嗜酸細(xì)胞凋亡在激素抵抗型哮喘中的意義

1、嗜酸細(xì)胞凋亡在激素抵抗型哮喘中的意義【摘要】目的觀察激素抵抗型（SR）哮喘是否存在嗜酸細(xì)胞（EOS）凋亡功能的異常及促炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素5（IL-5）和粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的調(diào)節(jié)作用。方法分離SR（15例）、激素敏感型（SS，30例）兩組哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）及EOS，體外培養(yǎng)后測(cè)定：（1）PBMCs在糖皮質(zhì)激素處理前、后分泌細(xì)胞因子的能力；（2）自發(fā)的或糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的或用PBMCs培養(yǎng)上液處理后的EOS凋亡率及Fas抗原表達(dá)率。結(jié)果（1） 糖皮質(zhì)激素處理前SS組與SR組患者PBMCs分泌IL-5水平（g/L）分別為19668、23598；GM-CSF

2、分泌水平（g/L）SS組和SR組患者分別為325110、356131，兩組比較差異均無顯著性（P0.05）。地塞米松處理后與處理前比較，SR組IL-5水平為（21075）g/L，差異有顯著性（P0.01）；SS組IL-5為（14762） g/L，差異有顯著性（P0.01），GM-CSF為（27097）g/L，差異有顯著性（P0.05）。（2）SS組與SR組EOS在體外培養(yǎng)時(shí)均發(fā)生不同程度的凋亡。EOS基礎(chǔ)凋亡率SS組為（6721）%，SR組為（3317）%，兩組與誘導(dǎo)前比較差異有顯著性（P0.001）。Fas抗原表達(dá)率SS組為（5423）%，SR組為（2715）%，兩組比較差異有顯著性（P0.

3、001）。地塞米松誘導(dǎo)后，SS組凋亡率為（8920）%，與誘導(dǎo)前比較差異有顯著性（P0.1）。SR組EOS誘導(dǎo)凋亡率和Fas表達(dá)率分別為（4118）%、（3513）%，與誘導(dǎo)前比較差異無顯著性（P均0.1）。同一患者的PBMCs培養(yǎng)上液可對(duì)抗地塞米松誘導(dǎo)EOS凋亡的作用，以SR組更為明顯。結(jié)論SR患者的EOS存在自身凋亡功能的缺陷并對(duì)激素誘導(dǎo)凋亡作用不敏感，同時(shí)Th2細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子的活性不能為激素所抑制，是EOS凋亡不足的另一原因。【關(guān)鍵詞】哮喘；嗜酸細(xì)胞凋亡；激素抵抗Effect of eosinophil apoptosis on glucocorticoid-resistant

4、asthmaLIU Chuntao, WANG Zengli, XIE Min, et al.(Division of Respiratory Medicine, The First Hospital of West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the function of eosinophil apoptosis and regulation of glucocortico steroids on IL-5 and GM-CSF e

5、xpression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in glucocorticoid-resistant asthmatic patients. MethodsEosinophils (EOS) and PBMCs isolated from glucocorticoid-sensitive (SS, 15 cases) and resistant (SR, 30 cases) asthmatic subjects were cultured and treated with dexamethasone (DXM) in vitro

6、. Concentrations of IL-5 and GM-CSF were determined by ELISA in the supernatants recovered in sham and DXM treated cells. The rates of EOS apoptosis and Fas antigen expression were documented via flow cytometer in sham, DXM treated and PBMC supernatant treated groups respectively. ResultsThere were

7、no statistical significant differences of the concentrations of both IL-5 and GM-CSF in sham cultured PBMC supernatants between SS and SR groups (19668) g/L vs. (23598 ) g/L IL-5 (P0.05), (325110) g/L vs. (356131) g/L GM-CSF (P0.05); SS versus SR groups, respectively. There were statistically signif

8、icant decreases in both IL-5 and GM-CSF after DXM exposure in SS group (19668) g/L vs. (14762) g/L IL-5 (P0.01); (325110) g/L vs.(27097) g/L GM-CSF (P0.01). In contrast, there were no significant differences in both IL-5 and GM-CSF after DXM exposure in SR group. Baseline rates of both EOS apoptosis

9、 and Fas antigen expression were statistically significant different between SS and SR groups (6721)% vs. (3317)% the rate of EOS apoptosis (P0.001); (5423)% vs.(2715)% the rate of Fas antigen expression (P0.001), SS versus SR groups, respectively. A dramatic increase in EOS apoptosis after DXM expo

10、sure was observed in SS group (6721)% vs. (8920)% (P90%，臺(tái)盼藍(lán)拒染法細(xì)胞活力95。細(xì)胞濃度調(diào)整為1105/ml。2.PBMC體外培養(yǎng)及細(xì)胞因子檢測(cè)：PBMC以無血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌，制成細(xì)胞懸液，置96孔培養(yǎng)板，每份2孔，每孔細(xì)胞數(shù)1105 ml，加入植物血凝素（PHA）終濃度為50 mg/L，其中1孔加入地塞米松（DXM，美國Sigma公司），終濃度為10-6mol/L，孵育24 h（37 ，5 CO2），吸取上液，以IL-5、GM-CSF ELISA試劑盒測(cè)定IL-5和GM-CSF濃度。3.EOS體外培養(yǎng)：EOS以無血清R

11、PMI 1640液洗滌。制成細(xì)胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度為每孔104 ml，每一受試者分為3孔，其中2孔分別加入：（1）DXM，終濃度為10-6mol/L；（2）DXM（10-6mol/L）+同一受試者PBMC培養(yǎng)上液10 l。體外孵育72 h（條件同上）。4.EOS凋亡率與Fas抗原檢測(cè)：取70 孔徑尼龍篩網(wǎng)過濾孵育EOS，濾過液低速離心1 000 r/min，3 min，去上清；調(diào)整細(xì)胞濃度為104/ml，加入CD95-FITC10U，按操作程序在室溫避光孵育15 min后，加入5 ml PBS緩沖液離心洗滌，去上清。細(xì)胞固定打孔；經(jīng)以上步驟處理的細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式上機(jī)試管，加入1 m

12、l PI工作液作DNA染色，15 min后上機(jī)檢測(cè)；由流式細(xì)胞儀專用數(shù)據(jù)分析軟件（Elitee）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。凋亡細(xì)胞與CD95（Fas）陽性細(xì)胞分別以占總細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)采用s表示，用SPSS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。結(jié)果一、 SS組與SR組哮喘患者PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子水平的差異我們的試驗(yàn)顯示，哮喘患者PBMC可在體外培養(yǎng)時(shí)分泌兩種主要的促炎癥細(xì)胞因子IL-5和GM-CSF，其基礎(chǔ)分泌水平SR組較SS組患者略高，但二者比較差異無顯著性（P0.05）。預(yù)先在培養(yǎng)液中加入DXM，對(duì)SR組患者的PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子有輕度影響，與基礎(chǔ)水平比較差異無顯著性（P0.05），但可顯著地使

13、SS組PBMC產(chǎn)生的細(xì)胞因子濃度明顯下降，提示激素抑制PBMC的作用在SS型哮喘較SR型哮喘敏感（表1）。表1各組PBMC培養(yǎng)上液細(xì)胞因子濃度（s）組別例數(shù)IL-5（g/L）P值GM-CSF（g/L）P值SS組3019668325110SSDXM組30147620.01*270970.05*2561310.05*SRDXM組15210750.1*3121470.05*注： 與自發(fā)分泌比較*P0.05 二、EOS凋亡與激素抵抗的關(guān)系體外培養(yǎng)72 h后，SS組與SR組患者的EOS均發(fā)生不同程度的凋亡。SS組表現(xiàn)較高的基礎(chǔ)凋亡率為6721和Fas抗原表達(dá)率為5423，與SR組（3317，2715）比

14、較差異有顯著性（P均0.001），若用DXM誘導(dǎo)，凋亡率進(jìn)一步升高（8920，與自發(fā)凋亡率比較（P0.1）。SR組不僅EOS自發(fā)凋亡率和Fas表達(dá)率較低，且用地塞米松誘導(dǎo)后凋亡的水平變化較小（4118，3513），與誘導(dǎo)前比較差異無顯著性（P均0.1）。加入同一個(gè)體的PBMC培養(yǎng)上液與地塞米松共同培養(yǎng)，可使凋亡率和Fas表達(dá)率降低，顯示PBMC培養(yǎng)上液有對(duì)抗地塞米松誘導(dǎo)EOS凋亡的作用，但僅SS組Fas表達(dá)率和SR組凋亡率的降低與單獨(dú)用地塞米松比較差異有顯著性（P0.05及0.001，表2）。討論目前已經(jīng)明確EOS是參與哮喘氣道炎癥最主要的效應(yīng)細(xì)胞， EOS募集入肺并釋放損傷性介質(zhì)是氣道炎癥的

15、中心環(huán)節(jié)。近年發(fā)現(xiàn)EOS可在氣道局部發(fā)生凋亡,凋亡時(shí)形成的凋亡小體被巨噬細(xì)胞吞噬，無內(nèi)容物外溢，不觸發(fā)炎癥反應(yīng)，因此EOS凋亡是氣道炎癥消退的有效途徑，而局部凋亡-抗調(diào)亡機(jī)制失衡是氣道炎癥發(fā)展、持續(xù)的重要因素。一般認(rèn)為哮喘氣道炎癥時(shí)凋亡機(jī)制異常可能表現(xiàn)為凋亡不足或凋亡延遲。如錢桂生等4報(bào)道，哮喘組EOS凋亡率為（2.11.3）%，而對(duì)照組為（10.13.4）%，并推測(cè)凋亡抑制基因Bcl-2和白細(xì)胞介素1 轉(zhuǎn)化酶（ICE）過度表達(dá)可能是哮喘氣道EOS凋亡不足的原因之一。有證據(jù)表明，GC抑制氣道炎癥的作用部分來自其誘導(dǎo)EOS及其它炎性細(xì)胞凋亡的活性。Wolley等5在1996年首次證實(shí)，GC治療可

16、使哮喘患者臨床癥狀改善，氣道中EOS明顯減少，凋亡率明顯增加，并被巨噬細(xì)胞所吞噬。GC通過誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生Fas而誘導(dǎo)EOS凋亡。近期國內(nèi)亦有數(shù)項(xiàng)研究涉及GC對(duì)EOS凋亡的影響，如歐陽能太等6發(fā)現(xiàn)，DXM處理后的哮喘豚鼠，其氣道中淋巴細(xì)胞（CD+4）減少，原因之一在于淋巴細(xì)胞凋亡增加。周向東等7則報(bào)道，在體外培養(yǎng)中，哮喘患者外周血分離的多形核白細(xì)胞(PMN)、EOS、T淋巴細(xì)胞（TLC）凋亡延遲，顯示處于凋亡抑制狀態(tài)，而加入GC于培養(yǎng)基中，可顯著增加EOS和TLC的凋亡，但卻抑制PMN的凋亡，顯示GC對(duì)肺部炎性效應(yīng)細(xì)胞凋亡作用有一定異質(zhì)性。GC對(duì)EOS凋亡的影響可能通過兩個(gè)途徑：（1）阻斷

17、Th2 CK基因的表達(dá)，使支持EOS存活的IL-3、IL-5、GM-CSF產(chǎn)生減少；（2）可能參與凋亡基因與受體的調(diào)節(jié)，如加強(qiáng)抗Fas單抗活性，活化EOS表面Fas等。表2各組EOS凋亡率與Fas表達(dá)水平（%，s）組別例數(shù)自發(fā)DXM誘導(dǎo)DXM+PBMC上液凋亡率Fas表達(dá)率凋亡率Fas表達(dá)率凋亡率Fas表達(dá)率SS組30672154238920601772284821SR組15331727154118535132712189激素抵抗型哮喘屬于哮喘的一種少見的特殊類型，關(guān)于其診斷標(biāo)準(zhǔn)目前尚未取得一致意見，通常的定義為在保證依從性前提下，規(guī)則口服潑尼松每天40 mg，療程2周，其FEV1占預(yù)計(jì)值%（

18、75%）的改善15%1。但亦有作者提出異議，認(rèn)為每天40 mg的劑量過大，對(duì)患者有一定的危險(xiǎn)性，對(duì)中國人而言劑量尤嫌偏大。故國內(nèi)孫永昌等8提出的修訂標(biāo)準(zhǔn)所采用的給藥方案為口服潑尼松每天20 mg，療程7 d，我們亦采用此一方案。現(xiàn)有資料顯示，哮喘時(shí)存在EOS凋亡延遲，而糖皮質(zhì)激素的抗炎平喘作用可能與其誘導(dǎo)EOS及淋巴細(xì)胞凋亡有關(guān)，但對(duì)于哮喘中的激素抵抗現(xiàn)象是否與凋亡有關(guān)，目前尚缺乏重視。我們的試驗(yàn)證實(shí)，SS和SR組患者的EOS均可在體外培養(yǎng)時(shí)自發(fā)地凋亡并表達(dá)凋亡基因相關(guān)產(chǎn)物Fas抗原，而SR組患者的凋亡水平明顯高于SS組，提示激素抵抗時(shí)存在EOS凋亡功能的低下。激素在體外培養(yǎng)時(shí)可顯著誘導(dǎo)SS組

19、患者的EOS凋亡，而對(duì)SR組患者EOS凋亡水平影響甚微，進(jìn)一步說明激素抵抗的機(jī)制可能涉及EOS對(duì)激素誘導(dǎo)凋亡的不敏感。分析其原因可能有：（1）凋亡受到相關(guān)基因的控制，F(xiàn)as/APO-1是主要的凋亡促進(jìn)基因，編碼的膜蛋白Fas/APO-1抗原激活后可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2據(jù)認(rèn)為是主要的凋亡抑制基因。正?；蛳瓡r(shí)氣道與外周血EOS表面均可表達(dá)Fas/APO-1（CD95）。Druithe等9發(fā)現(xiàn)，EOS在培養(yǎng)后4872 h 后，EOS表面更易于測(cè)出CD95，但以培養(yǎng)612 h的EOS對(duì)抗Fas誘導(dǎo)的凋亡更為敏感。我們的試驗(yàn)顯示，SR組自發(fā)的與激素誘導(dǎo)的EOS表面Fas抗原表達(dá)率均低于SS組，提

20、示激素抵抗時(shí)EOS凋亡不足與Fas基因表達(dá)缺陷有關(guān)。因未測(cè)定Bcl-2抗原，故不能確定是否有凋亡抑制基因的異常；（2）炎癥局部產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其它介質(zhì)，在調(diào)控EOS凋亡中亦發(fā)揮重要的作用。Th2型CK包括IL-5、GM-CSF、IL-3不僅對(duì)EOS有趨化與功能活化作用，大量實(shí)驗(yàn)證明，亦是主要的EOS存活維持因子，即主要的抗凋亡因子。卵蛋白(OVA)致喘小鼠的EOS在體外培養(yǎng)時(shí)，若無IL-5或GM-CSF支持，在72 h幾乎全部凋亡，培養(yǎng)液中IL-3，IL-5或GM-CSF與維持EOS活力（抗凋亡）效應(yīng)之間存在濃度依賴關(guān)系10。我們發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可在體外培養(yǎng)時(shí)顯著抑制SS患者的PBMC（以淋巴

21、細(xì)胞為主）在體外培養(yǎng)時(shí)釋放IL-5和GM-CSF的能力，分析其機(jī)制除與激素直接抑制細(xì)胞因子的合成有關(guān)以外，亦可能與其誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡有關(guān)。這一結(jié)果與孫永昌等8所觀察到激素對(duì)SR患者T細(xì)胞增殖的抑制作用顯著低于SS患者的現(xiàn)象吻合。激素對(duì)SR組患者的PBMC在體外分泌促炎癥細(xì)胞因子的活性影響較小，反映出較高水平的Th2細(xì)胞來源的細(xì)胞因子對(duì)EOS的生長支持作用，是EOS凋亡不足的另一原因。同一個(gè)體的PBMC培養(yǎng)上液（含有上述細(xì)胞因子）可使EOS的凋亡率更為低下，并加強(qiáng)對(duì)激素誘導(dǎo)凋亡的抵抗，進(jìn)一步反映出促炎癥細(xì)胞因子對(duì)EOS凋亡的影響。從我們的試驗(yàn)可以得出如下結(jié)論：（1）糖皮質(zhì)激素抵抗患者的EOS存在

22、自身凋亡功能的缺陷；（2）此類患者同時(shí)存在Th2細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子的活性不能為激素所抑制，是EOS凋亡不足的另一原因。進(jìn)一步研究激素與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，有助于深入了解激素抵抗這一特殊的臨床現(xiàn)象，并為臨床治療提供指導(dǎo)，或作為臨床診斷SR型哮喘的輔助指標(biāo)。已發(fā)現(xiàn)某些藥物如茶堿、大環(huán)內(nèi)脂類抗生素與環(huán)孢素A可誘導(dǎo)EOS凋亡，且環(huán)孢素A對(duì)某些糖皮質(zhì)激素抵抗型哮喘亦有較好療效，故增加EOS凋亡的途徑，可能是針對(duì)激素抵抗型哮喘的可行的選擇。 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（39570329）作者單位：劉春濤(610041 成都，華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科)王曾禮(610041 成都，華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科)謝敏(610041 成都，華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科)袁益明(610041 成都，華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科)參考文獻(xiàn)1.Stephen JL, Tak HL. Glucocorticoid-resistant asthma. Stephen T Holgate，ed. Difficult asthma. London: Martin Dunitz, 1999. 389.2.中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組. 支氣管哮喘防治指南（支氣管哮喘定義、診斷、治療、療效判定標(biāo)準(zhǔn)及教育和管理方案）.中華結(jié)核和呼吸雜志, 1997,