破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基主要原材料的替代研究.docx

1、論著破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基主要原材料的替代研究曹玲，楊海珍,孫一玫，李國晏，謝澎蘭州生物制品研究所有限責任公司甘肅省疫苗工程技術研究中心，甘肅蘭州730046摘要：目的探索用干粉狀的肝浸粉、映骼腺、麻蹤代替?zhèn)鹘y(tǒng)破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基中使用的豬肝水透析外液、胰酶酪蛋白消化液、濃腺水,以滿足規(guī)模化生產(chǎn)的需求。方法與傳統(tǒng)的破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基同時用于破傷風類毒素的生產(chǎn)過程，由小批故生產(chǎn)逐步轉(zhuǎn)化到規(guī)?；谏a(chǎn),經(jīng)多批次試驗.以檢測不同組分制備的培養(yǎng)基各生化指標和接種細菌后培養(yǎng)的產(chǎn)毒水平進行比對。先確定肝汲粉可以取代豬肝水透析外液，在此基礎上徘選出代替濃豚水的脫豚，再以待用的胰酪豚配合肝浸粉、月示盼r制備

2、多批次不同生產(chǎn)量的破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基。結果經(jīng)過多批次小批擴大到批域規(guī)模化生產(chǎn)的試驗，用肝溪粉、胰酪豚、豚豚配制的破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基與傳統(tǒng)工藝制備的破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基相比較，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)o結論肝浸粉、胰酪腺、月示陳可以替代傳統(tǒng)破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基中的豬肝水透析外液、胰醐酪蛋白消化液、濃豚水.適用于破傷風類毒素的規(guī)模化生產(chǎn)。關鍵詞:培養(yǎng)基;破傷風梭狀芽胞桿菌;原材料中圖分類號：K378.8*!文獻標志碼：ADOI：10.13309/j.enki.pmi.2014.01.007ThereplacementofmainmaterialsforcultureofClostri

3、dium.tetaniinatoxinproductionmediumCAOling,YANGHai-zhen,SUNYi-mei,UGuo-yan,XIEPengLanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor:UGuo-yan,E-mail:1)6001Abstract:ObjectiveToexploreusingdrypowderedlive

4、rextractpowder,trypticase,andpeptoneasmainmaterials,itistheneedforlarge-scaleproduction,preparationwascarriedoutforthemediumproductionoftetanustoxininsteadofthetraditionalmediumcontainedliverextracellularfluid,trypsindigestiunofcaseinandconcentratedpeptonewater.MethodsThepreparedrnideaandthetraditio

5、nalmediawerex)山usedinproductionprocessoftetanustoxin,fromasimpleprocedure(oalargescalegradually,differentcomponentsoftheculturemediumwerechangedbythemulti-batchexperimentsandinoculatebacterialseeds,andculturedtoxinproductionlevelswereobtainedandcompared,sodidforindexofbiochemicalstandard.Firstly,ont

6、hebasisofthereplacementofliverextractpowdertotheextradialysisfluid,thenselectionpeptone(oreplaceconcentratedpeptonewaterwascarriedout.Incombinationofthesethreematerialsinatoxinproductionmedium,comparativetestswereperfonnedinbothofmedia.ResultsSeveraltestsarecompleted,fromasmallcapacitytoaproductionp

7、rocess,thebiochemistryindexesareobtainedinmediaaftercultivationofbacteria.Inpreparationoftoxin,themediumconlainedliverextractpowder,irj-pticaseandpeptonewascomparedtothetraditionalmedium,ithasnostatisticalsignificantdifference(P>0.05)inbothmedia.ConclusionsTheliverextractpowder,trypticase,andpept

8、onecanreplacetheliverextra-dialysisfluid,trypsindigestionofcaseinandconcentratedpeptonewaterinthetraditionalmediuminpreparationoftetanustoxininanindustrialproduction.Keywords:Medium,Clostridium,tetani,Rawmaterial破傷風梭狀芽胞桿菌(Clostridium,tetani,以下簡稱為破傷風桿菌)是一種革蘭陽性厭氧芽胞桿作者簡介：我玲，醫(yī)學生物學工程師，主要從事細詢性疫苗培養(yǎng)基配方選擇及制備

9、工作。通訊作者：李國晏.E-mail：S偵)01菌，是破傷風(Tetanus)的病原菌。它侵入傷口內(nèi)繁殖、分泌內(nèi)毒素旦引起急性的特異性感染，主要表現(xiàn)為全身或局部肌肉的持續(xù)性收縮和陣發(fā)性痙攣。1962年,Latham開發(fā)出了適合破傷風芽胞桿菌生長的半合成培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基含有胰酶消化酪蛋白，至今仍廣泛使用。目前使用的干酪素胰酶消化液(胰酪消化液）和牛肉胃酶消化液（濃腺水）為主的基礎液，是破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基的氮源主要原材料，配合使用的豬肝水透析外液是提供破傷風桿菌生長所需要的生長因子和微量元素。這些基礎液都是自制、以液體形式保存，每次制備費時費力、制備量有限，僅能滿足傳統(tǒng)玻璃立瓶培養(yǎng)的需要。隨著新

10、技術的開發(fā)應用，破傷風類毒素的需求量逐步急劇增加，迫使傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝發(fā)生改變，由玻璃立瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)酵罐培養(yǎng)，制備的一批基礎液難以滿足規(guī)模化連續(xù)批量發(fā)酵罐培養(yǎng)的要求。從2008年起，嘗試用新的原材料替代生產(chǎn)中原來使用的培養(yǎng)基組分。1材料與方法11材料20%胰酪消化液,濃豚水，豬肝水透析外液，胰酪K（OXOID,Solabia），月示豚（BD）,脫豚（NZP）,肉豚（NZP）,肉豚（美國），肝浸粉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，結晶乙酸鈉，硫酸鎂，葡萄糖，甘油，氯化高鐵,B族維生素（B】、B2、B6、BQ,尿嗟嚏,泛酸鈣，煙酸，無水乙醇，鹽酸，注射用水等。12儀器培養(yǎng)基制備罐（1200LJOOL）,發(fā)

11、酵罐（1200L、500L、300L）,玻璃立瓶，電子天平,pH計，量筒，量杯，吸管等。1.3方法131培養(yǎng)基的制備方法先在培養(yǎng)基制備罐中注入適量注射用水，根據(jù)破傷風培養(yǎng)基的氨基氮含量的要求,控制基礎液或主要原材料中的氮源，精確計算稱量后,加入培養(yǎng)基制備罐中，加熱并充分攪拌至完全溶解;逐一加入其他各項材料,充分攪拌均勻至完全溶解，調(diào)節(jié)pH值至所需，加熱煮沸，復調(diào)pH值至所需，補充注射用水至制備總量，攪拌均勻，過濾，濾液注入玻璃立瓶或發(fā)酵罐中，經(jīng)高壓滅菌后使用。L3.2破傷風產(chǎn)毒培養(yǎng)基的質(zhì)量檢測方法主要檢測項目為：氨基氮含量"】，總氮含量l21,pH值,Fe，,含量。1.3.3破傷風桿

12、菌產(chǎn)毒方法注入玻璃立瓶或發(fā)酵罐中經(jīng)高壓滅菌后的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)至所需溫度，接種破傷風桿菌，經(jīng)培養(yǎng)并檢測其產(chǎn)毒水平。1.3.4破傷風毒素的檢測方法按文獻5方法進行。1.3.5破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基中主要原材料的替換試驗破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基中肝浸粉替代豬肝水透析外液的試驗。在破傷風產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，豬肝水透析外液提供破傷風桿菌生長所需要的生長因子和微量元素，所起的作用比較容易用其他相似產(chǎn)品替代。首先將豬肝水透析外液用經(jīng)試驗后的肝浸粉替代，再對胰酪消化液和濃豚水做替換試驗。用胰酪消化液和濃豚水作基礎液，分別以豬肝水透析外液和肝浸粉制備培養(yǎng)基，在裝有培養(yǎng)基的玻璃立瓶和發(fā)酵罐中同時接種破傷風桿菌進行培養(yǎng)，與用豬肝

13、水透析外液和肝浸粉制備的培養(yǎng)基培養(yǎng)的破傷風桿菌產(chǎn)毒水平相比較,以探索肝浸粉能否替代豬肝水透析外液。破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基中豚豚的選擇和脈豚替代濃豚水的試驗。確定用肝浸粉代替豬肝水透析外液后，在保證培養(yǎng)基中其他組分不變及不加入濃豚水的條件下，使用商品化的干粉豚類產(chǎn)品制備培養(yǎng)基，同時接種破傷風桿菌進行培養(yǎng)。對待選的美國肉豚、NZP肉豚和脈肱X所配制的培養(yǎng)基進行生化檢測和破傷風桿菌產(chǎn)毒水平的分析，選擇其中可用的肱類產(chǎn)品。破傷風產(chǎn)毒培養(yǎng)基中胰酪肱代替胰酶酪蛋白消化液的試驗。選用某品牌的胰酪豚，以期代替自制的胰酶酪蛋白消化液。在其他組分不變時,配合不同的豚類產(chǎn)品，制備不同組別的破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基,同時接

14、種培養(yǎng)破傷風桿菌。對所配制的培養(yǎng)基進行生化檢測和破傷風桿菌產(chǎn)毒水平的分析，以確定所選用的胰酪腺能否可用于制備其細菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基,并確定配合使用最佳的豚類產(chǎn)品。主要原材料置換后小量破傷風產(chǎn)毒培養(yǎng)墓的生化檢測和其培養(yǎng)的產(chǎn)毒水平。用選定品牌的肝浸粉、胰酪腺、脈豚作主要原材料，配合培芥基中的其他組分，制備小量（54L）破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基以及與同期的傳統(tǒng)培養(yǎng)基（540L）,接種破傷風桿俯。檢測其培養(yǎng)基的生化指標和破傷風桿前的產(chǎn)毒水平。主要原材料置換后擴大制備量的破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基的生化檢測和其培養(yǎng)產(chǎn)毒水平。用選定的肝浸粉、胰酪豚、豚豚作主要原材料，配合培養(yǎng)基中的其他組分，制備500L破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)

15、基及同時生產(chǎn)傳統(tǒng)培養(yǎng)基540L,接種破傷風桿菌。檢測培養(yǎng)基的生化指標和其細筋產(chǎn)毒水平。2結果2.1破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基中肝浸粉替代豬肝水透析外液的試驗結果從表1中可以看出，組1和組3中相同菌種分別接種相同培養(yǎng)基的大罐和立瓶培養(yǎng)，由于兩種生長環(huán)境不同,大罐培養(yǎng)產(chǎn)毒水平高于立瓶;組2、組3用肝浸粉代替豬肝水透析外液進行立瓶培養(yǎng),產(chǎn)毒水平與組】用豬肝水透析外液作原料的培養(yǎng)后產(chǎn)毒差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；組3用肝浸粉代替豬肝水透析外液進行逐步放大量的大罐培養(yǎng),產(chǎn)毒水平與組1和組2用豬肝水透析外液作原料的培養(yǎng)后產(chǎn)毒差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。從以上數(shù)據(jù)中可以得出，在培養(yǎng)基的原材

16、料中，用肝浸粉可以替代自制的豬肝水透析外液。表1肝浸粉替代豬肝水透析外液的試驗結果Tab.!Replacementofliverextractpowdertopigliverextra-dialysisfluid組別制備域生產(chǎn)批次肝浸粉豬肝水透析外液產(chǎn)毒(x±s)(U/mL)1大瓶(60L)9無有45.00±15.81大罐(60L)18無有64.66±17.88大瓶(60L)12有無67.08±10.332大罐（60L）20無有91.32±14.51大瓶(60L)8有無52.50±10.61大罐（60L）8有無75.00±)

17、7.323大罐（120L）6有無68.23±18.37大碾(300L)6有無71.89±19.32大罐(700L)6有無81.67±17.592.2破傷風產(chǎn)毒培養(yǎng)基中豚腺的選擇試驗從表2中可以看出，不使用族類氮源的培養(yǎng)基，破傷風桿菌不產(chǎn)毒，在待選用的豚類中，美國肉豚較NZP肉腺和脈豚X,雖然生化檢測結果基本上無差異，但是單獨使用美國肉豚的培養(yǎng)基破傷風桿菌不產(chǎn)毒,NZP肉豚和脈豚X可用于進一步的試驗中。表2破傷風產(chǎn)毒培養(yǎng)基中脆豚的選擇試驗結果Tab.2Theresultsofpeptoneselectiontestsfortetanustoxinproduction

18、medium組別批次濃凍水豚類培養(yǎng)基生化檢測G）產(chǎn)毒G)(Lf/mL)TN(mg/mL)AN(mg/mL)PHFe”(|xg/mL)12無無0.120.086.930.06不產(chǎn)毒22有無1.890.837.030.4642.2134無美國肉豚2.210.897.010.48不產(chǎn)毒43無NZP肉豚2.340.876.930.6640.4653無脈豚X2.140.827.030.3641.672.3破傷風產(chǎn)毒培養(yǎng)基中胰酪蹤代替胰酪消化液的試驗試驗結果表明，未使用胰酪豚作氮源的培養(yǎng)基，破傷風桿菌不產(chǎn)毒，在待選用的胰酪豚中，二者的產(chǎn)毒水平差異無統(tǒng)計學意義（尸>0.05）。以待選用的兩種胰酪腺與胰

19、酪消化液分別制備培養(yǎng)基培養(yǎng)破傷風桿菌，產(chǎn)毒水平前者明顯高于后者。表明兩種待選用的胰酪豚都可替代胰酪消化液作為制備培養(yǎng)基的原材料，見表3。2.4主要原材料替代后小量破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基的生化檢測和其培養(yǎng)后的產(chǎn)毒水平試驗結果顯示,用選定的肝浸粉、胰酪豚和脈腌制備的小量培養(yǎng)基,及用傳統(tǒng)的豬肝水透析外液、胰酪消化液和濃豚水制備的培養(yǎng)基，經(jīng)生化檢測和其培養(yǎng)破傷風桿菌產(chǎn)毒水平的結果相比，二者差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）,見表4。2.5主要原材料替代后擴大破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基制備量的生化檢測和其培養(yǎng)的產(chǎn)毒水平從表5可以看出，在制備量擴大的情況下，用選定的肝浸粉、胰酪腺和廊豚的培養(yǎng)基及用傳統(tǒng)的豬肝水

20、透析培養(yǎng)破傷風桿菌產(chǎn)毒水平的結果相比，.二者差異無統(tǒng)外液、胰酪消化液和濃腺水培養(yǎng)基，經(jīng)生化檢測和其計學意義(P>0.05),可以用于破傷風桿萌的培養(yǎng)。衰3破傷風產(chǎn)毒培養(yǎng)基中胰骼豚的選擇試驗Tab.3TlieresultsofselectionIryplicasctestsfortetanustoxinproductionmedium組別批次胰潞消化液胰慌陳12X無28有無35無0X01D46無SolabiaTN(mg/mL)AN(mg/mL)pHFe"(成mL)0.120.086.930.06不產(chǎn)密2.480.847.010.7150.64*18.563.070.976.970

21、.1470.54±12.333.231.027.090.3668.85±16.15培養(yǎng)基生化檢測G)產(chǎn)毒G)表4小量破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基生化檢測和其培養(yǎng)后的產(chǎn)毒水平Tab.4Biochemicalindexesandlevelsofloxinpreparedinmediumcontainednewmaterialsinasmallscaleproduction原材料培養(yǎng)基生化檢測(*)產(chǎn)毒(*)制備批次,TN(mgZmL)AN(mg/mL)pHFe(g,g/mL)(II/tnL)傳統(tǒng)法制務的培養(yǎng)基下粉制備的培養(yǎng)基484.311.077.09I.1464.43±14

22、.86302.550.886.781.0560.00±11.35Tab.5Biochemicaldetectionandlevelsoftoxinpreparedinmediumcontainednewmaterialsinalargescaleproduction表5擴大的破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基生化檢測和其培養(yǎng)的產(chǎn)毒水平原材料.Q培養(yǎng)基生化檢測G)產(chǎn)毒(X)制備批次TN(mg/mL)AN(mg/mL)pHFe,*(p/mL)(U/mL)傳統(tǒng)法制備的培養(yǎng)基干粉制備的培養(yǎng)基484.381.117.050.8963.19±16.62483.420.946.940.9585.34&

23、#177;I3.733討論培養(yǎng)基是微生物生長所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)人工配制而成的一種混合基質(zhì)，用于培養(yǎng)和分離各種微生物,根據(jù)微生物種類和培養(yǎng)目的不同，培養(yǎng)基有不同的種類和制法。破傷風類毒素的生產(chǎn)培養(yǎng)基一般采用酪蛋白、牛肉等蛋白質(zhì)在較溫和的條件下加深水解后制成基礎液'6)。水解程度的深淺直接影響產(chǎn)毒的高低，蛋白水解液中的肽類是促進細榮產(chǎn)毒的主要物質(zhì)。有時補充牛心浸液。發(fā)酵舞培養(yǎng)的使用更進一步提高了破傷風類毒素的產(chǎn)最和質(zhì)最。傳統(tǒng)的破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基，一般含肉類(乳牛心浸液BHI)或乳類(酪蛋白消化液中的N-Z-CaseR或N-Z-CaseTTR)制品，其他還有葡萄糖、氨基酸、維生素、尿唆嚏

24、和無機鹽等。已經(jīng)證明，N-Z-CaseR或N-Z-CaseTTH對細菌生長是必需的。目前使用的下酪索胰酶消化液(胰酪消化液)和杓酶牛肉消化液(濃豚水)是作為破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基氮源的主要原材料，但是隨若生產(chǎn)規(guī)模的擴大，制作一批基礎液已經(jīng)不能保證生產(chǎn)的連續(xù)多批次使用。為解決上述問題，從2008年開始將破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基的主要原材料胰酪消化液、濃豚水、豬肝水透析外液用商品化的類似原材料代替。先保持胰酪消化液、濃豚水和其他組分不變，嘗試應用肝浸粉替代豬肝水透析外液，并從培養(yǎng)基制備量小(60L)逐步擴大到制備量為12()L、3()0L、700L各6批，通過生化檢測和破傷風桿菌產(chǎn)毒水平試撿，同時用豬肝

25、水透析外液的培養(yǎng)基接種破傷風桿菌的產(chǎn)毒水平進行對比，其結果顯示差異無統(tǒng)計學意義。因此，用肝浸粉可以替代豬肝水透析外液。接智嘗試應用胰酪蹤替代胰酪消化液制備破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基11批,試驗生產(chǎn)量為18L,同時以胰酪消化液和濃豚水為基礎液的培養(yǎng)基540L,對其生化指標質(zhì)量控制和接種破傷風桿菌的產(chǎn)毒情況進行了比較;2009年，用胰酪腺和不同的脈豚作試驗培養(yǎng)基，同時用胰酪消化液和濃豚水為基礎液的培養(yǎng)基540-670L,對質(zhì)量控制牛.化指標和細菌產(chǎn)毒情況進行了對比，選擇出一種口J用的腕豚以替代原來的濃豚水;2010年匕半年街種用培養(yǎng)基沿用傳統(tǒng)的原材料配制，試驗選用胰酪肱和所腺制備破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基制備

26、量54L30批次，同時使用胰酪消化液和濃豚水為基礎液進行質(zhì)M控制和破傷風桿菌產(chǎn)毒水平對比;2010年下半年菌種用培養(yǎng)基選用胰酪豚和豚腺，試驗選用胰酪豚和月示腺制備破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基,制備量依次為36、72.500和520L各3批次逐漸擴大，檢測培養(yǎng)基的質(zhì)量控制生化指標和產(chǎn)毒情況進行試驗，完成從小技到大量的原材料替代試驗。而2012年，選用的胰酪豚和脈豚替代傳統(tǒng)自制的胰酪消化液和濃豚水制備破傷風桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基，大罐制備量為500L共48批次,其培養(yǎng)基檢測的各項生化指標穩(wěn)定，產(chǎn)毒能力良好，表明肝浸粉、胰酪腺和脈腺替代傳統(tǒng)原材料制備的培養(yǎng)基易于生化指標的質(zhì)量控制，可適用于破傷風桿菌產(chǎn)毒規(guī)模化的生產(chǎn)

27、。參考文獻國家藥典委員會.中華人民共和國坊典（三部）（s.北京：中國醫(yī)藥科技出版社.2010：MA氮測定法：附錄33.1 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（三部）S?.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010：VIB蛋門質(zhì)測定法：附錄34-35.2 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（三部）S.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010；VApH值測定法:附錄25-26.國家藥典委員會.中華人民共和國街典（二部）SJ.北京：中國醫(yī)藥科技出版社.2010：llG鐵鹽檢查法:附錄57-58.5 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（三部）S.北京：中國醫(yī)藥科技出版tt.2010：XID類毒素絮狀單位測定法:附錄82.6 趙鎧,章以浩，李河民.醫(yī)學生物制品學S.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:697-7（）2.*7DemainAL.GersonDF,FangA.Effectivelevelsoftet