禽源性大腸桿菌HPI毒力島irp2基因PCR檢測方法的建立與應(yīng)用.docx

1、禽源性大腸桿菌HPI毒力島基因PCR檢測方法的建立與應(yīng)用王艷萍I%董林二郭時金挪，徐倩倩7,3,莫玲I,王金良劉吉山、沈志強(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600;2.山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心，山東濱州256600；3.山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司，山東濱州256600)抻:摘要:為了解臨床食源致病性大腸桿菌中高致病性毒力島(HighpathogenicityislandHPI)流行情況和基因特征，根據(jù):GmBank已知禽源砂基因序列，設(shè)計、合成一對特異性引物，建立irp2基因PCR檢測方法，優(yōu)化、確定PCR擴增特性，進行感性、特異性、重復(fù)性檢測評價。對256份臨床

2、分離禽源大腸桿菌進行訶2基因PCR檢測和基因遺傳變異分析。結(jié)果顯':示，移立的PCR檢測方法敏感性可達2.14x10"ng/皿;特異性顯示與雞沙門菌、副雞嗜血桿菌、鴨疫里默菌、禽巴氏桿菌、賄琴支原體、雞新城疫病毒、含流感病毒(H9N5)核酸均無交叉反應(yīng);重復(fù)性顯示3份陽柱樣品重復(fù)5次檢測，變異系數(shù)3.4%5.0%。256份臨床樣品PCR檢測郵基因，陽性率30.6%o獲得了9株分離株祁2基因序列，分析顯示，與GenBank已知基因同源性高達96.2%以上。說明建立的禽源大腸桿菌HPI毒力島irp2基因PCR檢測方法具有良好的特異性、枷性和重復(fù)性，可應(yīng)用于臨床致病性大腸桿菌毒力島

3、基因快速檢測。"如關(guān)詞:食源大腸桿菌；HPI;毒力島；打2基因文章分類號：S852.61*2文獻標志碼：A文章編號:0529-6005(2017)01-0086-04EstabUshmentandapplicationofPCRdetectionmethodforHPIirp2geneofavianEscherichiacoliWANGYan-ping1*23,DONGLin*,GUOShi-jin1*2,XUQian-qian123,MOLing*,WANGJin-liang1,LIUJi-shan,SHENZhi-qiang1(1.BinZhouanimalScienceandV

4、eterinaryMedicineinstitude,Binzhou256600,China；2.Shandong"tBinzhouResearchtdevelopmentandpromotioncenterforLivestockandpoultrypropolisvaccine,Binzhou256600,China；3.ShandongIvduanteAnimalMedicineCo.,Ltd,Binzhou256600,China)Abstract：HiepurposeofthispaperistoestablishthePCRdetectionmethodofirp2.To

5、understandtheclinicalpoultrypatho-.gameetcherichiacoliHighpathogenicityisland(HPI)prevalenceandgenetictraits,apairofspecificprimersweredesignedandsyn-tthesiaedaccordingtosequenceofirp2andthePCRdetectionmethodwasestablished,evaluationaboutoptimization,detenni-ningthePCRamplificationcharacteristics,se

6、nsitivity,specificityorandrepeatabilitywerestudied.Irp2genewasdetectedandgeneticvariationwasanalyedon256E.colistrainsisolatedfromclinicalavian.Resultsshowedthatthesensitivitywas2.14x104ng/皿：Specificitydisplayedthattherewasnocrossreactionbetweensalmonella,vicechickenhaemophilus,Riemerellaanatipestife

7、r,p6akiypasteurella,Mycoplasmagallisepticum,Newcastlediseasevirus,andavianinfluenzavirus(H9N5)；Repetitiveshowedthat,Mevariationcoefficientwas3.45.0%ifthreepositivesamplesrepeated5timestesting.Irp2genewasdetectedbyPCRfrom256oHnicalsamples,andpositiveratewas30.6%.Theanalysisof9strainirp2genesequencesr

8、evealedthatthehomologywasmorethan96.2%whencomparedwithGenbankknowngene.ThemethodofE.coliHPIirp2genePCRdetectionhasagoodspecificity,sensitivityandrepeatability,anditcanbeappliedtoclinicalgenerapiddetectionofHPI.Keywords：AvianEscherichiacoli；HPIpathogenicityisland；irp2geneCorrespondingauthor：SHENZhi-q

9、iang近年來畜禽大腸桿菌病嚴重影響著中國養(yǎng)禽收稿H期:2015-11-26基金項東省自然科學(xué)基金資助項目(ZR2014CQ012)作者簡介:王艷淳(1979-)女，助理研究員，碩士.從事中獸藥和畜禽細菌性疫病研究,E-mail:xiaowangjanping213通訊作者：沈志強，E-mail：1292986799®業(yè)的發(fā)展，雖然采取了強有力的防治措施，但由于大腸桿菌的變異性及耐藥性日益增強，依然沒有找到有效控制大腸桿菌病方法，于是專家們將焦點集中到了針對大腸桿菌的分子生物學(xué)研究上，期望通過對微觀的研究發(fā)現(xiàn)一些解決問題的線索，其中大腸桿菌高致病性毒力島(HPI)就是目前研究的重點之

10、一o1試驗材料1.1菌株來源試驗菌株：265株禽源大腸桿菌,分離自山東、江蘇、河南、安徽、河北、遼寧等地；大腸桿菌。2標準株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)教研室饋贈。1.2 試劑與主要儀器pMD18-T、DL.2000DNAMarker.DL-15000Marker、DNA聚合酶、10xPCRBufferJNTP.g白酶K、瓊脂糖等，購自寶生物工程（大連）有限公司;營養(yǎng)瓊脂，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;LP0021、LP0042,購自O(shè)XOIDLTD；細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、多功能DNA純化回收試劑盒（離心柱型），均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。2試驗方法2.1

11、引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中已發(fā)表的禽源大腸桿菌高致病性毒力島irP2基因序列，選取強保守性區(qū)段，設(shè)計如下特異性引物，用于切>2特異性序列PCR擴增，理論跨度約為521成。引物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行合成。表1心引物設(shè)計名稱序列起始位點片段長度PF-irp25-ATCGCTACCAGCCCTITG-3I542nt521ntPR-irp25-CTGTAGCGAGGCTTCTTC-32063nt2.2沐2基因PCR檢測方法建立2.2.1大腸桿菌。2菌株基因組DNA制備挑取單個菌落，接種LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10h后,10000r/min離心2min收集菌體，提取細菌基因組D

12、NA,具體操作按北京百泰克生物技術(shù)有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行。2.2.2 PCR擴增程序以制備的大腸桿菌O2DNA為模板，以PF-卻2、PR-祁2為引物進行PCR擴增,PCR體系：10xPCRBuffer2.5|iL,dNTP2.0>iL,PF-irp2/PR-irp21.0piL,DNA模板4.0piL,ddH2O14.04T叫05皿,總體系25.0叫,確定最佳PCR程序。2.3PCR檢測方法性能評價2.3.1敏感性檢測將制備的大腸桿菌0?模板DNA進行10倍比系列稀釋，測定各組份核酸含量，以不同稀釋度DNA為模板進行irp2基因PCR擴增，檢測其敏感性。2.3.2特

13、異性檢測分別提取雞沙門氏菌、副雞嗜血桿菌、鴨疫里默菌、禽巴士桿菌、雞毒支原體、雞新城疫病毒、禽流感病毒（H9N5）和禽源致病性大腸桿菌基因組DNA（其中新城疫和流感病毒提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA）。以制備的各類DNA為模板，進行irp2基因檢測，評價建立的檢測方法特異性。2.3.3重復(fù)性檢測用3株已知£甲2陽性禽源致病性大腸桿菌,2株已知irp2陰性禽源大腸桿菌，提取細菌基因組，每一樣品進行5次PCR檢測，檢測建立的檢測方法重復(fù)性。2.4禽源大腸桿菌毒力島卻2基因檢測應(yīng)用建立的PCR方法對265例2014-2015年間來自遼寧、山東、江蘇、河南、安徽、河北等地臨床分離的禽源性大腸桿菌

14、進行中2毒力島基因檢測。檢測病例病理剖檢多表現(xiàn)為大腸桿菌病特征性病變，大腸桿菌性敗血癥表現(xiàn)為纖維素性心包炎，肝臟有白色被膜、有纖維素性附著物，有時有白色壞死性結(jié)節(jié)，脾臟腫脹、充血;卵黃性腹膜炎及輸卵管炎、出血性腸炎,幼雛表現(xiàn)為臍帶炎等，個別產(chǎn)蛋雞癥狀不明顯等等。2.5沏2毒力島基因遺傳特性分析回收PCR檢測陽性樣品DNA,連接pMD18-T,轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)PCR和酶切鑒定后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。用Clustalx8.3、MEGA5.10軟件進行基因同源性及遺傳變異分析。3結(jié)果3.1irp2基因PCR擴增結(jié)果確定的PCR條件為：95X

15、.4min,94T1min,55T40s,72X.45s,30個循環(huán),72Y10min,4Y終止。大腸桿菌0?標準株DNA為模板經(jīng)PCR擴增后，產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，可看見大約521bp的特異性目的條帶（圖1）,與預(yù)期結(jié)果相符。回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)DNA序列測定分析，與已知的禽類大腸桿菌毒力基因irpl同源性在98.2%以上，說明建立的irp2基因PCR檢測方法可特異性擴增目的irp2基因。3.2敏感性檢測提取大腸桿菌O2DNA經(jīng)10倍比稀釋后取2.14x10'ng/|xL、2.14x10°ng/皿、2.14xl0_,ng/piL.2.14x10-2ng/»xL

16、、2.14x10-3ng/|xL、2.14x10-4ng/pX、2.14x10_5ng/jiL濃度DNA為模板進行PCR敏感性檢測，結(jié)果顯示，在2.14x10一4ng/jxL濃度以上檢測目的條帶清晰可見,2.14xIO、ng/皿濃度時檢測條帶出現(xiàn)模糊（圖2），確定建立的PCR檢測方法最高檢測敏感性為2.14x1()*ng/p.L圖1”莊基因PCR擴增結(jié)果圖4重復(fù)性試驗結(jié)果M：DNAMarkersDI.-2(XX)；I-5：R|性樣品I;610：陽性M2；11-15：陽性樣M3；16：陰性對照bp2000100075050025010013：腸釬倒標準株；4：性對照;M：I)NAMark

17、1;-rsl)l.-2(XX)13：腸釬倒標準株；4：性對照;M：I)NAMark«-rsl)l.-2(XX)20005212501001000750500bpM123456789圖2PCR敏感性檢測結(jié)果M：DXAlurkeiyI>1.-2(XX)；I8：2.14x10:.2.14xIO12.14xl()°、2.14xl"、2.14xIO'2.2.14x1()七2.14x10"*.2.14x105ng/|il.;9；陰性對照3.3特異性檢測待異性檢測結(jié)果顯示.僅以禽致病性大腸桿菌基因組為模板的PCR擴增呈陽性,在約521l)p有特異性目的條

18、帶，而以雞沙門氏菌、副雞嗜血桿慎、鴨疫里默菌、禽巴氏桿菌、雞毒支原體、雞新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸為模板,PCR擴增均無特異性條帶出現(xiàn)，說明建立的檢測方法待異性良好(圖3)。圖3PCR特異性檢測結(jié)果M：l)NMarkeisI)1.-2(XX)；I；沙門氏削；2：副雞嗜I。由信；3國疫果默|W：4：禽巴氏杵帽；5：雞獨支曉休：6：鳴新城疫利爆:7：肉流夠桐排(H9、5)；8：陰性對照；9：肉致病性大腸桿倘3.4幣：復(fù)性檢測3份陽性樣品、2份陰性樣品分別重夏5次檢測.PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后,3份陽性樣品檢測結(jié)果見圖4,薄層灰度分析顯示陽性樣品變異系數(shù)在3.4%5.00,陰性樣品5次

19、i(其均為陰性結(jié)果，說明建立的PCR檢測方法站復(fù)性良好。3.5臨床樣品檢測應(yīng)用應(yīng)用建立的PCR方法檢測了臨床病例,結(jié)果irP2RI性數(shù)81份.陽性率為3().6%.不同地域、不同宿主來源對毒力島基因無明顯區(qū)另I勿2陽性樣品PCR產(chǎn)物.電泳檢測均出現(xiàn)約521bp特異性11的條帶(圖5),說明建立的檢測方法具有良好的臨床實用性圖5部分臨床樣品檢測結(jié)果I-I2：|引性樣品結(jié)果;13：陰性結(jié)果；14：HltHI照：IS：陽性對照:1：I)WMarkris1)1.-2(MX)3.6同源性分析茯得9株禽致病性大腸桿萌旋力島irpl基因序列，經(jīng)Clustalx8.3、MEGA5.1()軟件進行基因同源性.結(jié)

20、果顯示，其與GenBank中2知堆因同源性高達96.2%以上，顯示其在遺傳進化保守性較強遺傳進化分析，顯示不同分離株irP2基因。在差異性,分屬不同基因分存，同源性fl'S的毒株間存在相似基因序列特征變異(圖6)4討論隨若養(yǎng)殖方式和規(guī)模不斷變化,細削性疾病,特別是由大腸桿禪病導(dǎo)致的損失.在禽類養(yǎng)殖中愈顯幣:要.同時，由于抗生索在芥殖中濫用致臨床大腸桿幽變異性和耐藥性日益增強，使得現(xiàn)右防控r-段和技術(shù)不能有效應(yīng)對威脅因此，開展大腸桿菌相關(guān)毒力因*研究，從微觀分子水平探索其致病機圖6，碑基因遺傳進化分析結(jié)果iq>2-3/4/6Z8/9/12/14/20/21標弓為自己分離株，力，2糖

21、因序列；其他標砂為(n-nBunk中已知序列理對臨床大腸桿倘病的預(yù)防和治療具有一定現(xiàn)實意義。大腸桿偏高致病性毒力島(HP1)作為頁要:致病因子，在E,coli致病過程中發(fā)揮作用。irP2作為鐵調(diào)節(jié).蛋白，是檢測毒力島的標志基因。本試騎針對毒力島標志毒力因子訶，2在肉致病性大腸桿前中的基因分布特征和遺傳變異進行相關(guān)研究。建立了快速、特異、靈敏和可甫0的ir2基因PCR檢測方法，對265份臨床肉源致病性大腸桿菌進行irp2進行檢測，陽性率30.6%(81/265),這與Schubert"(27%)結(jié)果一致，高于張冬梅(14%)和陳偉13(21.6%),低于許麗*的(44%)和王蕤成的(4

22、7.8%)。這訶能與臨床樣品選取及流行潭株區(qū)域差異性有定相關(guān)性。獲得了9株禽致病性大腸桿菌HP!irp2基因序列，與GenBank中參考廊株基因同源性高達96.2%以上，顯示irP2基因在不同潭株間具有很高的保守性，這與玳炳敏(97%)和程伯爆(95.5%)等報道的同源性結(jié)果一致Jrp2等花力島基因A度保守性可能與其在不同宿主菌株間的水平轉(zhuǎn)移仃關(guān)，具體原因有待進一步研究。參考文獻：1 憂籀.FK506萌株堆因組尺度代謝通ht分析指導(dǎo)下HJ級和次級途徑改造：0.天津：天津大學(xué)化工學(xué)院.2013.2 邵獨，涂健.汪雪雁.APEC強)力島核心基因"fyuA敲除對JI致病性影響的研究J.中國

23、獸,學(xué)報.2014.34(4)：564-570.3DeAlmeidaAM,GuiyouleA,GuilvoulI.elal.Chronni-somulirp2grnrinYentitiia:distributionexpressiondeletionandini|Hielonvirukncr(J).MicmliialPathofrneNs.1993.14(1)：9-21.4CamirlE,Guiyoule*A,Meiferrau-Puijalon0,efal.Chromo-somalmarkerforlhe"high|Nilh<»geni<*il>'

24、;*pheno-lypt*inYrrsin-iaJ.ContributionstoMi<-n>biol<>g)umlImmunology.1991,12：192-197.5,PR<l<>NaM'imrnto.Ass<x-iati<>iiofPro-InflainnuiloryCylokiiifsandImuRegulatory-2(IRI2)with【"KhtnaniaBinxlfiiinCanineVisceralb-ishmaniusisJ'.PiosOne.2013.8(10)：6565.6WangWr

25、i.Ih-ngZhiyong,HalclwrHratlirr.ctal.IRI,2n-gu-latcslin'asitumorgrowthJ.CuncrrRm,2013Jan15；74(2)：497-507.7Ma(r<*llon<*(uinnen.(lhen(aiolnia,l)n»z<l<tvIgnal,clal.Tiiniori-grni«,pn>|MTticsofin»in*gulalonpnilein2(IIU,2)iiM,<liat<,<lbyitsspreim73-aminoa<i<Uii)M>rtJ.PLoSONE.2010.5(4)：l-ll.8程伯短，葉R罷.伍建宏.等.腸產(chǎn)志祝祥尚素的大腸肝俏帽株中小腸結(jié)腸炎耶爾女IW力島基因切2的檢測J.中華微生物學(xué)與免佼學(xué)雜志.2000.20(6)：489-492.9擁山,E意銀.朱瓊帔.等.陰溝腸HlWlW株中攜帶小腸結(jié)腸炎耶爾探倘推力島irp-2基因的檢測J.中國衛(wèi)生檢於雜志.2011.21(6):1317-1321.10Schu