中和抗體，并在攻毒中得到保護(hù).這次免疫中使用相對(duì)較高的DNA劑量和滅活的FMDV抗原進(jìn)行加強(qiáng).Borrego1561等將來(lái)自pCMV-BTT的表位同APCH1的單鏈可變區(qū)結(jié).Ganges等用pCMV-BTT和pCMV-spBTT分別免疫豬，并進(jìn)行攻毒.結(jié)果除了一只注射了pCMV-spBTT的豬檢測(cè)到抗體外，其余豬上均未檢測(cè)到中和抗體.Borre

19、go1571等按Ganges的方法使用相同DNA劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得了不同結(jié)果.在研究中，有兩只豬獲得全部保護(hù)，另有兩只獲得部分保護(hù)(臨床癥狀減輕).另外Ba*】將結(jié)構(gòu)基因PI和一種核酸依賴(lài)型RNA聚合蛋白D3進(jìn)行重組結(jié)合，構(gòu)建質(zhì)粒并免疫小鼠，結(jié)果獲得了相應(yīng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答.WangG【列等人用包含編碼FMDV衣殼蛋白和牛IL.6基因的陽(yáng)離子PLGA納米顆粒作為鼻內(nèi)載體免疫大鼠后，結(jié)果獲得較強(qiáng)的細(xì)胞免疫.4基因疫苗的應(yīng)用及展望基因疫苗相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗有很多優(yōu)點(diǎn)，比如不會(huì)發(fā)生活體病毒感染，不會(huì)對(duì)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生一些免疫反應(yīng)等，但用于實(shí)踐的疫苗還不多，主要是由于此類(lèi)新型疫苗的免疫原性較弱，需要大

20、量應(yīng)用或者急性重復(fù)注射.因此，研究人員采用了很多方法試圖來(lái)解決這些問(wèn)題，比如將多肽與T細(xì)胞表位或折B細(xì)胞表位連接，增加多肽拷貝數(shù)，增強(qiáng)疫苗在機(jī)體內(nèi)部的免疫反應(yīng)等I60叫.基因疫苗自研究以來(lái)始終伴隨著各種質(zhì)疑.例如基因有可能會(huì)整合到宿主的基因中，外源抗原的持續(xù)表達(dá)也許會(huì)產(chǎn)生不良后果，質(zhì)粒DNA上所攜帶的抗原基因不可進(jìn)行調(diào)控，質(zhì)粒DNA有可能會(huì)誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)等安全性問(wèn)題.但在目前實(shí)際研究中，還未發(fā)現(xiàn)上述可能情況，這也有可能是當(dāng)前的研究還未顯現(xiàn)其不安全的狀況.所以，疫苗的安全性仍是研究者們需要關(guān)注的重要方向.隨著對(duì)基因疫苗的研究越來(lái)越多，如何將科研與臨床應(yīng)用相結(jié)合，如何在實(shí)際中推廣，仍然面臨很多困

21、難.研究者們應(yīng)加強(qiáng)國(guó)內(nèi)外交流和溝通，取長(zhǎng)補(bǔ)短，促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展.參考文獻(xiàn)：1 王明俊.獸醫(yī)生物制品判M.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社、1997.2 SAMUELAR,KNOWLESNJ.Foot-and-mouthdiseasetypeOvirusesexhibitgeneticallyandgeographicallydistinctevolutionarylineagcs(topotypes)J.JGenVirol,2001,82:609-621.3 朱晶晶.魏玉榮，符子華.口蹄疫病毒VPI基因研究進(jìn)展J.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(7):75-78.4 DoelTR.FMDvaccines。.

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